CN107557345A

CN107557345A - 人心肌肌钙蛋白i的杂交瘤细胞株7d2及单克隆抗体和应用

Info

Publication number: CN107557345A
Application number: CN201710796104.1A
Authority: CN
Inventors: 王宏; 余娟; 李文丽
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN107557345B

Abstract

本发明公开了人心肌肌钙蛋白I的杂交瘤细胞株7D2及单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017120。杂交瘤细胞株7D2分泌的单克隆抗体7D2是一种高亲和力、高特异性的cTnI鼠源性单克隆抗体，能够结合游离的cTnI、二聚体复合物cTnI‑C、三聚体复合物cTnI‑T‑C三种形式的cTnI，因此可以用于检测血清中cTnI含量，为开发快速检测心肌梗塞试剂盒奠定基础。

Description

人心肌肌钙蛋白I的杂交瘤细胞株7D2及单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫技术领域，更具体地，涉及人心肌肌钙蛋白I的杂交瘤细胞株7D2及单克隆抗体和应用。

背景技术

心肌肌钙蛋白是调控心脏收缩的关键蛋白。由心肌肌钙蛋白I（cTnI）、心肌肌钙蛋白C（cTnC）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）三个亚基组成的三聚体复合物。cTnI是肌动蛋白的抑制亚基，通过抑制肌动蛋白的三磷酸腺苷（ATPase）的活性来调控肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。cTnI的分子量约为24kDa，由209个氨基酸组成，是一种富含α螺旋的蛋白，理论等电点为9.87。TnI（肌钙蛋白I）存在三种亚型：骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）中存在快骨骼肌型和慢骨骼肌型，它们具有相似的分子量（20KD），但二者之间的氨基酸序列约存在40%的差异；第三种为心肌型。心肌肌钙蛋白I（cTnI）与骨骼肌型的氨基酸序列也存在40%的差异，cTnI末端比sTnI末端多31个氨基酸，并且cTnI在心肌细胞中只存在一种亚型，决定了cTnI在心肌细胞中的特异性。cTnI分子的第22位和第23位是丝氨酸。这两个氨基酸都可以在体内被蛋白激酶A磷酸化，因而在体内cTnI存在四种不同磷酸化类型。

急性心肌梗塞（Acute myocardial infarction, AMI）是最常见的心血管疾病之一，是在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血所导致的冠状动脉病变，最终引起心肌的缺血性坏死。病情严重时，心脏无法再行使其泵血的功能，会导致病人突然死亡。因此，急性心肌梗塞的早期诊断对于其预防和治疗是非常重要的。cTnI被研究者认为是AMI诊断最好的生物指标之一，由于其在心肌受损时才在血液中出现，并且出现时间早，持续时间久，特异性强，因此国际临床化学联盟（IFCC）、美国临床生化学会（NACB）和中华医学检验分会等权威机构已经将cTnI作为AMI诊断的“金标准”。

在心肌梗塞标志物中，cTnI被认为是比其他标志物更灵敏，特异性更高的“金标”。当心肌细胞的细胞膜完整时，cTnI是不能够透过细胞膜进入到血液中的。只有当心肌细胞受损时，cTnI迅速从心肌细胞释放到血液中，2～8小时内开始升高，在1-2天内达到顶峰，并且在3-8天后仍然能测到cTnI的量在升高，理论上cTnI在血清中维持的时间超过10天，较久的诊断窗口期对于心肌梗塞的诊断是非常重要的。研究证明，正常人和心肌梗塞患者血清中cTnI的临界值是50pg/mL，发病时血中浓度可达100～300ug/L。在血液中大部分的cTnI是以cTnI-T-C或者cTnI-C复合物的形式存在。在研究中发现cTnI开始是以单体的形式释放到血液中，但是随着心肌损伤程度增加，为了防止cTnI被降解，cTnI会以复合物的形式存在，接着由于各种因素的影响，复合物又分解成单体，所以用于检测cTnI的抗体应该能以同样的效率识别血液中各种复合形式的cTnI，而现有技术中严重缺乏这样的单克隆抗体资源。

发明内容

本发明为了克服现有技术中的上述不足，提供一株人心肌肌钙蛋白I的杂交瘤细胞株7D2。

本发明的另一个目的是提供上述杂交瘤细胞株7D2分泌的单克隆抗体，单克隆抗体命名为人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2，单克隆抗体7D2是一种高亲和力、高特异性的cTnI鼠源性单克隆抗体，能够结合游离的cTnI、二聚体复合物cTnI-C、三聚体复合物cTnI-T-C三种形式的cTnI，因此可以用于检测血清中cTnI含量，为开发快速检测心肌梗塞试剂盒奠定基础。

本发明的第三个目的是提供人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2在检测游离的cTnI、二聚体复合物cTnI-C、三聚体复合物cTnI-T-C三种形式的cTnI中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一株人心肌肌钙蛋白I的杂交瘤细胞株7D2，所述杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017120。保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。

如上所述的杂交瘤细胞株7D2分泌的人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2。人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2的可变区基因包括重链可变区基因和轻链可变区基因，单克隆抗体7D2的轻重链氨基酸序列如图1所示。

如上所述人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2在检测游离的cTnI、二聚体复合物cTnI-C、三聚体复合物cTnI-T-C三种形式的cTnI中的应用。

单克隆抗体7D2是利用cTnI上的13-24位氨基酸表位，偶联载体蛋白BSA，形成的完全抗原免疫小鼠所制备的单克隆抗体，具体制备方法如下：合成cTnI上的13-24位氨基酸表位，偶联载体蛋白BSA，形成的完全抗原，免疫Balb/c小鼠，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞株，经过三次有限稀释克隆技术获得能够分泌稳定抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水型单抗，纯化后得到单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2是一种高亲和力、高特异性的cTnI鼠源性单克隆抗体，能够结合游离的cTnI、二聚体复合物cTnI-C、三聚体复合物cTnI-T-C三种形式的cTnI，因此可以用于检测血清中cTnI含量，为开发快速检测心肌梗塞试剂盒奠定基础。

附图说明

图1为抗体7D2轻重链可变区的3个CDR（互补决定簇）区。

图2为抗体7H4轻重链可变区的3个CDR（互补决定簇）区。

图3为抗体7D2和7H4纯化后的SDS-PAGE检测图，其中，1为蛋白Marker，2为7D2，3为7H4。

图4为抗体7D2和7H4的效价检测ELISA结果图，其中，图A为7D2，图B为7H4。

图5为抗体7D2和7H4的亲和力常数检测ELISA图，其中，图A为7D2，图B为7H4。

图6为抗体7D2和7H4的与cTnI和cTnI-C反应图，其中，图A为cTnI单体，图B为cTnI-C复合物。

图7为7D2/HRP-7H4和7H4/HRP-7D2的检测曲线。

图8 为7D2/HRP-7H4检测标准曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体的制备，包括如下步骤：

一、抗原

单克隆抗体7D2是通过用cTnI上13-24位氨基酸与BSA偶联的完全抗原免疫Balb/c小鼠制备出来的单抗，所述含cTnI上13-24位氨基酸的完全抗原的制备方法为：用DiscoveryStudio4.0软件模拟cTnI-T-C结构，在cTnI亚基上分析抗原表位，挑选出第13-24位氨基酸作为表位抗原。合成cTnI上13-24位氨基酸并与BSA偶联形成完全抗原，此步骤由杭州中肽公司合成。

单克隆抗体7H4抗体是通过用全蛋白复合物cTnI-T-C免疫Balb/c小鼠制备出来的单抗，其中，cTnI-T-C从芬兰Hytest公司购买。

二、杂交瘤细胞株的制备：杂交瘤细胞株7D2和杂交瘤细胞株7H4的制备方法相同，二者只是使用不同的抗原，制备方法具体如下：

1、动物免疫

(1)初次免疫：50μg抗原与等体积完全弗氏佐剂体积进行乳化，皮下多点注射；

(2)加强免疫：间隔2周，与初次免疫同样的抗原量与等体积不完全弗氏佐剂乳化，皮下多点注射；于第3-5次免疫10天后采血测其效价；

(3)在融合前72小时，腹腔注射不加佐剂的抗原25μg。

2、细胞融合

(1)骨髓瘤细胞SP2/0的饲养。融合前十天复苏冻存的SP2/0细胞，并进行扩大培养。取一部分SP2/0用HAT培养基培养24小时，观察细胞是否会凋亡。

(2)饲养细胞准备：融合前一天取健康的Balb/c小鼠的饲养细胞进行铺板，细胞浓度为细胞至1×10⁵个/mL，每孔100 μL。

(3)SP2/0的准备。把细胞轻轻吹下来，收集至离心管中，记下溶液总体积，混匀并取少量细胞适当稀释后进行计数。脾细胞的准备。取出融合小鼠的脾脏，用1640基础培养基冲洗脾脏，且使脾脏处于湿润的环境中，研磨脾脏，用基础培养基冲洗残留在针芯和滤网上的脾脏细胞，收集研磨液，记录总体积。取部分研磨液进行计数。

(4)SP2/0细胞和脾细胞按照1:5～1:10的比例在离心管中混匀，1000rpm/min离心7 min，弃上清。加入1mL已经在37℃水中预热好的PEG，接着滴入已经预热好的15mL的1640基础培养基终止反应，1000 rpm/min离心7min，弃上清，加入HAT完全培养基重悬，每孔加入100μL，放置细胞培养箱中培养，五天后观察融合结果。

3、阳性细胞筛选与克隆化

(1)在融合后第五天观察细胞，对细胞团较大的孔进行换液，第三天取细胞上清液到包被有50ng/孔抗原的板中，ELISA试验检测，阳性孔需要再换一次液，隔天再次检测，对两次都检测为阳性的孔进行克隆化。

(2)用有限稀释法对阳性细胞进行克隆化，一般要进行三次克隆化。

经过阳性细胞筛选与克隆化后，筛选到杂交瘤细胞株7D2和杂交瘤细胞株7H4，二者分别于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），杂交瘤细胞株7D2的保藏编号为CCTCC NO：C2017120，杂交瘤细胞株7H4的保藏编号为CCTCC NO：C2017120。保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。

三、单克隆抗体的制备：

由杂交瘤细胞株7D2制备单克隆抗体7D2的方法与由杂交瘤细胞株7H4制备单克隆抗体7H4的方法相同，具体如下：

1、腹水型抗体的制备

(1)在注射杂交瘤细胞株前7～14天对接种的BaLb/c小鼠腹腔注射500μL的不完全弗氏佐剂。

(2)每只老鼠腹腔注射2×10⁵～1×10⁶个杂交瘤细胞株，注射体积为500μL。一般7～14天后小鼠腹部明显隆起，行动缓慢时可以抽取腹水。

(3)把收集到的腹水4℃、12000 rpm/min离心30min，取上清，分装-20度保存。

2、抗体的纯化

(1)硫酸铵沉淀法：①将腹水从-20℃取出，4℃解冻。②4℃12000rpm/min离心30min，取上清，并记录上清的体积。③把腹水置于4℃的冰水混合环境下进行搅拌，边搅拌边缓慢滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，可以观察到有白色沉淀产生，继续搅拌15min，4℃静置过夜。④把饱和硫酸铵沉淀后的腹水于4℃、7500 rpm离心30min，弃上清，用1.5mL的PBS（用0.015M滤膜抽滤过）重悬。

(2)脱盐柱分离蛋白质中的盐离子：①平衡：接好柱子（防止空气进入柱子），用5倍柱体积的抽滤过的PBS洗去柱子中用于保存的20%的乙醇。②上样：上样时速度要缓慢。③收样：由于蛋白质分子比盐离子的体积大，蛋白质分子不能通过柱子里填充物中狭小的缝隙，只能从旁边大缝隙中首先出来，因此只收第一个吸收峰值的样品。④平衡：用大于5倍柱体积过滤过的PBS冲洗柱子。⑤保存：用20%过滤过的乙醇封柱，防止污染，4℃保存。

(3)亲和层析柱Protein G分离杂蛋白：①平衡：接好柱子（防止空气进入柱子），用5倍柱体积的抽滤过的PBS洗去柱子中用于保存的20%的乙醇。②上样：上样时速度要缓慢。③收样：第一个吸收峰出来的是杂蛋白，不收集。待PBS把杂蛋白冲洗出来后，用洗脱液（pH2.7甘氨酸溶液）把目的蛋白洗脱下来，当峰值上升时马上收集蛋白，并且每1mL的洗脱蛋白加100μL的中和液（pH9.0Tris-HCL）。④平衡：用大于5倍柱体积过滤过的PBS冲洗柱子。⑤保存：用20%过滤过的乙醇封柱，防止污染，4℃保存。

(4)超滤：取50KD的超滤管，加满已过滤的PBS，5000 rpm/min离心10min，重复三次。使得膜内外平衡。加入蛋白样品，5000 rpm/min离心10min。收集膜上收集到的浓缩液。加满PBS，5000 rpm/min离心10min，重复三次，加满20%乙醇，4℃保存超滤管。

四、单克隆抗体性能检测

分别提取杂交瘤细胞株7D2和7H4的总RNA、将RNA逆转录为cDNA，对抗体可变区基因进行PCR扩增，连接pMD-18T载体，最后导入感受态的大肠杆菌DH5α中大量扩增，提取质粒送去测序。获知单克隆抗体7D2的轻、重链可变区氨基酸序列如图1所示，单克隆抗体7H4的轻、重链可变区氨基酸序列如图2。

利用SDS-PAGE试验鉴定纯化得到的单克隆抗体7D2和7H4的纯度，结果如图3所示，利用ELISA方法检测纯化得到的单克隆抗体7D2和7H4的效价，结果如图4所示，利用ELISA方法检测纯化得到的单克隆抗体7D2和7H4的亲和力常数，结果如图5所示。

用间接ELISA试验鉴定2株抗体与cTnI另外两种形式的结合情况：cTnI单体（芬兰Hytest公司购买）和cTnI-C复合物（实验室自表达），由图6可得2株抗体均能和cTnI、cTnI-C结合，说明本发明中的2株抗体能够识别不同形式的cTnI。根据现有的研究（cTnI-linker-TnC融合蛋白的原核表达及鉴定，中国生物工程杂志，2015,35(4):48-53）和本实施例可知，7D2、7H4 可与cTnI、cTnI-C或cTnI-T-C发生特异性结合反应，表明其可以与不同形式的cTnI结合。

实施例2

利用单克隆抗体7D2为捕获抗体，7H4为检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法，可用于开发快速检测心肌梗塞试剂盒。双抗体夹心ELISA方法的建立过程如下：

1、配对抗体的选择

(1)包被：用包被液把抗体7D2稀释至2μg/mL，加100μL至96孔酶联板。4℃过夜。用PBS-T缓冲液洗涤三次，每次3min。

(2)封闭：用5%脱脂奶粉加到酶联板中，每孔加入200μL，37℃封闭一小时。用PBS-T缓冲液洗涤三次，每次3min。

(3)加抗原cTnI：用PBS缓冲液把抗原分别稀释至1000ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.ng/mL，31.25ng/mL，15.625ng/mL。每孔加100μL。37℃孵育一小时。用PBS-T缓冲液洗涤三次，每次3min。只加PBS作为阴性对照。

(4)加标记HRP抗体7H4：用PBS-T缓冲液稀释HRP至合适的倍数（直接ELISA中OD₄₅₀在2.0附近对应的稀释倍数）每孔100μL，37℃孵育一小时。用PBS-T缓冲液洗涤五次，每次3min。

(5)显色：加入100μLTMB显色液，室温避光10min。

(6)每孔加50μL终止液。

(7)酶标仪读取450nm吸光度数值OD₄₅₀，分析数据。

2、建立的7D2为捕获抗体，7H4为检测抗体的双抗体夹心ELISA 检测方法检测曲线的建立和检测范围的确立：用0.05 M，pH 9.6的碳酸盐包被缓冲稀释7D2至2μg/mL，每孔加100μL，4℃过夜。5%脱脂奶粉封闭一小时。分别加入不同浓度的用样本稀释液稀释的芬兰Hytest公司购买的cTnI作为抗原（1000ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.5ng/mL，31.25ng/mL，15.625ng/mL），每孔50 μL，37℃孵育1小时。分别加入100μL按照1:2000稀释的HRP-7H4，孵育一小时。加入100μL显色液TMB，显色10分钟，加入50ul终止液（10% H₂SO₄）。酶标仪读取450nm吸光度数值OD₄₅₀，分析数据，根据数据做出标准曲线。在cTnI浓度在30ng/mL～500ng/mL范围内，随着cTnI浓度的升高，ELISA反应OD₄₅₀值升高，cTnI浓度与OD₄₅₀值呈线性相关，因此本方法的检测的范围为：30ng/mL～500ng/mLL（图7）。并绘制了7D2为捕获抗体，7H4为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法的标准曲线（图8）。

3、临床样本的检测：用自制的双抗体夹心ELISA方法对30份临床血清样本进行检测，其中阳性22份，阴性8份。统计分析结果，阳性检出率为77.3%，阴性检出率为100%。

对比例1

利用单克隆抗体7H4为捕获抗体，7D2为检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法，可用于开发快速检测心肌梗塞试剂盒。双抗体夹心ELISA方法的建立过程如下：

1、配对抗体的选择

(1)包被：用包被液把抗体7H4稀释至2 μg/mL，加100 μL至96孔酶联板。4℃过夜。用PBS-T缓冲液洗涤三次，每次3 min。

(2)封闭：用5%脱脂奶粉加到酶联板中，每孔加入200 μL，37℃封闭一小时。用PBS-T缓冲液洗涤三次，每次3 min。

(3)加抗原cTnI：用PBS缓冲液把抗原分别稀释至1000 ng/mL，500 ng/mL，250 ng/mL，125 ng/mL，62.5 ng/mL，31.25 ng/mL，15.625 ng/mL。每孔加100μL。37℃孵育一小时。用PBS-T缓冲液洗涤三次，每次3 min。只加PBS作为阴性对照。

(4)加标记HRP抗体7D2：用PBS-T缓冲液稀释HRP至合适的倍数（直接ELISA中OD₄₅₀在2.0附近对应的稀释倍数）每孔100 μL，37℃孵育一小时。用PBS-T缓冲液洗涤五次，每次3min。

(5)显色：加入100 μL TMB显色液，室温避光10min。

(6)每孔加50 μL终止液。

(7)酶标仪读取450 nm吸光度数值OD₄₅₀，分析数据。

2、建立的7H4为捕获抗体，7D2为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法检测曲线的建立和检测范围的确立：用用0.05 M，pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释抗体7H2至2 μg/mL，每孔加100 μL，4℃过夜。5%脱脂奶粉封闭一小时。分别加入不同浓度的用PBS-T缓冲液稀释的购买的标准抗原cTnI（0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000ng/mL），每孔50 μL，37℃孵育1小时。分别加入100 μL按照1:2000稀释的HRP-7D2，孵育一小时。加入100 μL显色液，显色10分钟，加入50 μL终止液。酶标仪读取450 nm吸光度数值OD₄₅₀，分析数据，可知，在cTnI浓度在60ng/mL～500ng/mL范围内，随着cTnI浓度的升高，ELISA反应OD₄₅₀值升高，cTnI浓度与OD₄₅₀值呈线性相关，但该相关斜率小。因此，本方法的检测的范围为：60ng/mL～500ng/mL（图7）。

比较实施例2和对比例1可以发现：

根据实施例7D2/HRP-7H4和对比例7H4/HRP-7D2的检测曲线确定各自的检测范围，根据图可知7D2/HRP-7H4的检测曲线比7H4/HRP-7D2检测曲线变化率大，检测范围广，灵敏度高。

Claims

1.一株人心肌肌钙蛋白I的杂交瘤细胞株7D2，其特征在于，所述杂交瘤细胞株7D2于2017年8月23日保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：C2017120。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株7D2分泌的人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2。

3.权利要求2所述的人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体7D2在检测游离的cTnI、二聚体复合物cTnI-C、三聚体复合物cTnI-T-C三种形式的cTnI中的应用。