JP7553433B2 - 抗ヒト心筋トロポニンｉの抗体及びその使用 - Google Patents

抗ヒト心筋トロポニンｉの抗体及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP7553433B2
JP7553433B2 JP2021513274A JP2021513274A JP7553433B2 JP 7553433 B2 JP7553433 B2 JP 7553433B2 JP 2021513274 A JP2021513274 A JP 2021513274A JP 2021513274 A JP2021513274 A JP 2021513274A JP 7553433 B2 JP7553433 B2 JP 7553433B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
binding protein
complementarity determining
determining region
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021513274A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022503675A (ja
Inventor
ツァイ，ペン
フー，ジーチアン
メン，ユアン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fapon Biotech Inc
Original Assignee
Fapon Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fapon Biotech Inc filed Critical Fapon Biotech Inc
Publication of JP2022503675A publication Critical patent/JP2022503675A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7553433B2 publication Critical patent/JP7553433B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年１０月１０日に中国特許局に提出した、中国特許出願第２０１８１１１８３０２５．４号で、名称が「抗ヒト心筋トロポニンＩの抗体及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張する。この中国特許出願の全文を本願に引用している。
本開示は、バイオ技術及び医学技術分野に関し、特に抗ヒト心筋トロポニンＩの抗体及びその使用に関する。
２０世紀８０年代以前に、世界保健機関（ＷＨＯ）は、心筋ザイモグラムの活性を急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の診断基準の１つとしていた。２０世紀８０年代末に、研究者らは、トロポニン（ｔｒｏｐｏｎｉｎ、Ｔｎ）の感度及び特異性がクレアチンフォスフォキナーゼ（ＣＫ）、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ－ＭＢ）、乳酸脱水素酵素及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素などのバイオマーカーより高いことを発見した。心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は心筋にのみ存在し、心筋細胞のマーカーであり、その異常な変化は、心臓の拡張機能と収縮機能に影響を与える可能性があり、心筋壊死の診断、心筋障害（傷害）の判断などに使用することができ、心筋細胞損害の感度及び特異性が最も強いマーカーの１つとなっており、ＡＭＩ及び急性冠症候群（ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＡＣＳ）を迅速に診断し、ＡＣＳリスクの層別化を支援し及びその予後を反映するための認められている主要な生化学的マーカーである。
正常なヒトの血液中のｃＴｎＩの含有量は一般に０.３μg/Lより低い。虚血や酸素不足などにより、心筋細胞膜の完全性が損なわれると、遊離ｃＴｎＩが細胞膜にすばやく浸透して血流に入る可能性がある。従って、発病の初期でのヒトの血液中のｃＴｎＩ及びその変化傾向の迅速、高感度かつ正確な測定は、急性心筋梗死の診断、急性冠症候群のリスク層別化、様々な要因によって引き起こされる心筋障害のモニタリングなどにとって重要な臨床的意味を持っている。ｃＴｎＩレベルを検出するための臨床的方法には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光、コロイド状金などがあり、様々な方法にはそれぞれの長所と短所があるため、ｃＴｎＩの特異性モノクローナル抗体を必要としている。
従来のｃＴｎＩ抗体は、活性が低く、親和性が低く、ｃＴｎＩタンパク質の検出にうまく適用できないため、本分野では、ｃＴｎＩに効果的かつ特異的に結合して検出する抗体が当技術分野で強く求められている。
本開示は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質に関し、該結合タンパク質の製造、使用などについて研究する。
前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含むか、又は、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつｃＴｎＩとはＫD≦７.５１×１０-8mol/Lの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１はＡ－Ｓ－Ｘ１－Ｙ－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ－Ｗ－Ｍ－Ｙであり、ここで、
Ｘ１がＧ又はＤであり、Ｘ２がＳ又はＴであり、Ｘ３がＴ又はＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２はＹ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ２－Ｇ－Ｈ－Ｔ－Ｘ３－Ｙ－Ｎ－Ｑ－Ｘ４－Ｆ－Ｋ－Ｄであり、ここで、
Ｘ１がＩ又はＬであり、Ｘ２がＳ又はＴであり、Ｘ３がＤ又はＥであり、Ｘ４がＲ又はＫであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３はＡ－Ｒ－Ｘ１－Ｙ－Ｘ２－Ｇ－Ｐ－Ｆ－Ｘ３－Ｍ－Ｄであり、ここで、
Ｘ１がＫ又はＲであり、Ｘ２がＦ、Ｙ又はＷであり、Ｘ３がＧ又はＡであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１はＳ－Ａ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｖ－Ｓ－Ｙ－Ｘ３－Ｈであり、ここで、
Ｘ１がＳ又はＴであり、Ｘ２がＴ又はＳであり、Ｘ３がＡ又はＶであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２はＷ－Ｘ１－Ｙ－Ｄ－Ｘ２－Ｓ－Ｋ－Ｘ３－Ａ－Ｓであり、ここで、
Ｘ１がＩ又はＬであり、Ｘ２がＴ又はＳであり、Ｘ３がＬ又はＩであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３はＱ－Ｘ１－Ｗ－Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｐ－Ｙ－Ｔであり、ここで、
Ｘ１がＱ又はＮであり、Ｘ２がＴ又はＳであり、Ｘ３がＱ又はＮである。
１つの重要な利点は、前記結合タンパク質の活性が高く、ヒトのｃＴｎＩと非常に高い親和性を有することである。
１つ又は複数の実施形態においては、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ１がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＤであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ３がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＶであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＴであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＴである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＳである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＴである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＳである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＦである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＷである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＦである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＹである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＷである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＴである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＳである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＴであり、Ｘ２がＴである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＴであり、Ｘ２がＳである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、各相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかの１種である。
Figure 0007553433000001
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、少なくとも３つのＣＤＲｓを含むか、又は、前記結合タンパク質は、少なくとも６つのＣＤＲｓを含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、可変領域及び定常領域を含む完全な抗体である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、ナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体最小識別単位のうちの１つである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、配列が順に配列番号１乃至配列番号４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順に配列番号５乃至配列番号８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、抗体定常領域の配列をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域の配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれかの定常領域の配列である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域はマウスに由来し、
軽鎖定常領域の配列は配列番号９で示され、
重鎖定常領域の配列は配列番号１０で示される。
本開示は、上記結合タンパク質をコードする分離される核酸をさらに提供する。
本開示は、上記核酸を含むベクターをさらに提供する。
本開示は、上記核酸又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
本開示は、
培地において上記宿主細胞を培養し、生じた結合タンパク質を培地又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む、上記結合タンパク質の生産方法をさらに提供する。
本開示は、上記結合タンパク質の、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害を診断する診断剤又はキットの製造における使用をさらに提供する。
本開示の一態様によれば、本開示は、
テストサンプル中のトロポニンＩ抗原の検出方法であって、
ａ）十分に抗体／抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のトロポニンＩ抗原を上記の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記テストサンプル中の前記トロポニンＩ抗原の存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップとを含む、検出方法にさらに関する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記トロポニンＩ抗原が心筋トロポニンＩ抗原である。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第２の抗体をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記トロポニンＩ抗原に結合される第２の抗体をさらに含む。
一部のさらなる実施形態においては、本開示は、上記結合タンパク質、上記分離される核酸又は上記ベクターのうちの１種又は複数種を含むキットをさらに提供する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記キットは、前記結合タンパク質を標識するためのマーカーをさらに含む。
本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質の、心筋トロポニンＩに関連する疾病の診断における使用にさらに関する。
本開示は、
Ａ）十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
Ｂ）結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンＩに関連する疾病の存在を指示する、心筋トロポニンＩに関連する疾病の診断方法にさらに関する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記方法は、蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び／又は酵素結合免疫技術に基づくものである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも１種である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記被験者は、哺乳動物であり、例えば霊長類動物であり、例えばヒトである。
１つ又は複数の実施形態においては、心筋トロポニンＩに関連する前記疾病は心血管疾患である。
１つ又は複数の実施形態においては、心筋トロポニンＩに関連する前記疾病は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害又はこれらの組合せで構成される群から選ばれる。
本開示は、本開示の一部の実施案についての以下の説明及び含まれる実施例の詳細な内容を通して、容易に了解することができる。
さらに本開示を記述する前に、本開示は、前記特定の実施案に限定されるものではなく、これらの実施案が必然的に様々であるためであることが理解されたい。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施案を説明するためのものに過ぎず、制限するためのものではなく、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲に限定されるためであることが理解されたい。
本明細書に特に定義されない限り、本開示で使用される科学及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有すべきである。用語の意味及び範囲を明瞭にすべきであるが、任意の潜在的なあいまいさがある場合には、本明細書で提供される定義が任意の辞典又は外来の定義より優先である。本願では特に明記しない限り、「又は」の使用は、「及び／又は」を意味する。また、用語「含む」及びその他の形式の使用が非限定的なものである。
一般的には、本明細書で説明される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法及び技術は、本分野で周知された、一般に使用されているものである。本開示の方法及び技術は、特に説明しない限り、当分野で周知された、本明細書の全体にわたって引用及び考察されている種々の一般的な及びより専門的な参考文献に記載されている通常の方法により実施される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、当分野で一般に達成されるように、又は本明細書に記載されているように実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、並びに医学及び医薬化学に関して使用される命名法、実験手順、及び技術は、当分野で周知され、一般に使用されているものである。
本開示をより容易に理解するために、選択される用語を以下に定義する。
用語「アミノ酸」は、天然に存在する又は非天然に存在するカルボキシルα－アミノ酸を意味する。用語「アミノ酸」は、本願で天然に存在するアミノ酸及び非天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。天然に存在するアミノ酸は、アラニン（３文字のコード：Ａｌａ、１文字のコード：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。非天然に存在するアミノ酸は、α－アミノアジピン酸、アミノ酪酸、シトルリン、ホモシトルリン、ホモロイシン、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ピリジニルアラニン、サルコシンなどを含むがこれらに限られない。
用語「分離される結合タンパク質」とは、その派生起源又は派生由来であるため、その天然状態でそれに付随する天然結合成分には結合しなかったタンパク質、あまり同一種からのその他タンパク質を含まないタンパク質、異なる種からの細胞で発現されるタンパク質、又は自然界に存在しないタンパク質である。従って、化学合成される又はその天然起源とは異なる細胞系で合成されるタンパク質は、その天然結合成分と「分離される」ものである。分離によって、例えば、本分野で周知しているタンパク質精製技術を用いることによって、タンパク質があまり天然結合成分を含まないようにしてもよい。
用語「抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質」は、広く、ＣＤＲ領域を含む全てのタンパク質／タンパク質断片を指す。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体の抗原化合物の結合断片を含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、抗体の最小識別単位、及びこれらの抗体と断片の一本鎖誘導体を含む。抗体のタイプは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選択することができる。また、「抗体」という用語は、天然に存在する抗体及び非天然に存在する抗体を含み、例えばキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、二元機能型（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）及びヒト由来型（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）の抗体、及び関連する合成アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を含む。「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」と互換的に使用できる。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端のドメインである。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれてもよい。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれてもよい。これらのドメインは、通常、抗体の可変性が最も高い部分であり、抗原結合部位を含む。軽鎖又は重鎖の可変領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる高度可変領域及びそれらを分離させるフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）で構成される。抗体のフレームワーク領域、即ち構成要件の軽鎖と重鎖との組合せられた枠組み領域は、ＣＤＲを位置付けて揃える作用を果たし、前記ＣＤＲは、抗原の結合に主に用いられる。
本明細書で使用されるとき、「フレームワーク領域」、「枠組み領域」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲとして定義された領域を排除する抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体の可変ドメインフレームワーク領域は、さらに、ＣＤＲに隔てられた隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に細分化されてもよい。
通常の場合、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＬ／ＶＨは、以下の番号のＣＤＲとＦＲを以下の組合せ配列で連結して得ることができる。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
本明細書で使用されるとき、ポリペプチド又は核酸に関連する用語「精製される」又は「分離される」とは、ポリペプチド又は核酸がその天然媒体に存在しない又は天然形態ではないことを意味する。従って、用語「分離される」は、原始的な環境、例えば天然に存在する場合に、天然環境から抽出されるポリペプチド又は核酸である。例えば、分離されるポリペプチドは、通常、それに結合されるもの、又は、通常、それに混合されるもの、又は、溶液における少なくともあるタンパク質又はその他の細胞成分を一般的に含まない。分離されるポリペプチドは、細胞溶解物に含まれた天然に生産される前記ポリペプチド、精製される又は部分的に精製される前記ポリペプチド、組換えポリペプチド、細胞で発現又は分泌される前記ポリペプチド、及び異種宿主細胞又は培養物における前記ポリペプチドを含む。核酸に関連して、用語「分離される」又は「精製される」は、例えば前記核酸が天然のゲノム背景に位置しない（例えば、ベクターでは、発現カセットとして、プロモータに連結され、又は異種宿主細胞に手動で導入される）ことを意味する。
本明細書で使用されるとおり、用語「二重特異性抗体」又は「二重機能性抗体」は、異なる２ペアの重／軽鎖及び２つの異なる結合部位の人工ハイブリッド結合タンパク質を意味する。二重特異性結合タンパク質は、ハイブリドーマの融和又はＦａｂ’断片の連結を含む複数種の方法で生成することができる。
本明細書で使用されるとおり、用語「配列同一性」は、少なくとも２種の異なる配列間の類似性を意味する。このパーセント同一性は、ベーシック・ローカルアライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎなど、又はＭｅｙｅｒｓなどの基準アルゴリズムで決定することができる。１つ又は複数の実施形態では、１組のパラメータは、Ｂｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックス並びにギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５であってもよい。１つ又は複数の実施形態では、２種のアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、さらに、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７）のアルゴリズムで決定されてもよく、該アルゴリズムがＡＬＩＧＮプログラム（２．０バージョン）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いる。パーセント同一性は、通常、類似した長さの配列を比較することで計算される。
本明細書で使用されるとおり、用語「親和性」とは、結合タンパク質又は抗体の抗原結合ドメインと抗原又は抗原エピトープとの結合強度である。親和性は、ＫＤ値で評価することができ、ＫＤ値が小さければ、親和性が大きいことが示される。
本開示に係る抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含むか、又は、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ｃＴｎＩとはＫD≦７.５１×１０-8mol/Lの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１はＡ－Ｓ－Ｘ１－Ｙ－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ－Ｗ－Ｍ－Ｙであり、ここで、
Ｘ１がＧ又はＤであり、Ｘ２がＳ又はＴであり、Ｘ３がＴ又はＳであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２はＹ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ２－Ｇ－Ｈ－Ｔ－Ｘ３－Ｙ－Ｎ－Ｑ－Ｘ４－Ｆ－Ｋ－Ｄであり、ここで、
Ｘ１がＩ又はＬであり、Ｘ２がＳ又はＴであり、Ｘ３がＤ又はＥであり、Ｘ４がＲ又はＫであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３はＡ－Ｒ－Ｘ１－Ｙ－Ｘ２－Ｇ－Ｐ－Ｆ－Ｘ３－Ｍ－Ｄであり、ここで、
Ｘ１がＫ又はＲであり、Ｘ２がＦであり、Ｙ又はＷであり、Ｘ３がＧ又はＡであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１はＳ－Ａ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｖ－Ｓ－Ｙ－Ｘ３－Ｈであり、ここで、
Ｘ１がＳ又はＴであり、Ｘ２がＴ又はＳであり、Ｘ３がＡ又はＶであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２はＷ－Ｘ１－Ｙ－Ｄ－Ｘ２－Ｓ－Ｋ－Ｘ３－Ａ－Ｓであり、ここで、
Ｘ１がＩ又はＬであり、Ｘ２がＴ又はＳであり、Ｘ３がＬ又はＩであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３はＱ－Ｘ１－Ｗ－Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｐ－Ｙ－Ｔであり、ここで、
Ｘ１がＱ又はＮであり、Ｘ２がＴ又はＳであり、Ｘ３がＱ又はＮである。
本分野で周知のように、抗体の結合特異性及び親和性は、主にＣＤＲ配列により決定されており、成熟した周知の従来の各技術に基づいて、非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を容易に変更して、類似した生物活性を有する変異体を取得することができる。従って、本開示は、該結合タンパク質の「機能性誘導体」を含む。「機能性誘導体」とは、アミノ酸置換の変異体であり、機能性誘導体は、検出可能な結合タンパク質活性、好ましくはｃＴｎＩに結合可能な抗体の活性を有する。「機能性誘導体」は、「変異体」及び「断片」を含むことができるため、本開示に記載の結合タンパク質と完全に同一のＣＤＲ配列を有し、従って、類似する生物活性を有する。
１つ又は複数の実施形態では、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、心筋トロポニンＩとのＫＤは、≦７.５１×１０-8mol/Lであり、例えば４.８６×１０-8mol/L、５.１５×１０-8mol/L、３.１８×１０-8mol/L、１.０１×１０-9mol/L、３.７０×１０-9mol/L、５.４９×１０-9mol/L、７.９６×１０-9mol/L、９.５３×１０-9mol/L、２.２１×１０-10mol/L、５.３４×１０-10mol/L、８.１３×１０-10mol/L、９.６０×１０-10mol/Lであり、又は２.２１×１０-10mol/L≦ＫＤ≦７.５１×１０-8mol/Lであり、又は２.２１×１０-10mol/L≦ＫＤ≦９.５３×１０-9mol/Lであり、あるいは、ＫＤは、４.８６×１０-8mol/L、５.１５×１０-8mol/L、３.１８×１０-8mol/L、１.０１×１０-9mol/L、３.７０×１０-9mol/L、５.４９×１０-9mol/L、７.９６×１０-9mol/L、９.５３×１０-9mol/L、２.２１×１０-10mol/L、５.３４×１０-10mol/L、８.１３×１０-10mol/L又は９.６０×１０-10mol/L以下である。
親和性を本開示の明細書の方法で測定する。
１つ又は複数の実施形態では、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ１がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＤであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ３がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＶであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＴであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＱである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＴである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＳである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＴである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＳである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＲである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＫである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＦである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＷである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＦである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＹである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＷである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＴである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＳであり、Ｘ２がＳである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＴであり、Ｘ２がＴである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＴであり、Ｘ２がＳである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＩであり、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＬであり、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＱである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＮである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＱである。
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＮである。
１つ又は複数の実施形態では、各相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかである。
Figure 0007553433000002
１つ又は複数の実施形態では、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ１は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ２は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ３は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ４は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表す。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、少なくとも３つのＣＤＲｓを含むか、又は、前記結合タンパク質は、少なくとも６つのＣＤＲｓを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、可変領域及び定常領域を含む完全な抗体である。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、ナノ抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体最小識別単位のうちの１種である。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、配列が順に配列番号１乃至配列番号４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順に配列番号５乃至配列番号８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は、抗体定常領域の配列をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域の配列は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれかの定常領域の配列である。
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来する。
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域は、ラットに由来し、
軽鎖定常領域の配列は、配列番号９で示され、
重鎖定常領域の配列は、配列番号１０で示される。
本開示は、上記結合タンパク質をコードする分離される核酸をさらに提供する。
本明細書では、核酸は、保守的な置換の変異体（例えば縮重コドンの置換）及び相補配列を含む。用語「核酸」と「ポリヌクレオチド」は、同じ意味であり、遺伝子、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子及びそれらの断片、例えばオリゴヌクレオチドを含む。
本開示は、上記核酸を含むベクターをさらに提供する。
核酸配列が少なくとも１種の調節配列に操作可能に連結される。「操作可能に連結される」とは、コード配列がコード配列の発現を許可するように、調節配列に連結されることである。調節配列は、適切な宿主細胞において目的タンパク質の発現を指導するため選択され、プロモータ、エンハンサー及びその他の発現制御エレメントなどを含む。
本明細書では、ベクターは、本開示の核酸又はその断片を含んだ、遺伝情報を保有可能で、かつ遺伝情報を細胞内に送達できる分子又は試薬を意味することができる。典型的なベクターは、プラスミド、ウィルス、ファージ、コスミド及びミニ染色体を含む。ベクターは、クローンベクター（即ち、遺伝情報を細胞内に移すためのベクターである。前記細胞を増殖させられ、かつ前記遺伝情報の存在する細胞又は前記遺伝情報の存在しない細胞を選択することができる。）又は発現ベクター（即ち、前記ベクターの遺伝情報の細胞内での発現を可能にすることに必要な遺伝子エレメントを含むベクター）であってもよい。従って、クローンベクターは、選択マーカー、及び前記クローンベクターで指定された細胞タイプにマッチングする複製起点を含んでもよいが、発現ベクターは、指定された標的細胞での発現への影響に必要な調節エレメントを含む。
本開示の核酸又は断片を適切なベクターに挿入して、本開示の核酸断片を保有するクローンベクター又は発現ベクターを形成することができる。この新しいベクターは、本開示の一部である。前記ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体又はウィルスを含んでもよく、特定の細胞のみで一時的に発現される裸のＤＮＡを含んでもよい。本開示のクローンベクター及び発現ベクターが自発的に複製することができるため、この後のクローンの高レベルの発現又は高レベルの複製の目的のために、高いコピー数を提供することができる。発現ベクターは、本開示の核酸断片の発現を駆動するためのプロモータ、前記ペプチド発現産物の膜外への分泌又は膜への組み込みを可能にする信号ペプチドをコードする非強制的な核酸配列、本開示の核酸断片、及びターミネーターをコードする非強制的な核酸配列を含んでもよい。生産菌株又は細胞系において発現ベクターを操作するとき、ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞のゲノムに組み込んでもよく、宿主細胞ゲノムに組み込まなくてもよい。ベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるタグ配列を保有する。
本開示の発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に用いられる。この形質転換細胞は、本開示の一部であり、本開示の核酸断片及びベクターを増殖するための培養細胞又は細胞系であってもよく、又は、本開示のポリペプチドを組換え的に製造するための培養細胞又は細胞系であってもよい。本開示の形質転換細胞は、例えば細菌（例えば大腸菌、バチルスなど）の様な微生物を含む。宿主細胞は、真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞などの多細胞生物からの細胞、好ましくは、哺乳動物からの細胞、例えばＣＨＯ細胞を含む。前記形質転換細胞は、本開示の核酸断片を複製することができる。本開示のペプチド組合せを組換え的に製造するとき、前記発現産物は、培地に排出されるか、又は、前記形質転換細胞の表面に保有される。
本開示は、
培地において上記宿主細胞を培養し、生じた結合タンパク質を培地又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む、上記結合タンパク質の生産方法をさらに提供する。
前記方法は、例えば、少なくとも一部の結合タンパク質をコードする核酸ベクターで宿主細胞を形質転換し、適切な条件において該宿主細胞を培養することで、該結合タンパク質を発現させる。宿主細胞は、１つ以上の発現ベクターで形質転換されてもよく、該発現ベクターは、少なくとも一部の結合タンパク質をコードするＤＮＡを単独で又は結合して含んでもよい。通常のタンパク質及びペプチドの精製技術を利用することで、培地又は細胞溶解物から結合タンパク質を分離することができ、前記技術は、硫酸アンモニウム沈殿、分層析出（イオン交換、ゲルフィルター、親和クロマトグラフィーなど）及び／又は電気泳動を含む。
目的コーディング配列及び調節配列を含む適切なベクターの構築は、本分野における周知の基準連結及び制限技術で行われてもよい。分離されるプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成されるオリゴヌクレオチドを必要な形態で切断、テーリング及び再連結する。任意の方法でコーディング配列に突然変異を導入することで、本開示の変異体を生成することができ、これらの突然変異は、欠失、挿入や置換などを含んでもよい。
本開示は、ｃＴｎＩのエピトープと反応できる、モノクローナル及びポリクローナルの抗体を含む抗体を提供する。該抗体は、完全な結合タンパク質、又はその断片又は誘導体を含んでもよい。好ましくは、抗体は、全部又は一部の結合タンパク質を含む。
本開示は、上記結合タンパク質の、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害を診断するための診断剤又はキットの製造における使用をさらに提供する。
本開示の一態様によれば、本開示は、
テストサンプル中のトロポニンＩ抗原の検出方法であって、
ａ）十分に抗体／抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のトロポニンＩ抗原を上記の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと
ｂ）前記テストサンプル中の前記トロポニンＩ抗原の存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップとを含む、検出方法にさらに関し、
この実施形態では、信号強度を示す指示薬で前記結合タンパク質を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
１つ又は複数の実施形態では、前記トロポニンＩ抗原は、心筋トロポニンＩ抗原である。
１つ又は複数の実施形態では、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第２の抗体をさらに含み、
この実施形態では、前記結合タンパク質は、第１の抗体の形態で前記第２の抗体とペア抗体を形成し、ｃＴｎＩの異なる抗原エピトープに結合するために用いられ、
信号強度を示す指示薬で前記第２の抗体を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
１つ又は複数の実施形態では、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記トロポニンＩの抗原に結合される第２の抗体をさらに含み、
この実施形態では、前記結合タンパク質が前記第２の抗体の抗原とされており、信号強度を示す指示薬で前記の第２の抗体を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
１つ又は複数の実施形態では、前記信号強度を示す指示薬は、蛍光物質、量子ドット、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン、放射性同位体、放射性造影剤、常磁性イオン蛍光マイクロスフェア、高電子密度物質、化学発光マーカー、超音波造影剤、光増感剤、金コロイド又は酵素のうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記蛍光物質は、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４０５、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、５－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、５－カルボキシル基－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミン、６－カルボキシローダミン、６－カルボキシテトラメチルローダミン、ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６－ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フルオレセイン、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、ＮＢＤ（７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、オルソフタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、アントシアン、キサンチン、サクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプタート、ユウロピウムトリスビピリジルジアミン、ユウロピウムクリプタート又はユウロピウムキレート、ジアミン、ジシアニン、ＬａＪｏｌｌａ青色色素、アロフィコシアニン、ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリトロシアニン、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ローダミンイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドのうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記放射性同位体は、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94ｍＴｃ、94Ｔｃ、99ｍＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154-158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52ｍＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ及び83Ｓｒのうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記酵素は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びグルコースオキシダーゼのうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記蛍光マイクロスフェアは、内部に希土類蛍光イオンユウロピウムが包まれるポリスチレン蛍光マイクロスフェアである。
一部のさらなる実施形態では、本開示は、上記結合タンパク質、上記分離される核酸又は上記ベクターのうちの１種又は複数種を含むキットをさらに提供する。
好ましくは、前記キットは、前記結合タンパク質を標識するためのマーカーを含む。
実施案では、本開示は、例えば心筋細胞感染の被験者中のトロポニンＩの存在を決定するためのキットを提供し、前記キットは、本開示に係る少なくとも１種の結合タンパク質、関連する緩衝剤、液体サンプルと前記結合タンパク質の反応に必要な試薬、及びトロポニンＩと結合タンパク質に陽性又は陰性結合反応が存在することを決定するための試薬を含む。トロポニンＩの存在を決定するために、前記キットは、例えば、標識付きの結合タンパク質を抗体として利用し、前記標識は、金コロイド標識などの任意の適切な標識であってもよい。
本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質の、心筋トロポニンＩに関連する疾病の診断における使用にさらに関する。
本明細書で使用されるとおり、用語「心筋トロポニンＩに関連する疾病」とは、心筋トロポニンＩをマーカー（そのタンパク質又はコード核酸を含む）とする疾病である。特に、本開示の１つ又は複数の実施形態では、心筋トロポニンＩに関連する疾病は、血液中の心筋トロポニンＩレベルが高くなることを特徴とする疾病であってもよい。本開示の１つ又は複数の実施形態では、心筋トロポニンＩに関連する疾病は、心筋組織又は心筋細胞中の心筋トロポニンＩレベルが低くなることを特徴とする疾病であってもよい。
本開示は、
Ａ）十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
Ｂ）結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンＩに関連する疾病の存在を指示する、心筋トロポニンＩに関連する疾病の診断方法にさらに関する。
１つ又は複数の実施形態では、前記方法は、蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び／又は酵素結合免疫技術に基づくものである。
１つ又は複数の実施形態では、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも１種である。
１つ又は複数の実施形態では、前記被験者は、哺乳動物であり、例えば霊長類動物であり、例えばヒトである。
１つ又は複数の実施形態では、心筋トロポニンＩに関連する前記疾病は、心血管疾患である。
１つ又は複数の実施形態では、心筋トロポニンＩに関連する前記疾病は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害又はこれらの組合せで構成される群から選ばれる。
以下、本開示を例示的に説明するための一部の例を提供するが、本開示の範囲を制限するものではない。
実施例１
本実施例では、制限エンドヌクレアーゼ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｋａｒａ社から購入された。ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ抽出キットは、ＴＯＹＯＢＯ社から購入された。ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキットは、Ｔａｋａｒａ社から購入された。ｐＭＤ－１８Ｔベクターは、Ｔａｋａｒａ社から購入された。プラスミド抽出キットは、天根公司から購入された。プライマー合成及び遺伝子の配列測定は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社で完了された。Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ ７Ｂ９モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株は、本出願者が有するハイブリドーマ細胞株であり、復活された。
１、プライマー
重鎖及び軽鎖５’ＲＡＣＥプライマーの増幅：
ＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド：
５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ－３’、
５’－ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（５’－ＣＤＳ）：５’－（Ｔ）２５ＶＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｇ、又はＣ）、
ユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）：５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’、
ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’、
ｍＩｇ－ＫＲ：５’－ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ－３’、
ｍＩｇ－ＨＲ：５’－ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ－３’。
２、抗体の可変領域遺伝子クローン及び序列測定
Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ ７Ｂ９モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキット及びキットにおけるＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド及び５’－ＣＤＳプライマーで第一鎖ｃＤＮＡの合成を行い、取得された第一鎖ｃＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅テンプレートとした。軽鎖遺伝子をユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）、ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＩｇ－ＫＲプライマーで増幅させ、重鎖遺伝子をユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）、ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＩｇ－ＨＲプライマーで増幅させた。軽鎖のプライマーペアにより０．７ＫＢほどの目的バンドを増幅し出し、重鎖のプライマーペアにより１．４ＫＢほどの目的バンドを増幅し出した。アガロースゲル電気泳動で精製回収し、産物をｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでＡ付加反応（Ａを付加する反応）を行ってｐＭＤ－１８Ｔベクターに挿入し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、コロニが成長した後、それぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子クローンの４つのクローンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送って序列測定を行った。
３、Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ ７Ｂ９抗体の可変領域遺伝子の配列分析
上記序列測定して得られた遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベースに入れて分析し、ＶＮＴＩ１１．５ソフトウェアを利用して分析して、重鎖及び軽鎖プライマーペアの増幅した遺伝子が全て正確であると決定し、ここで、軽鎖の増幅した遺伝子断片では、ＶＬ遺伝子配列は３２１ｂｐであり、ＶｋＩＩ遺伝子ファミリに属し、その前に５７ｂｐのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアの増幅した遺伝子断片では、ＶＨ遺伝子配列は３５７ｂｐであり、ＶＨ１遺伝子ファミリに属し、その前に５７ｂｐのリーダーペプチド配列があった。
４、組換え抗体発現プラスミドの構築
ｐｃＤＮＡTM ３.４ ＴＯＰＯ(登録商標)ベクターは、構築された組換え抗体の真核発現ベクターであり、該発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどのポリクローナル酵素切断部位が導入されており、ｐｃＤＮＡ ３．４Ａ発現ベクターとして命名され、以下、３．４Ａ発現ベクターと略称される。上記ｐＭＤ－１８Ｔにおける抗体遺伝子の配列決定結果に基づき、Ａｎｔｉ－ｃＴｎＩ ７Ｂ９抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子特異性プライマーを設計し、プライマーの両端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素切断部位及び保護塩基を持ち、プライマーは、以下のとおりであった。
ｃＴｎＩ－７Ｂ９－ＨＦ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣ－３’、
ｃＴｎＩ－７Ｂ９－ＨＲ：５’－ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ－３’、
ｃＴｎＩ－７Ｂ９－ＬＦ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧ－３’、
ｃＴｎＩ－７Ｂ９－ＬＲ：５’－ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡ－３’。
ＰＣＲ増幅方法により０．７２ＫＢの軽鎖遺伝子断片及び１．４ＫＢの重鎖遺伝子断片を増幅させた。重鎖及び軽鎖遺伝子断片をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重酵素切断し、３．４ＡベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重酵素切断し、また、断片及びベクターを精製回収した後に、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそれぞれ３．４Ａ発現ベクターに連結し、それぞれ重鎖及び軽鎖の組換え発現プラスミドを得た。
５、安定細胞株のスクリーニング
５.１ プラスミドを超純水で４００ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整し、１００μlのプラスミドを７００μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、３日目、５日目、７日目にサンプリングして計数し、７日目にサンプリングして検出した。
対応する抗原を、コーティング液で指定された濃度に希釈し、１００μL/ウェルで、４℃で一夜コーティングし、次の日に、洗浄液で２回洗浄し、たたいて乾かし、ブロッキング液（２０％のＢＳＡ＋８０％のＰＢＳ）を１２０μL/ウェルで加え、３７℃で１ｈブロッキングし、たたいて乾かし、希釈された細胞上清を１００μL/ウェルで加え、３７℃で３０min放置し（一部の上清１ｈ）、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１００μL/ウェルで加え、３７℃で３０min放置し、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、発色液Ａ液（５０μL/ウェル）を加え、発色液Ｂ液（５０μL/ウェル）を加え、１０min発色し、ストップバッファーを５０μL/ウェルで加え、マイクロプレートリーダーの４５０nm（参照として６３０nm）でＯＤ値を読み取った。基準品濃度及びＯＤ値で基準曲線を作成し、細胞上清中の抗体含有量を計算した。
５.２ 組換え抗体発現プラスミドの線形化
Ｂｕｆｆｅｒ ５０μl、ＤＮＡ １００μg/チューブ、Ｐｕｖ Ｉ酵素 １０μlという試薬を用意し、無菌水で５００μlに補充し、３７℃で一晩水浴しながら酵素切断し、まず等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（下層）２５:２４:１で抽出し、次にクロロホルム（水相）で抽出し、０．１倍の体積（水相）の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍の体積のエタノールで氷において沈殿させ、７０％のエタノールで沈殿を洗浄し、有機溶剤を除去し、エタノールが完全に揮発した後に、適量の滅菌水で再び溶かし、最後に濃度を測定した。
組換え抗体発現プラスミドを安定して導入させること、及び安定した細胞株を加圧してスクリーニングすること。
プラスミドを超純水で４００ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整し、１００μlのプラスミドを７００μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、次の日に計数し、２５μmol/Lのメチオニンスルホキシミンを９６ウェルに入れて約２５日加圧培養した。
細胞が成長したクローンウェルを顕微鏡で観察して標識し、合流度を記録し、培養された上清をサンプリングして検出し、抗体の濃度、相対濃度が高い細胞株を選択して２４ウェルに移し、３日ほど後に、６ウェルに移し、３日後に保存してバッチ培養し、細胞密度を０.５×１０6cells/mlに調整し、２.２mlバッチ培養を行い、細胞密度０.３×１０6cells/mlで２ml保存し、また、７日間、６ウェルのバッチ培養された上清をサンプリングして検出し、抗体濃度及び細胞直径が小さい細胞株を選択してＴＰＰに移して保存して継代培養を行った。
６、組換え抗体の生産
６.１ 細胞の拡大培養
細胞を復活させた後に、まず１２５ml仕様の振とうフラスコにおいて培養し、接種体積が３０mlであり、培地が１００％のＤｙｎａｍｉｓ培地であり、回転数が１２０r/minで、温度が３７℃で、二酸化炭素が８％である揺とう器に置いた。７２ｈ培養し、５０万cells/mlの接種密度で接種して拡大培養を行い、拡大培養体積を生産需要に応じて計算し、培地が１００％のＤｙｎａｍｉｓ培地であった。次に７２ｈおきに１回拡大培養した。細胞量が生産ニーズを満たすとき、接種密度を５０万cells/mlほどに厳密に制御して生産した。
６．２ 振とうフラスコ生産及び精製
振とうフラスコパラメータは、回転数１２０ｒ／ｍｉｎ、温度３７℃、二酸化炭素８％であった。材料の流加供給：振とうフラスコにおいて７２ｈ培養してから、毎日に供給し、ＨｙＣｌｏｎｅＴＭ Ｃｅｌｌ ＢｏｏｓｔＴＭ Ｆｅｅｄ ７ａは、毎日に初期培養体積の３％を流加し、Ｆｅｅｄ ７ｂの毎日の流加量は、初期培養体積の千分の一であり、１２日目まで補充した（１２日目に供給した）。グルコース３ｇ／Ｌを６日目に供給した。１３日目にサンプリングした。ｐｒｏｔｅｉｎＡ親和クロマトグラフィーカラムで親和精製を行った。精製後に５００ｍｇの組換え抗体を獲得し、４μｇの精製された抗体に対して還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に２本のバンドが示され、一方が２５ＫＤほどの軽鎖（配列は、配列番号１１で示される）であり、他方が５０ＫＤほどの重鎖（配列は、配列番号１２で示される）である。
実施例２
実施例１で得られたサンプル１の抗体（配列が配列番号１１及び１２で示される軽鎖及び重鎖を有する）は、ｃＴｎＩタンパク質に結合する能力を有するが、親和性及び抗体活性がいずれも十分に理想的ではないため、出願者は、該抗体の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲに対して突然変異を行った。
分析によれば、重鎖の相補性決定領域（ＷＴ）：
ＣＤＲ－ＶＨ１はＡ－Ｓ－Ｄ（Ｘ１）－Ｙ－Ｔ－Ｆ－Ｓ（Ｘ２）－Ｔ（Ｘ３）－Ｙ－Ｗ－Ｍ－Ｙであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２はＹ－Ｌ（Ｘ１）－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｓ（Ｘ２）－Ｇ－Ｈ－Ｔ－Ｅ（Ｘ３）－Ｙ－Ｎ－Ｑ－Ｒ（Ｘ４）－Ｆ－Ｋ－Ｄであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３はＡ－Ｒ－Ｋ（Ｘ１）－Ｙ－Ｆ（Ｘ２）－Ｇ－Ｐ－Ｆ－Ａ（Ｘ３）－Ｍ－Ｄであり、
軽鎖の相補性決定領域：
ＣＤＲ－ＶＬ１はＳ－Ａ－Ｓ－Ｔ（Ｘ１）－Ｔ（Ｘ２）－Ｖ－Ｓ－Ｙ－Ａ（Ｘ３）－Ｈであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２はＷ－Ｌ（Ｘ１）－Ｙ－Ｄ－Ｓ（Ｘ２）－Ｓ－Ｋ－Ｉ（Ｘ３）－Ａ－Ｓであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３はＱ－Ｎ（Ｘ１）－Ｗ－Ｓ－Ｔ（Ｘ２）－Ｑ（Ｘ３）－Ｐ－Ｙ－Ｔであり、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４がいずれも突然変異部位であった。
Figure 0007553433000003
突然変異後に抗体活性を検出し、コーティング液でヤギ抗マウスＩｇＧを１μg/mlに希釈して、１００μL/ウェルで４℃下、マイクロプレートに一晩コーティングし、次の日に、洗浄液で２回洗浄し、たたいて乾かし、ブロッキング液（２０％のＢＳＡ＋８０％のＰＢＳ）を１２０μL/ウェルで加え、３７℃で１ｈブロッキングし、たたいて乾かし、希釈されたｃＴｎＩモノクローナル抗体を１００μL/ウェルで加え、３７℃で６０min放置し、ウェル内の液体を振り切り、たたいて乾かし、２０％のマウス陰性血を１２０μL/ウェルで加えて、３７℃で１ｈブロッキングし、ウェル内の液体を振り切り、たたいて乾かし、希釈されたｃＴｎＩ抗原（０．１５μg/ml）を１００μL/ウェルで加え、３７℃で４０min放置し、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、ＨＲＰ標識の他のｃＴｎＩモノクローナル抗体（１：５Ｋ）を１００μL/ウェルで加え、３７℃で３０min放置し、発色液Ａ液（５０μL/ウェル）を加え、発色液Ｂ液（５０μL/ウェル）を加え、１０min発色し、ストップバッファーを５０μL/ウェルで加え、マイクロプレートリーダーから４５０nm（参照として６３０nm）でＯＤ値を読み取った。
一部の結果は、以下のとおりであった。
Figure 0007553433000004
親和性分析
ＡＭＣセンサを利用して、精製された抗体をＰＢＳＴにて１０μg/mlに希釈し、また、ｃＴｎＩコントロール遺伝子組換えタンパク質（会社調製の組換え抗原）を、ＰＢＳＴにて、７６９.２nmol/ml、３８４.６nmol/ml、１９２.３nmol/ml、９６.２nmol/ml、４８.１nmol/ml、２４nmol/ml、１２nmol/ml、０nmol/mlという風に段階希釈した。
実行プロセス：緩衝液１（ＰＢＳＴ）において６０ｓ平衡させ、抗体溶液において抗体を３００ｓ固化し、そして、緩衝液２（ＰＢＳＴ）において１８０ｓインキュベートし、抗原溶液において４２０ｓ結合し、緩衝液２において１２００ｓ解離し、ｐＨが１.６９の１０ｍＭのＧＬＹ溶液及び緩衝液３でセンサ再生を行い、データを出力した。
ＫＤは、平衡解離定数即ち親和性を表し、Ｋｏｎは、結合レートを表し、Ｋｄｉｓは、解離レートを表した。
Figure 0007553433000005
表２及び表３から分かるように、突然変異１の活性効果及び親和性が最適であるため、突然変異１をフレームワーク配列として力価が高い突然変異部位をスクリーニングし（スクリーニングして得られた抗体活性が突然変異１に類似し、抗体活性が±１０％であることを確保する）、一部の結果は以下のとおりであった。
Figure 0007553433000006
親和性分析の方法は以上と同じであり、結果は表５に示された。
Figure 0007553433000007
表５から分かるように、表４にリストされた突然変異部位は、抗体の親和性への影響が大きくなかった。
上記結果を検証するために、ＷＴをフレームワーク配列として上記実験を繰り返し、突然変異部位の親和性検証を行い、一部の結果は以下のとおりであった。
Figure 0007553433000008
Figure 0007553433000009
表６及び表７から分析することで、ＷＴに基づく突然変異抗体も、一定の親和性を有した。
なお、以上の各実施例は、本開示の技術的解決手段を説明するためのものに過ぎず、制限するものではなく、前述した各実施例を参照しながら本開示について詳細に説明するが、当業者であれば、前述した各実施例に記載の技術的解決手段を修正することができ、又は、その一部の又は全部の技術特徴に対して等価置換を行うことができ、これらの修正や置換により、対応する技術的解決手段の実質が本開示の各実施例の技術的解決手段の範囲から逸脱することないことを理解すべきである。
本開示に係る心筋トロポニンＩに結合される抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質は、特定の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む。該結合タンパク質は、心筋トロポニンＩタンパク質を特異的に識別して結合することができ、高い感度及び特異性を有し、特に、該結合タンパク質は、ヒトのｃＴｎＩタンパク質と非常に高い親和性を有する。それにより、心筋トロポニンＩに関連する疾病の検出及び診断を実現する。

Claims (17)

  1. 抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質であって、
    前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列の６つの相補性決定領域を含み、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１はＡ－Ｓ－Ｘ１－Ｙ－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｘ３－Ｙ－Ｗ－Ｍ－Ｙであり、ここで、Ｘ１がＧであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２はＹ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｓ－Ｘ２－Ｇ－Ｈ－Ｔ－Ｘ３－Ｙ－Ｎ－Ｑ－Ｘ４－Ｆ－Ｋ－Ｄであり、ここで、Ｘ３がＤであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３はＡ－Ｒ－Ｘ１－Ｙ－Ｘ２－Ｇ－Ｐ－Ｆ－Ｘ３－Ｍ－Ｄであり、ここで、Ｘ３がＧであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１はＳ－Ａ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｖ－Ｓ－Ｙ－Ｘ３－Ｈであり、ここで、Ｘ３がＶであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２はＷ－Ｘ１－Ｙ－Ｄ－Ｘ２－Ｓ－Ｋ－Ｘ３－Ａ－Ｓであり、ここで、Ｘ２がＴであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３はＱ－Ｘ１－Ｗ－Ｓ－Ｘ２－Ｘ３－Ｐ－Ｙ－Ｔであり、ここで、Ｘ１がＱであり、
    ６つの前記相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかの１種であり、
    配列が順に配列番号ｌ乃至配列番号４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び、配列が順に配列番号５乃至配列番号８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む、
    ことを特徴とする結合タンパク質
    Figure 0007553433000010
    。
  2. Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび二重特異性抗体のうちの１つである、ことを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
  3. 抗体定常領域の配列をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
  4. 前記定常領域の配列は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれかの定常領域の配列である、ことを特徴とする請求項３に記載の結合タンパク質。
  5. 前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトに由来する、ことを特徴とする請求項３に記載の結合タンパク質。
  6. 前記定常領域はマウスに由来し、
    軽鎖定常領域の配列は配列番号９で示される、
    重鎖定常領域の配列は配列番号１０で示される、
    ことを特徴とする請求項５に記載の結合タンパク質。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードする、
    ことを特徴とする分離される核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸を含む、
    ことを特徴とするベクター。
  9. 請求項７に記載の核酸又は請求項８に記載のベクターを含む、
    ことを特徴とする宿主細胞。
  10. 培地において請求項９に記載の宿主細胞を培養し、生じた結合タンパク質を培地又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む、
    ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質の生産方法。
  11. 請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質の、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害を診断するための診断剤又はキットの製造における使用。
  12. 請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質、請求項７に記載の分離される核酸又は請求項８に記載のベクターのうちの１種又は複数種を含む、ことを特徴とするキット。
  13. 前記結合タンパク質を標識するためのマーカーをさらに含む、
    ことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
  14. テストサンプル中のトロポニンＩ抗原の検出方法であって、
    ａ）十分に抗体／抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のトロポニンＩ抗原を請求項１に記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと
    ｂ）前記テストサンプル中の前記トロポニンＩ抗原の存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップとを含む、検出方法。
  15. 前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第２の抗体をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記トロポニンＩ抗原に結合される第２の抗体をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記トロポニンＩ抗原が心筋トロポニンＩ抗原である、請求項１４に記載の方法。
JP2021513274A 2018-10-10 2019-09-27 抗ヒト心筋トロポニンｉの抗体及びその使用 Active JP7553433B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811183025.4A CN111018980B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN201811183025.4 2018-10-10
PCT/CN2019/108683 WO2020073833A1 (zh) 2018-10-10 2019-09-27 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022503675A JP2022503675A (ja) 2022-01-12
JP7553433B2 true JP7553433B2 (ja) 2024-09-18

Family

ID=70164827

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021513274A Active JP7553433B2 (ja) 2018-10-10 2019-09-27 抗ヒト心筋トロポニンｉの抗体及びその使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220033483A1 (ja)
EP (1) EP3862364A4 (ja)
JP (1) JP7553433B2 (ja)
KR (1) KR20210056398A (ja)
CN (1) CN111018980B (ja)
WO (1) WO2020073833A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942416A (zh) 2010-07-23 2011-01-12 中国医学科学院放射医学研究所 抗人心肌肌钙蛋白i特异性单克隆抗体及其制备方法
JP2012518418A (ja) 2009-02-24 2012-08-16 アボット・ラボラトリーズ トロポニンｉに対する抗体およびこれらの使用法
CN103694355A (zh) 2013-12-11 2014-04-02 深圳市菲鹏生物股份有限公司 抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体及其构建方法和应用
CN107561289A (zh) 2017-09-06 2018-01-09 暨南大学 人心肌肌钙蛋白i的双抗夹心elisa检测试剂盒
CN107557345A (zh) 2017-09-06 2018-01-09 暨南大学 人心肌肌钙蛋白i的杂交瘤细胞株7d2及单克隆抗体和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1130032A1 (en) * 2000-02-28 2001-09-05 Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH (GBF) Single-chain antibodies recognizing the human vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2/KDR)
FI20030652A0 (fi) * 2003-04-30 2003-04-30 Susann Eriksson Parannettu immunomääritys
US20060134698A1 (en) * 2004-12-20 2006-06-22 Evanston Northwestern Healthcare Research Institute Methods for treating cardiac disease by modifying an N-terminal domain of troponin I
US20060275849A1 (en) * 2005-06-07 2006-12-07 Beckman Coulter, Inc. Monoclonal antibody reagents
CN1982337A (zh) * 2005-12-14 2007-06-20 中国医学科学院放射医学研究所 抗人心肌肌钙蛋白i合成多肽抗体及其制备方法与应用
JP2016141649A (ja) * 2015-02-02 2016-08-08 東ソー株式会社 ペプチド及びそれを用いて作製した抗心筋トロポニンｉ抗体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012518418A (ja) 2009-02-24 2012-08-16 アボット・ラボラトリーズ トロポニンｉに対する抗体およびこれらの使用法
CN101942416A (zh) 2010-07-23 2011-01-12 中国医学科学院放射医学研究所 抗人心肌肌钙蛋白i特异性单克隆抗体及其制备方法
CN103694355A (zh) 2013-12-11 2014-04-02 深圳市菲鹏生物股份有限公司 抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体及其构建方法和应用
CN107561289A (zh) 2017-09-06 2018-01-09 暨南大学 人心肌肌钙蛋白i的双抗夹心elisa检测试剂盒
CN107557345A (zh) 2017-09-06 2018-01-09 暨南大学 人心肌肌钙蛋白i的杂交瘤细胞株7d2及单克隆抗体和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111018980B (zh) 2021-12-03
EP3862364A4 (en) 2022-06-15
KR20210056398A (ko) 2021-05-18
US20220033483A1 (en) 2022-02-03
JP2022503675A (ja) 2022-01-12
WO2020073833A1 (zh) 2020-04-16
EP3862364A1 (en) 2021-08-11
CN111018980A (zh) 2020-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102671155B1 (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질
WO2020043068A1 (zh) 一种ns1蛋白的结合蛋白以及应用
JP7339338B2 (ja) 抗ヒトｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体
CN111217912B (zh) 一种抗pgⅱ的抗体及其应用
JP7307158B2 (ja) 抗ヒト心筋型トロポニンｉ抗体及びその応用
JP7439108B2 (ja) ヒト心筋トロポニンｉに対する組換え抗体
CN111349168B (zh) 一种抗人ckmb的抗体及其应用
CN113004405B (zh) 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的分离的结合蛋白
JP7553433B2 (ja) 抗ヒト心筋トロポニンｉの抗体及びその使用
CN112745390B (zh) 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白
CN111018991B (zh) 一种抗ca50的抗体及其应用
CN111018979B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN111018981B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN111217913A (zh) 一种抗pg ii的抗体及其应用
CN111018978B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN111018982B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的抗体及其应用
CN112707964B (zh) 一种抗n末端脑钠肽前体的重组抗体
CN111018977B (zh) 一种抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体
CN112920272B (zh) 抗cTnI的蛋白和检测cTnI的方法
CN112979799B (zh) 一种包含血红蛋白抗原结构域的结合蛋白
CN112979811A (zh) 一种鳞状细胞癌抗原的结合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210304

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210304

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20210728

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20210728

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220426

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220726

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230104

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20230104

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230117

C11 Written invitation by the commissioner to file amendments

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11

Effective date: 20230117

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20230118

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20230124

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20230303

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20230307

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240905

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7553433

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150