CN102435570A - 基于金纳米片的肌钙蛋白i自身抗体检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米生物技术应用领域，公开了基于金纳米片的肌钙蛋白I自身抗体检测方法。该方法是在金纳米片上包被心肌肌钙蛋白I抗原，利用金纳米片上包被的心肌肌钙蛋白I抗原与待测样品中心肌肌钙蛋白I自身抗体的特异性结合，通过光谱仪检测金纳米片，实现心肌肌钙蛋白I自身抗体的定量检测。该检测方法具有良好的稳定性和重复性且操作简便，为金纳米片在生物医学领域的应用开辟了一条新途径。

Description

基于金纳米片的肌钙蛋白I自身抗体检测方法

技术领域

本发明属于纳米生物技术应用领域，涉及基于金纳米片的肌钙蛋白I自身抗体检测方法。

背景技术

金纳米颗粒具有基于表面等离子共振的光学特性(surface plasmon resonance，SPR)，该性质源于特定波长的入射光与金纳米颗粒表面的自由电子的共振耦合作用。当金纳米颗粒聚集态发生改变或者表面被不同化学分子或生物分子吸附时，其SPR峰将会发生移动或峰形发生改变，这一特性可以用于分析检测方面，并且利用通常的紫外-可见光(UV-vis)光谱仪即可进行。近年来理论和实验研究显示，不对称形状的金纳米颗粒的SPR峰较之球形金纳米颗粒有更高的灵敏性。然而，将不对称形状的金纳米颗粒作为生物检测平台以获得更高的检测灵敏度的研究仍面临着众多的挑战，其中的关键问题就是能否获得胶体级、高单分散以及光学性质稳定的不对称形状的金纳米颗粒溶液。虽然具有纳米厚度和微米长度的金的片状结构也统称为金纳米片，但由于它们整体的大尺寸使得其光学特性远不如三维尺寸均处于纳米尺度(胶体级)的金纳米片显著。然而，现有报道的大部分金纳米片的尺寸仍处于亚微米到几十个微米之间。这些微米尺寸的结构在溶液中极易因重力作用沉淀，限制了基于液相检测方面的应用。少数涉及小尺寸金纳米片的工作常有一些其它形状的副产物伴生并难以高效地纯化。最近，Ha等人首次报道了利用与前述合成金纳米棒相似的CTAB辅助下的“晶种”生长法制备胶体级金纳米片的工作。然而，最终的反应液中仍包含了大量的(约占总数的55％)球形金纳米颗粒。

心肌肌钙蛋白I(cTnl)是心脏特异性蛋白质，参与调控心肌的舒缩，与心脏功能紧密相关。心肌细胞损伤后cTnl释放入血，进入循环的cTnl可激活机体免疫系统产生相应的cTnl自身抗体，并长期存在于循环中。有文献报道，在心肌梗死患者血清中可检测到cTnl自身抗体；Haim S等对原发性扩张型心肌病患者和缺血性心脏病患者血清进行研究，发现部分样本血清抗心肌肌钙蛋白I自身抗体滴度水平增高；

等对扩张型心肌病患者进行免疫吸附治疗，发现这些患者的血流动力学得到明显改善；在动物实验中，cTnl抗体可慢性激活心肌细胞膜L型钙通道，细胞内钙离子浓度增高，提示cTnl抗体可能具有心肌损伤作用。但冠状动脉硬化性心脏病患者血清中cTnl自身抗体是否具有心肌损伤的病理作用、是否与患者预后相关，有待进一步研究。

有多篇文献报道，临床检测cTnl的标本中存在cTnl自身抗体高达10％以上，对cTnl的检测结果产生严重负性干扰，应在临床检验cTnl上重视cTnl自身抗体的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于金纳米片的肌钙蛋白I自身抗体检测方法。

本发明的另一目的是提供上述金纳米片的制备和纯化方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于金纳米片的心肌肌钙蛋白I自身抗体检测方法，在金纳米片上包被心肌肌钙蛋白I抗原，利用金纳米片上包被的心肌肌钙蛋白I抗原与待测样品中心肌肌钙蛋白I自身抗体的特异性结合，通过光谱仪检测金纳米片，实现心肌肌钙蛋白I自身抗体的检测。

所述的纳米金片优选三维棱柱状结构体，底面为边长为50～300nm的三角形，上下底边平行，厚度为2～20nm。

所述的金纳米片通过如下方法制备并纯化得到：

(1)在三甲基十六烷基溴化铵和碘离子的辅助下，通过“晶种”生长法制备纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液；

(2)将混合液于30℃静置22～26h，纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液发生相分离，金纳米片沉积在容器底部，倒出上清液即可得到纯化的金纳米片。

所述的心肌肌钙蛋白I抗原为纯化的牛心肌肌钙蛋白I。

所述的光谱仪为UV-vis光谱仪。

一种制备并纯化金纳米片的方法，包括如下步骤：

(1)在三甲基十六烷基溴化铵和碘离子的辅助下，通过“晶种”生长法制备纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液；

(2)将混合液于30℃静置22～26h，纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液发生相分离，金纳米片沉积在容器底部，倒出上清液即可得到纯化的金纳米片。

有益效果：本发明利用相分离效应，在不需要离心和过滤的情况下，从制备的金纳米片与球形金纳米颗粒的混合液中原位地高纯度分离出金纳米片，其纯度可达97％。所获得的金纳米片可以看作一类上下底边平行，具有纳米尺度的三维棱柱状结构体。因其立体结构的高度不对称性而导致其SPR表现为多重吸收峰，其长波方向的SPR峰可以通过调控纳米片的尺度而延伸到近红外区。金纳米片的光学特性使其在光学(双光子)荧光、表面增强拉曼散射、光学涂层等方面具有广泛的应用前景，为金纳米片应用于抗体或抗原的检测扫清了技术障碍。进而将该纯化的不对称形状的金纳米片包被心肌钙蛋白I后运用于心肌钙蛋白I自身抗体的检测，相比现有酶联免疫法，有利于cTnI自身抗体的快速检测，灵敏度更高，具有良好的稳定性和重复性，操作简便。

附图说明

图1.粗曲线为金纳米片在300～1100nm波长的光吸收曲线，细曲线为球形金纳米颗粒在300～1100nm波长的光吸收曲线，相对于球形金纳米颗粒溶液只呈现单个的SPR峰，高纯度的金纳米片由于其高度不对称的形状而呈现两个SPR峰：一个弱峰位于760nm，另一个强峰位于1055nm。

图2.利用相分离效应分离出金纳米片，

a)为相分离后上清液中球形金纳米颗粒的TEM照片；b)为相分离后沉淀中金纳米片的TEM照片.插图中标尺为200nm；c)金纳米片的高分辨电镜照片；d)与图c)中金纳米片相应选区的电子衍射花样，以方块、圆形以及三角形标记的衍射点分别对应着1/3{422}，{220}和{422}的衍射点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1高纯度金纳米片的制备及获取

金纳米片的制备是基于在碘离子(I^-)和三甲基十六烷基溴化铵(CTAB)存在下的“晶种”生长法策略，首先将1mL 10mM的柠檬酸钠加入37.6mL的水中，再加入0.4mL 25mM的氯金酸(HAuCl₄)溶液，最后快速加入1mL的0.1M硼氢化钠(NaHB₄)溶液。反应液颜色立刻由淡黄色转为橘红色，表明金纳米颗粒的生成，以此作为晶种。典型的生成金纳米片的步骤如下：将100mL含有0.25mMHAuCl₄和0.05M CTAB的生长液置于250mL的烧瓶中，对此生长液中依次加入55μL的0.1M碘化钾(KI)，0.55mL的0.1M L-抗坏血酸(AA)和0.5mL的0.1M NaOH(NaOH在此处的作用是对AA去质子化以获得更高效的还原能力)。最后，再向生长溶液中加入0.1mL的“晶种”以引发金纳米片的生长。反应体系在30℃的水浴中进行。然后将整个反应体系无扰动地静置24h。经过上述操作后，绝大部分的金纳米片沉积在容器底部，可通过倒出上清液进行搜集。上清液为球形金纳米颗粒的胶体溶液，金纳米片的沉淀用5mM的CTAB溶液重悬为胶体溶液。利用UV-vis光谱仪检测二者的300～1100nm波长吸收曲线进行分析。如图1所示，相对于球形金纳米颗粒胶体溶液只呈现单个的SPR峰，高纯度的金纳米片由于其高度不对称的形状而呈现两个SPR峰：一个弱峰位于760nm，另一个强峰位于1055nm。

实施例2制备的金纳米片做电镜表征

角形纳米金片与球形金纳米颗粒的电镜观察结果如图2所示，三角形纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液分离后，二者都具有较窄的尺寸分布。球形金纳米颗粒的平均直径为30±2nm。三角形金纳米片的平均侧边长度为140±25nm，厚度为8±2nm.由金纳米片的TEM照片进行统计可知，金纳米片的数量占所有颗粒总数的97％以上。对单个金纳米片的基面进行高分辨电镜表征(图2c)，其取向相同，间距相同的晶格纹路显示这些金纳米片具有单晶的性质。对金纳米片的基面用垂直电子束照射所获得的呈正六边形的对称点阵的电子衍射花样(图2d)显示这些金纳米片是以{111}晶面为基面的单晶晶体。

实施例3cTnI抗原分别包被金纳米片、球形金纳米颗粒

离心金纳米片的重悬液以除去溶液中游离的CTAB分子，在结合抗原之前，先用聚苯乙烯磺酸钠(PSS)对金纳米片表面的CTAB双分子层进行表面修饰。操作步骤如下：在搅拌下向30mL，长波SPR峰的光学强度为1.0的金纳米片溶液中加入2.4mL 2.5mg/mL的PSS溶液，之后静置15分钟。溶液体系中游离的PSS分子经由离心过程除去。沉淀用相同体积的去离子水重悬，并以0.2M的K₂CO₃溶液调节pH值为8.2.然后将PSS包覆的金纳米片溶液与过量的cTnI抗原(50μg/mL)作用30min。之后加入1％的小牛血清蛋白(BSA)的Tris缓冲液将未结合的位点进行封闭。然后将混合体系离心两次以去除游离的抗原，并用Tris缓冲液(pH＝8.2)重悬至光学强度为1.0.

按照上述方法，制备cTnI抗原包被的球形金纳米颗粒溶液。

实施例4通过结合cTnI抗原的金纳米片检测鼠抗人cTnI抗体

在常温下将不同浓度(0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024ng/mL)的鼠抗人cTnI抗体分别加入到1.0mL的结合cTnI抗原的金纳米片溶液和1.0mL的结合cTnI抗原的球形金纳米颗粒溶液。之后每个混合液室温孵育15min，然后用UV-vis光谱仪检测300～1100nm波长吸收曲线进行分析。金纳米片的长波SPR峰(1055nm)的光学强度随着溶液中cTnI抗体浓度的增加而逐渐降低，上述现象可以归因于由于抗原-抗体特异性识别作用而导致了金纳米片聚集。而球形金纳米颗粒的波峰(520nm)的光学强度，随着溶液中cTnI抗体浓度增加到256ng/ml以上才有降低。

上述基于金纳米片的肌钙蛋白I自身抗体检测方法能够检测出cTnI抗体的最低浓度为1.0ng/ml，比现有酶联免疫法的灵敏度(2.5ng/ml)更高，远高于基于球形金纳米颗粒的肌钙蛋白I自身抗体检测方法的灵敏度(256ng/ml)。不同浓度(0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024ng/mL)的鼠抗人cTnI抗体经10次重复检测，CV＜10％，而现有酶联免疫法的CV达15％。所以基于金纳米片的肌钙蛋白I自身抗体检测方法有利于cTnI自身抗体的快速检测，具有良好的稳定性和重复性，操作简便。

实施例5通过结合cTnI抗原的金纳米片检测cTnI自身抗体

收集50例心肌梗死患者血清标本，所有患者均参照中华医学会心血管病分会2001年心肌梗死诊断及治疗指南明确诊断。收集131例健康体检者血清作为对照。所有标本分别加入到1.0mL的结合cTnl抗原的金纳米片溶液中，之后每个混合液室温孵育15min，然后用UV-vis光谱仪检测3001100nm波长吸收曲线进行分析。50例心肌梗死患者中有9例cTnI自身抗体阳性(现有酶联免疫法检测出7例cTnI自身抗体阳性)，阳性率为18％，对照组无cTnI自身抗体阳性。cTnI自身抗体阳性患者中男女数比为5∶4，cTnI自身抗体阴性心肌梗死患者中男女比为33∶8，与自身免疫系统疾病女性发病率高于男性发病率的流行病学特征相符合。

Claims (6)

1.一种基于金纳米片的心肌肌钙蛋白I自身抗体检测方法，其特征在于在金纳米片上包被心肌肌钙蛋白I抗原，利用金纳米片上包被的心肌肌钙蛋白I抗原与待测样品中心肌肌钙蛋白I自身抗体的特异性结合，通过光谱仪检测，实现心肌肌钙蛋白I自身抗体的检测。

2.根据权利要求1所述的基于金纳米片的心肌肌钙蛋白I自身抗体检测方法，其特征在于所述的纳米金片为三维棱柱状结构体，底面为边长为50～300nm的三角形，上下底边平行，厚度为2～20nm。

3.根据权利要求2所述的基于金纳米片的心肌肌钙蛋白I自身抗体检测方法，其特征在于所述的金纳米片通过如下方法制备并纯化得到：

(1)在三甲基十六烷基溴化铵和碘离子的辅助下，通过“晶种”生长法制备纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液；

(2)将混合液于30℃静置22～26h，纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液发生相分离，金纳米片沉积在容器底部，倒出上清液即可得到纯化的金纳米片。

4.根据权利要求1所述的基于金纳米片的心肌肌钙蛋白I自身抗体检测方法，其特征在于所述的心肌肌钙蛋白I抗原为纯化的牛心肌肌钙蛋白I。

5.根据权利要求1所述的基于金纳米片的心肌肌钙蛋白I自身抗体检测方法，其特征在于所述的光谱仪为UV-vis光谱仪。

6.一种制备并纯化金纳米片的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)在三甲基十六烷基溴化铵和碘离子的辅助下，通过“晶种”生长法制备纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液；

(2)将混合液于30℃静置22～26h，纳米金片与球形金纳米颗粒的混合液发生相分离，金纳米片沉积在容器底部，倒出上清液即可得到纯化的金纳米片。

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