CN104745535B - 一种弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7及单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7及单克隆抗体。本发明所述弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7于2014年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2014230。本发明以弓形虫蛋白TgVP1合成肽免疫小鼠，通过杂交瘤技术获得抗弓形虫蛋白TgVP1的杂交瘤细胞株1D7，其所分泌的单克隆抗体，可以特异性识别TgVP1蛋白，可用于试验中TgVP1蛋白的鉴定，具有应用价值。

Description

一种弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7及单克隆抗体

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤细胞株1D7及单克隆抗体。

背景技术

V-H+-PPase是一种独特的质子泵,在多种动植物中都存在。它能够水解无机焦磷酸盐的磷酸酐键，并利用所释放的能量转运质子，产生跨膜的电化学梯度，发挥和质子泵ATP酶类似的作用。V-H+-Ppase能使储存的能量高效转化为H+和/或电转膜梯度，用于多种不同的细胞内转运过程。V-PPases最早被发现存在于植物和光合细菌中，近期研究表明锥虫、利什曼原虫、弓形虫、恶性疟原虫也存在这种酶。值得关注的是，在这些寄生虫的动物宿主中均不存在这种酶类，因此V-PPases作为寄生虫病潜在的药物靶点具有重要的研究价值。弓形虫的V-PPases主要分布于酸性钙体及质膜，根据结构和功能的不同可分为两种类型，VP1和VP2。TgVP1需要K+激活其生物学活性。当弓形虫入侵细胞时，TgVP1组成圈状结构分布于弓形虫外缘，并随着弓形虫的侵入在虫体内迁移。当弓形虫完成侵袭过程时，TgVP1重新回到弓形虫的顶端。TgVP1含有17个跨膜域，N端具有信号肽序列，可以指导TgVP1进入弓形虫的分泌途径，但具体作用机制尚不明确。有研究表明弓形虫焦磷酸酶活性可抑制弓形虫在细胞内的复制。因此，TgVP1有作为潜在的弓形虫病临床诊断和治疗靶标的可能，制备TgVP1的抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot及免疫荧光检测的抗弓形虫蛋白TgVP1的单克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的检测弓形虫蛋白TgVP1的抗体是用合成TgVP1抗原多肽作为抗原免疫BALB/c小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株1D7，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1阳性，轻链为κ型。所述抗弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7，于2014年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2014230。

本发明中弓形虫蛋白TgVP1的氨基酸序列为EPT25031.1，如SEQ ID NO：1所示。

本发明中弓形虫蛋白TgVP1的抗原多肽序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO:C2014230的杂交瘤细胞株1D7的制备方法是：TgVP1抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:10⁵的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合；用含20％小牛血清的HATRPMI-1640培养基筛选融合细胞，用TgVP1抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗TgVP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为1D7。应用此株杂交瘤细胞以1×10⁶/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

与现有技术相比，本发明特色如下：

本发明以合成的TgVP1抗原多肽包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对纯化的弓形虫蛋白进行Western-blot证明该抗体可以识别TgVP1蛋白。

本发明将此纯化抗体用于进行弓形虫的免疫荧光染色证明其能识别天然的TgVP1蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究TgVP1功能奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

本发明的单克隆抗体其免疫原是偶联了KLH的合成TgVP1抗原多肽，其肽序列如SEQ ID NO：2所示，全长29个氨基酸。本发明的单克隆抗体除了能应用于ELISA和Western检测变性TgVP1蛋白以外还可以应用于细胞免疫荧光检测未变性的天然TgVP1蛋白。目前国内外尚无针弓形虫TgVP1特异性抗体，而本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光等实验。本发明针对TgVP1合成短肽制备出的单克隆抗体对检测TgVP1蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用将为TgVP1的功能研究和其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

附图说明

图1是是本发明单抗1D7对弓形虫免疫印迹的结果,其结合条带的分子量约为85kDa。泳道M：蛋白Marker；泳道1：上样为弓形虫速殖子裂解蛋白；泳道2：上样为OFTu细胞裂解蛋白。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1本发明单克隆抗体的制备和鉴定

1、单抗1D7的制备

1)弓形虫TgVP1抗原多肽的设计、制备及载体偶联

根据GenBank上的弓形虫TgVP1序列(登录号：EPT25031.1)获得弓形虫TgVP1蛋白序列，含有816个氨基酸。用TMHMM软件分析TgVP1蛋白的跨膜域，IEDB软件分析TgVP1蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明弓形虫TgVP1蛋白292-320aa有29个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。经过上述分析，最终筛选多肽序列为：292aa-320aa，SEQ IDNO:2。该短肽(TgVP1-P1)及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的短肽(TgVP1-P1-KLH)由上海吉尔生化公司合成。

2)免疫小鼠

以合成肽TgVP1-P1-KLH免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。

第一次免疫：取合成肽TgVP1-P1-KLH与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔内注射BALB/c小鼠；

第二次免疫：隔2周后，取合成肽TgVP1-P1-KLH与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔内注射BALB/c小鼠；

第三次免疫：再隔2周后，取合成肽TgVP1-P1-KLH与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以合成肽TgVP1-P1包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:10⁵的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；

Bentonite佐剂使用商品化产品。

3)免疫血清效价测定

采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成肽TgVP1-P1溶解于10ml 0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS进行10-2～10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃30min，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2MH2SO2终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

4)杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁵的小鼠，融合前3天，取合成肽TgVP1-P1与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1：1的比例混合，1000×g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000×g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)(HT，Sigma))培养。

5)筛选分泌抗TgVP1单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗TgVP1单克隆抗体细胞株，标记为1D7。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

6)腹水的制备和纯化

将1D7杂交瘤细胞株以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein GSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

2、本发明单克隆抗体的特性鉴定

1)抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞CCTCC NO：C2014230制备的腹水经纯化后获得TgVP1单克隆抗体1D7，使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为1.24mg/ml。

2)抗体亚型鉴定：采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，1D7分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。

3)纯化抗体的效价鉴定：50μg合成肽TgVP1-P1溶于10ml pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2MH₂SO₄溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。

4)抗体的Western blot鉴定：分别收集弓形虫速殖子和OFTu细胞，将其裂解后制成弓形虫裂解蛋白和OFTu裂解蛋白，用2×SDS裂解缓冲液裂解后上样，经10％SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，1:1000加入经纯化的杂交瘤细胞CCTCCNO：C2014230制备的抗TgVP1单克隆抗体1D7，4℃孵育过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化学发光底物反应液(A:B＝1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞CCTCC NO：C2014230制备的抗TgVP1单克隆抗体1D7出现单一的特异性条带，结果如图1所示。

5)抗体的免疫荧光鉴定：制备弓形虫涂片，4％多聚甲醛固定15min，滴加0.25％TritonX100，室温孵育10min，使细胞膜具有渗透性，以便抗体进入。PBS洗涤三次，含1％BSA的PBST室温封闭2h。PBS洗涤3次，然后用本发明中的抗TgVP1的单克隆抗体1D7(PBST 1:500稀释)室温孵育1.5h。PBS洗涤3次，用Alexa Fluor 546(红色荧光)标记的羊抗鼠IgG(PBST1:1000稀释)室温孵育1h。PBS洗涤后DAPI染色(蓝色)10min。PBS洗片后，荧光显微镜下观察。同时用正常鼠血清作阴性对照。

结果：经本发明中杂交瘤细胞CCTCC NO：C2014230制备的抗TgVP1单克隆抗体1D7染色的弓形虫细胞质中均观察到红色荧光，证明本发明中的抗TgVP1抗体可识别天然的TgVP1蛋白。

Claims (2)

1.一种弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7，其特征在于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2014年12月16日，保藏号为CCTCC NO:C2014230。

2.权利要求1所述弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤1D7分泌的抗TgVP1单克隆抗体在鉴定TgVP1蛋白中的应用。