JP7299309B2 - 抗ヒト心筋型トロポニンｉ組換え抗体 - Google Patents

抗ヒト心筋型トロポニンｉ組換え抗体 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
この開示は、２０１８年１０月１０日に中国特許庁に出願された「抗ヒト心筋型トロポニンＩ組換え抗体」と題された出願第２０１８１１１７９５１２．３号の優先権を主張し、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、免疫学的技術の分野、特に抗ヒト心筋型トロポニンＩ組換え抗体に関する。
１９８０年代以前は、心臓酵素プロファイルの活性は、世界保健機関（ＷＨＯ）によって、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の診断基準の１つと常に見なされてきた。１９８０年代の終わりに、研究者はトロポニン（ｔｒｏｐｏｎｉｎ， Ｔｎ）がホスホクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ホスホクレアチンキナーゼ－ＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなどのバイオマーカーよりも高い感度と特異性を持っていることを発見した。心筋にのみ存在する心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は心筋細胞のマーカーであり、その異常な変化は心臓の拡張機能と収縮機能に影響を与える可能性がある。またｃＴｎＩは、心筋壊死の診断、心筋損傷の判定などに使用でき、心筋細胞損傷の最も感度と特異性が高いマーカーの１つになっている。ｃＴｎＩは、ＡＭＩおよび急性冠症候群（ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＣＳ）の迅速な診断、およびＡＣＳのリスク層別化を支援し、その予後を反映するための主要な生化学的マーカーとして認識されている。
一般的に、正常な人の血液中のｃＴｎＩの含有量は０．３μｇ／Ｌ未満である。虚血または低酸素などにより心筋細胞膜の完全性が損なわれると、遊離のｃＴｎＩが細胞膜を急速に透過して血流に入ることができる。したがって、発症初期のヒト血液にあるｃＴｎＩとその変動傾向を迅速に、高感度に、正確に測定することは、急性心筋梗塞の診断、急性冠症候群のリスク層別化、さまざまな原因による心筋損傷のモニタリングなどに臨床的に重要である。ｃＴｎＩレベルを臨床的に検出するために使用される方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光、金コロイドなどがある。さまざまな方法にはそれぞれ長所と短所があるが、すべてｃＴｎＩに対する特定のモノクローナル抗体が必要である。
既存のｃＴｎＩ抗体は、活性が低く親和性が低いため、ｃＴｎＩタンパク質の検出にうまく適用できない。したがって、当技術分野では、ｃＴｎＩに効果的かつ特異的に結合し、さらに検出する抗体に対する強い需要がある。
本開示は、心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原結合ドメインを含む新規の単離された結合タンパク質に関するものであり、該結合タンパク質の調製および使用などが研究された。
上記抗原結合ドメインは、少なくとも１つ以下のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含むか、または以下のアミノ酸配列を有する相補性決定領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、さらに心筋型トロポニンＩに対してＫＤ≦１．４１×１０－９ｍｏｌ／Ｌである親和性を有するものである：
Ｇ－Ｆ－Ｎ－Ｘ１－Ｋ－Ｘ２－Ｙ－Ｘ３－Ｍ－Ｈの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１、ここで
Ｘ１はＬまたはＩ、Ｘ２はＤまたはＥ、Ｘ３はＦまたはＹである；
Ｒ－Ｉ－Ｘ１－Ｐ－Ｅ－Ｄ－Ｘ２－Ｅ－Ｔ－Ｘ３－Ｙ－Ａ－Ｐ－Ｅの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２、ここで
Ｘ１はＥまたはＤ、Ｘ２はＡまたはＧ、Ｘ３はＲまたはＫである；
Ｙ－Ｙ－Ｘ１－Ｓ－Ｙ－Ｘ２－Ｐ－Ｆ－Ｖ－Ｙの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３、ここで
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＩ、Ｌ、またはＶである；
Ｑ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｙ－Ｓ－Ｎ－Ｘ３－Ｈ－Ｔ－Ｙの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１、ここで
Ｘ１はＩまたはＬ、Ｘ２はＩまたはＬ、Ｘ３はＲまたはＫである；
Ｑ－Ｘ１－Ｓ－Ｘ２－Ｒ－Ｆ－Ｓの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２、ここで
Ｘ１はＩ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ２はＮまたはＱである；
Ｓ－Ｘ１－Ｓ－Ｔ－Ｈ－Ｘ２－Ｐ－Ｘ３－Ｔの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３、ここで
Ｘ１はＱまたはＮ、Ｘ２はＬまたはＩ、Ｘ３はＦまたはＹである。
重要な利点は、結合タンパク質が強い活性とヒトｃＴｎＩタンパク質に対して高い親和性を持っていることである。
１つまたは複数の実施形態では、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＤである；
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＤである；
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＳである；
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＲである；
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＮである；
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ１はＱである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＦである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＹである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＡである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＧである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＲである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＫである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＶである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１は
Ｉである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＶである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ２はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ２はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ３はＦである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ３はＹである。
１つまたは複数の実施形態において、相補性決定領域のそれぞれの突然変異部位は、以下の突然変異の組み合わせのいずれか１つから選択される：
Figure 0007299309000001
Figure 0007299309000002
Figure 0007299309000003
 。
１つまたは複数の実施形態において、前記結合タンパク質は少なくとも３つのＣＤＲを含む；または、前記結合タンパク質は少なくとも６つのＣＤＲを含む。
１つまたは複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、可変領域および定常領域を含む無傷抗体である。
１つまたは複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、例えば、ナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、および抗体最小認識ユニットのうちの１つである抗体の「機能的フラグメント」である。
１つまたは複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、配列がそれぞれ配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１－４で示す軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４、および／または、配列がそれぞれ、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：）５－８で示す重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３およびＦＲ－Ｈ４、を含む。
１つまたは複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、抗体定常領域配列をさらに含む。
１つまたは複数の実施形態では、前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択される任意の１つの定常領域配列である。
１つまたは複数の実施形態では、前記定常領域は、以下の種に由来する：ウシ、馬、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、シカ、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ゲームコック、またはヒト。
１つまたは複数の実施形態では、前記定常領域はマウスに由来する；
軽鎖の定常領域配列は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）９に記載されている通りで
ある；
重鎖の定常領域配列は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１０に記載されている通りである。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、単離された核酸分子に関し、該核酸分子は、上記結合タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡである。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記核酸分子を含むベクターに関する。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記結合タンパク質を産生するための方法に関し、該方法は、以下のステップを含む：
適切な培養条件下にて培養培地中で上記宿主細胞を培養し、該培養培地または培養される宿主細胞から産生された結合タンパク質を回収する。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、および心筋損傷を診断するための診断薬またはキットの調製における上記結合タンパク質の使用に関する。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法に関し、該方法は以下を含む：
ａ）抗体／抗原結合反応の発生に十分な条件下で、免疫複合体を形成するために、前記試験サンプル中のトロポニンＩを前記結合タンパク質と接触させる；および
ｂ）試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す前記免疫複合体の存在を検出する。
１つまたは複数の実施形態では、ステップａ）において、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合する二次抗体をさらに含む。
１つまたは複数の実施形態では、ステップａ）において、前記免疫複合体は、前記トロポニンＩ抗原に結合する二次抗体をさらに含む。
１つまたは複数の実施形態では、前記酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼのいずれか１つを含む。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、前記結合タンパク質を含むキットに関する。
１つまたは複数の実施形態において、前記トロポニンＩ抗原は、心筋型トロポニンＩ抗原である。
本開示はまた、心筋型トロポニンＩに関連する疾患の診断における本明細書に記載の結合タンパク質の使用に関する。
本開示はまた、心筋型トロポニンＩに関連する疾患を診断するための方法に関し、以下を含む：
Ａ）結合反応の発生に十分な条件下で、結合反応を実行するために、対象からのサンプルと本開示における前記結合タンパク質とを接触させる；および
Ｂ）該結合反応によって生成された免疫複合体を検出する；
ここで、上記免疫複合体の存在は、心筋型トロポニンＩに関連する疾患の存在を示す。
１つまたは複数の実施形態では、前記方法は、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、金コロイドイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイおよび／または酵素結合イムノアッセイに基づく。
１つまたは複数の実施形態では、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿、または心筋組織から選択される少なくとも１つである。
１つまたは複数の実施形態では、前記対象は、例えば、ヒトなどの霊長類のような哺乳動物である。
１つまたは複数の実施形態では、前記心筋型トロポニンＩに関連する疾患は心血管疾患である。
１つまたは複数の実施形態では、前記心筋型トロポニンＩに関連する疾患は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患である。
本開示の特定の実施形態または先行技術における技術案をより明確に説明するために、特定の実施形態または先行技術で使用される図面について以下に簡単に説明する。明らかに、以下に記載される図面は、本開示のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、他の図面は、創造的な作業なしにこれらの図面に基づいて得ることができる。
図１は、本開示による抗ヒト心筋型トロポニンＩ組換え抗体のモノクローナル抗体の電気泳動図である。
本開示は、以下の本開示のいくつかの実施形態の説明およびそこに含まれる実施例の詳細な内容を通じて、より容易に理解することができる。
本開示をさらに説明する前に、これらの実施形態は必然的に多様であるため、本開示は特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲でのみ定義されるため、本明細書で使用される用語は、限定ではなく、特定の実施形態を説明するためだけのものであることも理解されたい。
（用語の定義）
「抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質」は、ＣＤＲ領域を含むすべてのタンパク質／タンパク質フラグメントを指す。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれらの抗体の抗原化合物結合フラグメントが含まれ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、および抗体最小認識ユニット、並びにこれらの抗体およびフラグメントの一本鎖誘導体も含まれる。抗体の種類は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤからなる群から選択できる。さらに、「抗体」という用語は、天然に存在する抗体、ならびに例えば、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）およびヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ならびに関連する合成アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を含む非天然に存在する抗体を含む。「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」と交換可能に使用することができる。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれ、軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることがある。これらのドメインは通常、抗体の最も変化しやすい部分であり、そして抗原結合部位を含んでいる。軽鎖または重鎖の可変領域（ＶＬまたはＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域と、３つの相補性決定領域を分離するフレームワーク領域で構成される。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲は、例えばＫａｂａｔ（「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列」（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），Ｅ．Ｋａｂａｔ等、米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），（１９８３）を参考）、およびＣｈｏｔｈｉａｌで正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち軽鎖と重鎖の組み合わせを構成するフレームワーク領域は、ＣＤＲの位置特定およびＣＤＲを基準にして整列させるように機能し、上記ＣＤＲは主に抗原への結合に関与する。
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、ＣＤＲとして定義されるものを除いた抗体の可変ドメイン内のその他の領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワーク領域は、ＣＤＲによって分離された隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）にさらに細分化できる。
通常、重鎖および軽鎖の可変領域ＶＬ／ＶＨは、次の番号のＣＤＲおよびＦＲを次の組み合わせで配置およびリンクすることによって取得できる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－
ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたは核酸に関連して「精製された」または「単離された」という用語は、ポリペプチドまたは核酸がその天然培地またはその天然形態にないことを意味する。したがって、「単離された」という用語は、その元の環境から、例えば、それが天然に存在する場合は自然環境から抽出されたポリペプチドまたは核酸を含む。例えば、単離されたポリペプチドは、一般にポリペプチドが通常結合する、または通常ポリペプチドと混合される、または溶液中にある少なくともいくつかのタンパク質または他の細胞成分を含まない。単離されたポリペプチドには、細胞溶解物に含まれる天然に産生されたポリペプチド、精製または部分的に精製された形態のポリペプチド、組換えポリペプチド、細胞によって発現または分泌されるポリペプチド、および異種宿主細胞または培養物中のポリペプチドが含まれる。核酸に関連して単離されたまたは精製されたという用語は、該核酸が、例えば、その天然のゲノムバックグラウンド（例えば、ベクターにある、発現カセットとする、プロモーターに連結される、または異種宿主細胞に人工的に導入される）にないことを示す。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」という用語は、２つの異なる重鎖／軽鎖の対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド結合タンパク質を指す。二重特異性結合タンパク質は、ハイブリドーマ融合またはＦａｂ’フラグメント結合を含むさまざまな方法で生成できる。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、少なくとも２つの異なる配列間の類似性を指す。このパーセント同一性は、標準的なアルゴリズム、例えば、基本的なローカルアライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらによって確立されたアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓらによって確立されたアルゴリズムによって決定することができる。１つまたは複数の実施形態では、パラメータのセットは、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティおよび５のフレームシフトギャップペナルティを伴うＢｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックスであり得る。１つまたは複数の実施形態では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７）に記載されているアルゴリズムを使用して決定することもできる。該アルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０の重み付け表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用する。パーセント同一性は通常、類似長さのシーケンスを比較することによって計算される。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、抗原または抗原のエピトープに対する結合タンパク質または抗体の抗原結合ドメインの結合強度を指す。親和性はＫＤ値で測定することができる。ＫＤ値が小さいほど、親和性が高いことを示す。
（本開示の例示的な実施形態）
本開示は、抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質を提供し、ここで、該抗原結合ドメインは、少なくとも１つ以下のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含むか、または以下のアミノ酸配列を有する相補性決定領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、さらに心筋型トロポニンＩに対してＫＤ≦１．４１×１０－９ｍｏｌ／Ｌである親和性を有するものである：
Ｇ－Ｆ－Ｎ－Ｘ１－Ｋ－Ｘ２－Ｙ－Ｘ３－Ｍ－Ｈの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１、ここで
Ｘ１はＬまたはＩ、Ｘ２はＤまたはＥ、Ｘ３はＦまたはＹである；
Ｒ－Ｉ－Ｘ１－Ｐ－Ｅ－Ｄ－Ｘ２－Ｅ－Ｔ－Ｘ３－Ｙ－Ａ－Ｐ－Ｅの配列を有する相補
性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２、ここで
Ｘ１はＥまたはＤ、Ｘ２はＡまたはＧ、Ｘ３はＲまたはＫである；
Ｙ－Ｙ－Ｘ１－Ｓ－Ｙ－Ｘ２－Ｐ－Ｆ－Ｖ－Ｙの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３、ここで
Ｘ１はＴまたはＳであり、Ｘ２はＩ、Ｌ、またはＶである；
Ｑ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｙ－Ｓ－Ｎ－Ｘ３－Ｈ－Ｔ－Ｙの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１、ここで
Ｘ１はＩまたはＬ、Ｘ２はＩまたはＬ、Ｘ３はＲまたはＫである；
Ｑ－Ｘ１－Ｓ－Ｘ２－Ｒ－Ｆ－Ｓの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２、ここで
Ｘ１はＩ、Ｌ、またはＶであり、Ｘ２はＮまたはＱである；
Ｓ－Ｘ１－Ｓ－Ｔ－Ｈ－Ｘ２－Ｐ－Ｘ３－Ｔの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３、ここで
Ｘ１はＱまたはＮ、Ｘ２はＬまたはＩ、Ｘ３はＦまたはＹである。
１つまたは複数の実施形態において、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を有する相補性決定領域に対して少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、そして心筋型トロポニンＩに対してＫＤ≦１．４１×１０－９ｍｏｌ／Ｌの親和性を有する。例えば、１×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、２×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、３×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、４×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、 ４．５×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、５×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、６×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、７×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、８×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、９×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、１×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、３×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、７×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、９ ×１０－１１ｍｏｌ／Ｌまたは１×１０－９ｍｏｌ／Ｌ、
または、１．６８×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ≦ＫＤ≦１．４１×１０－９ｍｏｌ／Ｌ、
または、ＫＤ値は１×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、２×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、３×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、４×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、４．５×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、５×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、６×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、７×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、８×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、９×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ、１×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、３×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、７×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ、または９×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ以下である。
ここで、親和性は、本開示の方法に従って測定される。
１つまたは複数の実施形態では、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＤである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＤである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＳである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＲである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＮである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ１はＱである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３は
Ｆである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＹである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＡである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＧである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＲである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＫである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＶである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＶである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ２はＬである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ２はＩである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ３はＦである。
１つまたは複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３において、Ｘ３はＹである。
１つまたは複数の実施形態において、相補性決定領域のそれぞれの突然変異部位は、以下の突然変異の組み合わせのいずれか１つから選択される：
Figure 0007299309000004
Figure 0007299309000005
Figure 0007299309000006
 。
１つまたは複数の実施形態において、本開示に記載される上記結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に現れるＸ１は、それぞれ独立して、本開示に限定されるアミノ酸を表す；本開示に記載されている結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に現れるＸ２は、それぞれ独立して、本開示に限定されるアミノ酸を表す；本開示に記載されている結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に現れるＸ３は、それぞれ独立して、本開示に限定されるアミノ酸を表す。
１つまたは複数の実施形態において、上記結合タンパク質は、少なくとも３つのＣＤＲを含む；または、上記結合タンパク質は少なくとも６つのＣＤＲを含む。
１つまたは複数の実施形態では、上記結合タンパク質は、可変領域および定常領域を含む無傷抗体である。
１つまたは複数の実施形態では、上記結合タンパク質は、例えば、ナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、および抗体最小認識ユニットのうちの１つである抗体の「機能的フラグメント」である。
ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、二重特異性抗体（ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ））。
本開示に記載される「機能的フラグメント」は、具体的には、親抗体と同様に、ｃＴｎＩに対する特異性を有する抗体フラグメントを指す。上記の機能的フラグメントに加えて、半減期が増加したフラグメントも含まれる。
一般に、これらの機能的フラグメントは、それらが由来する抗体と同じ結合特異性を持っている。本開示に列挙された内容から、当業者は上記のような機能的フラグメントが、例えば酵素消化（ペプシンまたはパパインを含む）の方法および／またはジスルフィド結合を分割するための化学還元法を通じて、本開示の抗体フラグメントを使用して得ることができると推測する。
抗体フラグメントはまた、当業者に知られている組換え遺伝子技術によって、または例えば、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）等によって販売されている自動ペプチドシンセサイザーによるペプチド合成によって得ることができる。
１つまたは複数の実施形態では、上記結合タンパク質は、それぞれ配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１－４で示す軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４、および／またはそれぞれ配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）５－８で示す重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３およびＦＲ－Ｈ４を含む。
ヒト化抗体を形成するために、本開示で上記に開示されたアミノ酸配列に加えて、フレームワーク領域がヒトに由来し得ることに留意されたい。
１つまたは複数の実施形態では、上記結合タンパク質は、抗体の定常領域配列をさらに含む。
１つまたは複数の実施形態では、上記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択される任意の１つの定常領域の配列である。
１つまたは複数の実施形態では、上記定常領域は、以下の種に由来する：ウシ、馬、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、シカ、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ゲームコック、またはヒト。
１つまたは複数の実施形態では、上記定常領域はマウスに由来する；
軽鎖の定常領域配列は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）９に記載されている通りである；
重鎖の定常領域配列は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１０に記載されている通りである。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、単離された核酸分子に関する。該核酸分子は、上記結合タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡである。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記核酸分子を含むベクターに関する。
本開示は、上記核酸分子をコードする少なくとも１つの核酸構築物、例えばプラスミド、さらには発現プラスミドをさらに含む。該ベクターを構築する方法は、本出願の実施形態において説明される。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
上記宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。
１つまたは複数の実施形態では、上記宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記結合タンパク質を産生するための方法に関する。この方法は、以下のステップを含む：
適切な培養条件下にて培養培地中で上記宿主細胞を培養し、該培養培地または培養宿主細胞から産生された結合タンパク質を回収する。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、および心筋損傷を診断するための診断薬またはキットの調製における上記結合タンパク質の使用に関する。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原を検出するための方法に関し、該方法は以下を含む：
ａ）抗体／抗原結合反応の発生に十分な条件下で、免疫複合体を形成するために、上記試験サンプル中のトロポニンＩを上記結合タンパク質と接触させる；および
ｂ）該免疫複合体の存在を検出し、複合体の存在は、試験サンプル中のトロポニンＩ抗原の存在を示す。
この実施形態では、上記複合体が容易に検出されるように、上記結合タンパク質はシグナル強度を示すためのインジケーターで標識できる。
１つまたは複数の実施形態では、ステップａ）において、上記免疫複合体は、上記結合タンパク質に結合する上記二次抗体をさらに含む；
この実施形態では、上記結合タンパク質は、一次抗体の形態でｃＴｎＩの異なるエピトープに結合するために、上記二次抗体と抗体ペアを形成する；
上記二次抗体は、上記複合体が容易に検出されるように、シグナル強度を示すインジケーターで標識できる。
１つまたは複数の実施形態では、ステップａ）において、上記免疫複合体は、トロポニンＩ抗原に結合する二次抗体をさらに含む。
この実施形態では、上記結合タンパク質は、上記二次抗体の抗原として機能する。上記二次抗体は、上記複合体が容易に検出されるように、シグナル強度を示すインジケーターで標識できる。
１つまたは複数の実施形態では、上記シグナル強度を示すインジケーターは、蛍光物質、量子ドット、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン、放射性同位元素、放射性造影剤、常磁性イオン蛍光ミクロスフェア、電子密度の高い材料、化学発光マーカー、超音波造影剤、光増感剤、金コロイドまたは酵素のいずれか１つを含む。
１つまたは複数の実施形態では、上記蛍光物質は、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ ４３０、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、５－カルボキシ－４’、５’－ジクロロ－２’、７’－ジメトキシフルオレセイン、５－カルボキシ－２’、４’、５’、７’－テトラクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミン、６－カルボキシローダミン、６－カルボキシテトラメチルローダミン、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ
Ｂｌｕｅ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６－ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フルオレセイン、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、ＮＢＤ（７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）４８８、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）５００、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）５１４、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ｏ－フタル酸、ｐ－フタル酸、ｍ－フタル酸、クレゾールソリッドバイオレット、クレゾールブルーバイオレット、ブリリアントクレゾールブルー、ｐ－アミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユーロピウムトリス－ビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプテートまたはキレート、ジアミン、ビスシアニン、ラホラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）ブルー染料、アロフィコシアニン、Ｂ－アロコシアニン（ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ）、Ｃ－フィコシアニン、Ｒ－フィコシアニン、チアミン、フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッドのいずれか１つを含む。
１つまたは複数の実施形態では、上記放射性同位元素は、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４－１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂおよび８３Ｓｒのいずれか１つを含む。
１つまたは複数の実施形態において、上記酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼのいずれか１つを含む。
１つまたは複数の実施形態では、上記蛍光ミクロスフェアは、ポリスチレン蛍光ミクロスフェアであり、その中に希土類イオンである蛍光ユウロピウムが包まれている。
本開示の一態様によれば、本開示はまた、上記結合タンパク質を含むキットに関する。
１つまたは複数の実施形態において、上記トロポニンＩ抗原は、心筋型トロポニンＩ抗原である。
本開示はまた、心筋型トロポニンＩに関連する疾患の診断における本明細書に記載の結合タンパク質の使用に関する。
本明細書で使用される場合、「心筋型トロポニンＩに関連する疾患」という用語は、タンパク質自体またはそれをコードする核酸を含む心筋型トロポニンＩをマーカーとする疾患を指す。特に、本開示の１つまたは複数の実施形態において、心筋型トロポニンＩに関連する疾患は、血中の心筋型トロポニンＩのレベルの増加を特徴とする疾患を指し得る。本開示の１つまたは複数の実施形態において、心筋型トロポニンＩに関連する疾患は、心筋組織または心筋細胞における心筋型トロポニンＩのレベルの低下を特徴とする疾患を指し得る。
本開示はまた、心筋型トロポニンＩに関連する疾患を診断するための方法に関し、以下を含む：
Ａ）結合反応の発生に十分な条件下で、結合反応を実行するために、対象からのサンプルと本開示における結合タンパク質とを接触させる；および
Ｂ）該結合反応によって生成された免疫複合体を検出する。
ここで、上記免疫複合体の存在は、心筋型トロポニンＩに関連する疾患の存在を示す。
１つまたは複数の実施形態では、上記方法は、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、金コロイドイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイおよび／または酵素結合イムノアッセイに基づく。
１つまたは複数の実施形態では、上記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿、または心筋組織から選択される少なくとも１つである。
１つまたは複数の実施形態では、上記対象は、例えば、ヒトなどの霊長類のような哺乳動物である。
１つまたは複数の実施形態では、上記心筋型トロポニンＩに関連する疾患は心血管疾患である。
１つまたは複数の実施形態では、上記心筋型トロポニンＩに関連する疾患は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症、心筋損傷、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本開示の実施形態は、実施例と併せて以下で詳細に説明されるが、当業者は、以下の例が本開示を説明するためにのみ使用され、本開示の範囲を限定すると見なされるべきではないことを理解するだろう。実施例に特定の条件が示されていない場合は、従来の条件または製造業者が推奨する条件に従って実施するものとする。製造元を示さずに使用される試薬または機器は、すべて従来の市販製品である。
［実施例１］
この実施例は、抗ヒト心筋型トロポニンＩ組換え抗体を調製するための例示的な方法を提供する。
Ｓ１０、発現プラスミドの構築：
この実施例では、制限エンドヌクレアーゼとプライムスター（Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ）ＤＮＡポリメラーゼはタカラ（Ｔａｋａｒａ）会社から購入した；
ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ抽出キットは東洋紡（ＴＯＹＯＢＯ）会社から購入した；
ＢＤ ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）はタカラ（Ｔａｋａｒａ）会社から購入した；
ｐＭＤ－１８Ｔベクターはタカラ（Ｔａｋａｒａ）会社から購入した；
プラスミド抽出キットは天根会社から購入した；
プライマー合成と遺伝子シークエンシングはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社によって行われた；
Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ ５Ｇ８モノクローナル抗体を分泌する細胞株は、既存のハイブリドーマ細胞株であり、使用のために復活させた。
Ｓ１１、プライマーの設計と合成：
重鎖および軽鎖を増幅するための５’ＲＡＣＥフォワードプライマー：
ＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド：
５’＞ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１３）；
５’－ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（５’－ＣＤＳ）：５’＞（Ｔ）２５ＶＮ＜３’（
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ；Ｖ＝Ａ、Ｇ、またはＣ）（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１４）；
ユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）：
５’＞ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１５）；
ネスト－ユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：
５’＞ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１６）；
ｍＩｇ－ｋＲ：５’＞ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１７）；
ｍＩｇ－ＨＲ：５’＞ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１８）。
Ｓ１２、抗体可変領域の遺伝子クローニングとシークエンシング：
Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ５Ｇ８モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）とキットにあるＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチドおよび５’－ＣＤＳプライマーを利用して第１鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。得られた第１鎖ｃＤＮＡの生成物をＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。軽鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）、ネスト－ユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）、およびｍＩｇ－ｋＲプライマーで増幅され、重鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）、ネスト－ユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）およびｍＩｇ－ＨＲプライマーで増幅された。サイズが約０．７２ＫＢのターゲットバンドは軽鎖のプライマーペアで増幅され、サイズが約１．４ＫＢのターゲットバンドは重鎖のプライマーペアで増幅された。アガロースゲル電気泳動による精製と回収後、生成物をｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼでポリＡテール付加反応に供し、ｐＭＤ－１８Ｔベクターに挿入し、その後、ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。コロニーが成長した後、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子のそれぞれについて、４つのクローンを選び、シークエンシングのためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社に送った。
Ｓ１３、Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ５Ｇ８抗体の可変領域遺伝子の配列分析：
上記のシーケンシングで得られた遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベースに入れ、ＶＮＴＩ１１．５ソフトウェアを使用して分析し、重鎖と軽鎖のプライマーペアで増幅された遺伝子が正しいことを確認した。軽鎖のプライマーペアで増幅された遺伝子フラグメントでは、ＶｋＩＩ遺伝子ファミリーに属するＶＬ遺伝子は、上流に５７ｂｐのリーダーペプチド配列を持つ３２１ｂｐの配列を持っている；重鎖のプライマーペアで増幅された遺伝子フラグメントでは、ＶＨ１遺伝子ファミリーに属するＶＨ遺伝子は、上流に５７ｂｐのリーダーペプチド配列を持つ３５７ｂｐの配列を持っている。
Ｓ１４、組換え抗体発現プラスミドの構築：
ｐｃＤＮＡＴＭ３．４ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどの複数のクローニングサイトが導入された組換え抗体用に構築された真核生物発現ベクターであり、ｐｃＤＮＡ ３．４Ａ発現ベクター（以下、略して３．４Ａ発現ベクター）と呼ばれる；ｐＭＤ－１８Ｔにおける上記の抗体可変領域遺伝子のシークエンシング結果に従って、Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ ５Ｇ８抗体のＶＬおよびＶＨ遺伝子に特異的なプライマーを設計し、両端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位および保護塩基を設けた。プライマーは次のとおりである：
ｃＴｎＩ－５Ｇ８－ＨＦ： ５’＞ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣ ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１９）；
ｃＴｎＩ－５Ｇ８－ＨＲ： ５’＞ ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２０）；
ｃＴｎＩ－５Ｇ８－ＬＦ： ５’＞ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧ ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２１）；
ｃＴｎＩ－５Ｇ８－ＬＲ： ５’＞ ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡ ＜３’（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２２）；
０．７２ＫＢのサイズの軽鎖遺伝子フラグメントと１．４ＫＢのサイズの重鎖遺伝子フラグメントがＰＣＲ増幅によって増幅された。重鎖および軽鎖遺伝子フラグメントはそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩによって二重消化された。３．４ＡベクターもＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩによって二重消化された。消化されたフラグメントとベクターを精製・回収した後、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子をそれぞれ３．４Ａ発現ベクターに連結し、それぞれ重鎖と軽鎖の組換え発現プラスミドを得た。
［実施例２］
ＣＨＯ細胞への組換え抗体発現プラスミドの一過性トランスフェクションおよび上清中に発現された抗体の活性評価
プラスミドを超純水で４００ｎｇ／ｍｌに希釈した。ＣＨＯ細胞は遠心分離管で１．４３×１０７細胞／ｍＬに調整された。１００μＬのプラスミドを７００μＬの細胞と混合した後、混合物をエレクトロポレーションキュベットに移してエレクトロポレーションを行い、次に１０ｍＬ ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地に移し、３７°Ｃ（８％ＣＯ２、振幅１５０）のシェーカーで培養した。細胞の生存率をテストするために、培地を毎日サンプリングした。細胞生存率が５０％未満になったら、細胞培養物の上清を遠心分離し、抗体（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２に記載の配列を有する軽鎖および重鎖を有する）を得た。
分析では、重鎖の相補性決定領域（ＷＴ）は：
ＣＤＲ－ＶＨ１が、Ｇ－Ｆ－Ｎ－Ｌ（Ｘ１）－Ｋ－Ｅ（Ｘ２）－Ｙ－Ｆ（Ｘ３）－Ｍ－Ｈである；
ＣＤＲ－ＶＨ２が、Ｒ－Ｉ－Ｅ（Ｘ１）－Ｐ－Ｅ－Ｄ－Ａ（Ｘ２）－Ｅ－Ｔ－Ｒ（Ｘ３）－Ｙ－Ａ－Ｐ－Ｅである；
ＣＤＲ－ＶＨ３が、Ｙ－Ｙ－Ｔ（Ｘ１）－Ｓ－Ｙ－Ｉ（Ｘ２）－Ｐ－Ｆ－Ｖ－Ｙである；
軽鎖の相補性決定領域は：
ＣＤＲ－ＶＬ１が、Ｑ－Ｓ－Ｉ（Ｘ１）－Ｉ（Ｘ２）－Ｙ－Ｓ－Ｎ－Ｋ（Ｘ３）－Ｈ－Ｔ－Ｙである；
ＣＤＲ－ＶＬ２が、Ｑ－Ｉ（Ｘ１）－Ｓ－Ｑ（Ｘ２）－Ｒ－Ｆ－Ｓである；
ＣＤＲ－ＶＬ３が、Ｓ－Ｎ（Ｘ１）－Ｓ－Ｔ－Ｈ－Ｌ（Ｘ２）－Ｐ－Ｆ（Ｘ３）－Ｔである；
ここで、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は変異が起こる全部位である。
Figure 0007299309000007
本発明者らは、より良好な活性を有する抗体を得るために、ＷＴのＣＤＲ部位を上記のように突然変異させた。
コーティング溶液で１μｇ／ｍｌまで希釈した品質管理されたｃＴｎＩ組換え抗原を、ウェルあたり１００ｕＬのマイクロプレートコーティングに使用し、４℃で一晩放置した；翌日、マイクロプレートを洗浄液で２回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた；ブロッキング溶液（２０％ＢＳＡ＋８０％ＰＢＳ）をウェルあたり１２０μＬで添加し、３７°Ｃで１時間放置し、マイクロプレートを軽くたたいて乾燥させた；希釈したｃＴｎＩモノクローナル抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で３０分間放置した；次に、マイクロプレートを洗浄液で５回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた；ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰをウェルあたり１００μＬで添加し、３７℃で３０分間放置した；次に、マイクロプレートを洗浄液で５回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた；発色溶液Ａを（５０μＬ／ウェルで）添加し、続いて発色溶液Ｂを（５０μＬ／ウェルで）添加し、混合溶液を１０分間放置した；停止溶液を５０μＬ／ウェルで添加した；ＯＤ値はマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ（６３０ｎｍで参照）で読み取られた。
Figure 0007299309000008
上記表にある特定の抗体配列の親和性データをさらに測定した。方法は：ＡＭＣセンサーを使用して、精製された抗体をＰＢＳＴで１０μｇ／ｍｌに希釈し、品質管理されたＣＴＮＩ組換えタンパク質（ＰＫ２－ＣＴＮＩ－１、１７０１２０、出願人が製造）をＰＢＳＴで段階的に希釈した：４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、１２．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、６．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、および０ｎｍｏｌ／ｍｌ；
実行プロセス：バッファー１（ＰＢＳＴ）で６０秒間平衡化し、抗体を抗体溶液に３００秒間固定し、バッファー２（ＰＢＳＴ）で１８０秒間インキュベートし、抗原溶液で４２０秒間結合し、バッファー２で１２００秒間解離し、ｐＨ１．６９の１０ｍＭ ＧＬＹ溶液とバッファー３でセンサー再生を行い、データを出力した。
分析では、上記の表の突然変異１の活性および親和性効果が最も高かったため、突然変異１を、より強力な突然変異部位をスクリーニングするためのバックボーン配列として使用した（スクリーニングによって得られた抗体が突然変異１と近い活性を有することを確保する。すなわち抗体活性が±１０％）。結果の一部は以下のとおりである。
Figure 0007299309000009
Figure 0007299309000010
Figure 0007299309000011
親和性分析
ＡＭＣセンサーを使用して、精製した抗体をＰＢＳＴで１０μｇ／ｍｌに希釈し、品質管理されたＣＴＮＩ組換えタンパク質（ＰＫ２－ＣＴＮＩ－１、１７０１２０、出願者が製造）をＰＢＳＴで段階的に希釈した：４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、５０ｎｍｏｌ／ｍｌ、２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、１２．５ｎｍｏｌ／ｍｌ、６．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、および０ｎｍｏｌ／ｍｌ；
実行プロセス：バッファー１（ＰＢＳＴ）で６０秒間平衡化し、抗体を抗体溶液に３００秒間固定し、バッファー２（ＰＢＳＴ）で１８０秒間インキュベートし、抗原溶液で４２０秒間結合し、バッファー２で１２００秒間解離し、ｐＨ１．６９の１０ｍＭ ＧＬＹ溶液とバッファー３でセンサー再生を行い、データを出力した。（ＫＤは平衡解離定数、つまり親和性を表し；ｋｏｎは結合速度を表し；ｋｏｆｆは解離速度を表す。）
Figure 0007299309000012
Figure 0007299309000013
Figure 0007299309000014
表４から、表３に記載されている突然変異部位は抗体の親和性にほとんど影響を与えないことがわかる。
上記の結果を検証するために、ＷＴをバックボーン配列として上記の実験を繰り返し、突然変異部位の親和性を検証した。結果の一部は次のとおりである。
Figure 0007299309000015
Figure 0007299309000016
表５および表６から、抗体活性が保証されている限り、上記の突然変異部位は他の部位とほとんど相関がない。
最後に、上記の実施形態は、本開示の技術案を説明するためにのみ使用され、限定するものではないことに留意されたい；本開示は、前述の実施形態を参照して詳細に説明されてきたが、当業者は、前述の実施形態に記載された技術案を修正すること、または同等に技術的特徴の一部または全部を置き換えることが依然として可能であることを理解すべきである；しかしながら、これらの修正または置換は、対応する技術案の本質が本開示の実施形態の技術案の範囲から逸脱することを引き起こさない。
本開示で提供される心筋型トロポニンＩに結合する抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質は、特定の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。該結合タンパク質は、心筋型トロポニンＩを特異的に認識して結合することができ、高い感度と特異性を持ち、特
に、該結合タンパク質は、ヒトｃＴｎＩタンパク質に対して高い親和性を有する。したがって、心筋型トロポニンＩに関連する疾患の検出および診断を可能にする。

Claims (16)

  1. 心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原結合ドメインを含む単離された結合タンパク質であって、
    該心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原結合ドメインは以下６つのアミノ酸配列を有する相補性決定領域を含み、 Ｇ－Ｆ－Ｎ－Ｘ１－Ｋ－Ｄ－Ｙ－Ｘ３－Ｍ－Ｈの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１、ここでＸ１はＬまたはＩ、Ｘ３はＦまたはＹである；
    Ｒ－Ｉ－Ｄ－Ｐ－Ｅ－Ｄ－Ｘ２－Ｅ－Ｔ－Ｘ３－Ｙ－Ａ－Ｐ－Ｅの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２、ここでＸ２はＡまたはＧ、Ｘ３はＲまたはＫである；
    Ｙ－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｙ－Ｘ２－Ｐ－Ｆ－Ｖ－Ｙの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３、ここでＸ２はＩ、Ｌ、またはＶである；
    Ｑ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｙ－Ｓ－Ｎ－Ｒ－Ｈ－Ｔ－Ｙの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１、ここでＸ１はＩまたはＬ、Ｘ２はＩまたはＬである；
    Ｑ－Ｘ１－Ｓ－Ｎ－Ｒ－Ｆ－Ｓの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２、ここでＸ１はＩ、Ｌ、またはＶである；及び
    Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｔ－Ｈ－Ｘ２－Ｐ－Ｘ３－Ｔの配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３、ここでＸ２はＬまたはＩ、Ｘ３はＦまたはＹである；
    ここで、６つの前記相補性決定領域は、以下の突然変異の組み合わせのいずれか１つを有し、
    Figure 0007299309000017
    Figure 0007299309000018
    Figure 0007299309000019
     該結合タンパク質は、配列がそれぞれ配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１－４で示す軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３およびＦＲ－Ｌ４、および、配列がそれぞれ配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）５－８で示す重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３およびＦＲ－Ｈ４を含む、結合タンパク質。
  2. 前記結合タンパク質は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び二重特異性抗体のうちの１つである、請求項１に記載の結合タンパク質。
  3. 定常領域配列をさらに含む、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  4. 前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤからなる群から選択される任意の１つの定常領域の配列である、請求項３に記載の結合タンパク質。
  5. 前記定常領域は、以下の種：ウシ、馬、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ロバ、シカ、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ゲームコック、またはヒトに由来する、請求項４に記載の結合タンパク質。
  6. 前記定常領域はマウスに由来し、
    前記定常領域は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）９の配列を有する軽鎖定常領域および配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１０の配列を有する重鎖定常領域を含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
  7. 前記結合タンパク質は、シグナル強度を示すインジケーターで標識可能であり、該シグナル強度を示すインジケーターは、蛍光物質、量子ドット、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン、放射性同位元素、放射性造影剤、常磁性イオン蛍光ミクロスフェア、電子密度の高い材料、化学発光マーカー、超音波造影剤、光増感剤、金コロイドまたは酵素のいずれか１つを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  8. 単離された核酸分子であり、該核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
  10. 請求項９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  11. 請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の結合タンパク質を産生するための方法であって、
    適切な培養条件下にて培養培地中で請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、該培養培地または培養宿主細胞から産生された結合タンパク質を回収するステップを含む方法。
  12. 急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定狭心症又は心筋損傷を診断するための診断薬またはキットの調製における、請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の結合タンパク質の使用。
  13. 試験サンプル中の心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原を検出するための方法であって、以下のステップを含む方法。
    ａ）抗体／抗原結合反応の発生に十分な条件下で、試験サンプル中の心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原を請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させ、免疫複合体を形成するステップ；および
    ｂ）試験サンプル中の心筋型トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原の存在を示す前記免疫複合体の存在を検出するステップ
  14. 前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合する二次抗体をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. ステップａ）において、前記免疫複合体は、前記トロポニンＩ抗原に結合する二次抗体をさらに含む、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含むキット。
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