CN110759988B - 猪nlrp3截短片段在作为抗原结构蛋白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猪NLRP3的抗原结构蛋白和猪NLRP3单克隆抗体及其制备方法和应用，猪NLRP3的抗原结构蛋白具有很好的免疫原性，作为抗原免疫小鼠，通过细胞融合后以IFA筛选杂交瘤细胞，筛选获得7株分泌NLRP3单克隆抗体细胞株，分别将单克隆抗体进行纯化，获得猪NLRP3单克隆抗体；其中，9H5杂交瘤细胞株NLRP3稳定性最好，所分泌的单抗效价最高、特异性最强，其生物保藏号为CCTCC NO：C201973。本发明进一步提供了杂交瘤细胞株猪NLRP3以及所分泌的单克隆抗体在检测或纯化NLRP3蛋白中的应用。

Description

猪NLRP3截短片段在作为抗原结构蛋白中的应用
技术领域
本发明涉及免疫学的抗原-抗体领域，具体涉及猪NLRP3截短片段在作为抗原结构蛋白中的应用，还涉及猪NLRP3单克隆抗体，以及单克隆抗体的制备方法和应用。
背景技术
NLRP3又称炎症小体，是由白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。NLRP3蛋白作为NLRP3炎性小体的主要组成蛋白之一，在机体对抗病原微生物和炎症反应中起着重要作用。为深入探讨炎症小体在猪炎症性疾病的作用机制提供了基础数据，炎症小体是一种由细胞浆内天然免疫识别受体参与组装的多蛋白复合物，对炎症反应的发生至关重要。目前，NLRP3炎性小体及其病理生理作用的研究成为了炎症发生及调控领域的热点研究问题之一。NLRP3蛋白与ASC、Caspase、Caspase-1等相互作用形成NLRP3炎性小体，促使Caspase-1前体成熟活化并促进1L-1β和IL-18的成熟和释放，激活炎症反应。畜牧业生产过程中，猪的各种炎症性疾病频发，造成了重大的经济损失。迫切需要研究这些炎症性疾病发生的分子机制，这对于对抗炎症、调节疾病进程具有重要意义，也会对生产起到基础性的技术支撑。炎症小体作为炎症的重要载体之一，是猪炎症性疾病发生、发展和调控的重要目标蛋白复合体之一。NLRP3作为炎症小体的重要组成蛋白，与ASC、Caspase-1等组成的NLRP3炎性小体在多种病原体感染过程中都起到了重要的调控作用，对其进行深入研究，是寻找各种炎症性疾病新的治疗靶点的关键突破口。
快速、准确诊断猪体炎症可以为正确治疗和防控病毒和细菌等引起的炎性疾病提供时间参考，准确诊断猪体是否存在炎症的胶体金试纸条，以及检查NLRP3表达的抗原ELISA试剂盒，都离不开性能稳定、抗原效价高的NLRP3单抗，国内外尚无针对猪的好单抗，因此尚不存在针对NLRP3的诊断试剂。因此，亟需开发出一种能够简便应用于制备检测猪体NLRP3以及组装试剂盒的单抗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供猪NLRP3截短片段在作为抗原结构蛋白中的应用；本发明的目的之二在于提供所述猪NLRP3截短片段的重组蛋白在作为抗原结构蛋白中的应用；本发明的目的之三在于提供一种猪NLRP3单克隆抗体；本发明的目的之四在于提供所述猪NLRP3单克隆抗体在检测或纯化NLRP3蛋白中的应用；本发明的目的之五在于提供含有所述猪NLRP3单克隆抗体的试剂盒；本发明的目的之六在于提供一株稳定分泌猪NLRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株9H5；本发明的目的之七在于提供所述杂交瘤细胞株9H5在纯化猪NLRP3蛋白试剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、NLRP3截短片段或猪NLRP3截短片段的重组蛋白在作为抗原结构蛋白中的应用，所述猪NLRP3截短片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述猪NLRP3截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述重组蛋白的制备方法如下：将如SEQ ID NO.2所示序列连入表达载体pET-32a，转化BL21(DE3)感受态细胞，在IPTG终浓度为0.1mmol/L条件下诱导表达，获得重组蛋白。
2、一种猪NLRP3单克隆抗体，所述猪NLRP3单克隆抗体识别的抗原为猪NLRP3截短片段，所述猪NLRP3截短片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述猪NLRP3单克隆抗体由生物保藏号为CCTCC NO：C201973的杂交瘤细胞分泌。
4、所述猪NLRP3单克隆抗体在检测或纯化NLRP3蛋白中的应用。
5、含有所述猪NLRP3单克隆抗体的试剂盒。
优选的，所述试剂盒为ELSIA试剂盒、胶体金单抗试剂盒。
6、一株稳定分泌猪NLRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株9H5，所述杂交瘤细胞株9H5的生物保藏号为CCTCC NO：C201973。
7、所述杂交瘤细胞株9H5在纯化猪NLRP3蛋白试剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了猪NLRP3的抗原结构蛋白，选择猪NLRP3的截短片段，然后进行重组表达后，NLRP3重组蛋白为抗原免疫的动物，制备单克隆抗体细胞株，单克隆抗体腹水，再将单克隆抗体纯化，得到一种性能稳定、抗原效价高的猪NLRP3单克隆抗体，可用于构建试剂盒和纯化猪NLRP3蛋白的试剂。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为NLRP3重组蛋白的SDS-PAGE分析(M：蛋白Marker；1：pET32a诱导菌；2：pET32a-NLRP3未诱导菌；3：pET32a-NLRP3诱导菌；4：上清；5：沉淀；6：纯化的蛋白)。
图2为间接免疫荧光检测NLRP3单克隆抗体水平(A-G分别表示用单抗9H5、10G4、13A11、13E1、13E3、13E11、15E2对猪PK细胞进行间接免疫荧光检测的结果，H是对照，未加单抗)。
图3为NLRP3蛋白双抗体夹心ELISA检测方法标准曲线绘制。
图4为NLRP3蛋白在猪肺组织中的含量测定。
生物保藏
本发明中杂交瘤细胞株9H5，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：C201973，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2019年4月28日，分类命名为小鼠骨髓杂交瘤细胞株9H5。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下面对本发明的实施例作进一步详实描述。
实施例1、抗原制备
为研究猪炎症性疾病新的治疗靶点，正确治疗、防控病毒和细菌等引起的炎性疾病，拟制备猪NLRP3单抗，首先选择由288个氨基酸残基组成的猪NLRP3截短片段，分子量约50KDa，作为NLRP3抗原结构蛋白，其NLRP3截短片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列通过BamH I和Xho I连入表达载体pET-32a，获得重组表达载体pET32a-NLRP3，经测序验证后，选择目的基因序列正确的表达载体进行蛋白表达。
具体表达方法如下：
将测序鉴定正确的pET32a-NLRP3重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，从转化平板挑选8个单克隆，分别接种3mL LB含kan抗性的培养基中；培养至OD600为0.4-0.6，以1：100比例接种于300mL LB液体培养基中，37℃培养至A600为0.6～0.7左右，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导表达8h，5000r/min离心菌液收集菌体，PBS洗涤2次后，利用超声波裂解菌体细胞，超声波裂解5s，间隔10s，裂解30min。然后以12 000r/min离心10min，经上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测表达情况。然后将上清进行纯化，由于本发明表达的蛋白为可溶蛋白，对可溶形式表达的重组蛋白按Ni NTA Purification System使用说明进行纯化，纯化方法如下：将1mL 50％Ni-NTA His Bind树脂悬液加到4mL 1×Ni-NTA结合缓冲液中，轻柔混匀。待树脂自然沉降后，用枪头吸去4mL上清。加入4mL制备好的裂解液，轻柔摇动混匀，4℃结合60分钟。将裂解液Ni-NTA His Bind树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱中。除去下端的封闭盖子，收集流出液。蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳检测纯化效果，利用紫外分光光度计测定纯化蛋白的浓度。纯化蛋白经紫外分光光度计测定浓度为1.28mg/mL，将纯化蛋白进行SDS-PAGE，结果如图1所示。结果显示，纯化后的蛋白纯度较高。
实施例2、动物免疫
实验动物及免疫方法：选择5-8周龄Balb/C小鼠5只，以实施例1制备的NLRP3重组蛋白质为抗原，按背部多点注射，注射100μg抗原/实验鼠，加强免疫注射50μg抗原/实验鼠，第一次注射使用弗氏完全佐剂与抗原等体积混合，加强免疫注射使用弗氏不完全佐剂与抗原等体积混合，具体免疫时间及周期如表1所示。
表1、免疫周期
实验进程 日期
初免 2018.07.15
第一次加强免疫 2018.07.23
第二次加强免疫 2018.07.31
第三次加强免疫 2018.08.08
融合 2018.08.16
筛选 2018.08.24
亚一筛选 2018.09.01
亚二筛选 2018.09.09
腹水 2018.09.24
抗血清检测：
从免疫完成的小鼠尾静脉取少量血，制备抗血清，采用间接ELISA方法检测抗血清效价，反应条件如下：
抗原包被：37℃包被2h；封闭：37℃封闭1h；血清抗体孵育：37℃孵育1h；二抗(HRP标记山羊抗鼠IgG)：二抗按1：10000稀释后37℃结合30min，最后37℃显色10min，结果如表2所示。
表2、不同免疫次数及不同浓度检测的抗体效价
Figure BDA0002262402570000041
Figure BDA0002262402570000051
结果显示，抗原包被浓度为5K时效果最好，三免血清效价较高，抗体特异性较好。
用筛选的最佳条件检测重组蛋白免疫的3只小鼠。结果显示，3只小鼠对重组蛋白质反应度很好，决定用M0131-4这只小鼠进行后续实验，并用重组蛋白质进行筛选。
实施例3、细胞融合及亚克隆
(1)骨髓瘤细胞制备：融合前一周，复苏SP2/0细胞，正常培养至对数期。
(2)脾细胞制备：选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。
(3)细胞融合：按1:3-1:10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用HAT DMEM完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基，融合后10天左右开始进行筛选检测。
细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。
(4)融合筛选：吸取细胞上清100μL/孔进行间接ELISA检测。根据ELISA结果，判断阳性孔，用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
(5)亚克隆：对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。
第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。
(6)单克隆抗体亚型鉴定
用美国Southern Biotech的单抗亚型鉴定试剂盒分别测各个上清的亚型。准备好包被有免疫原蛋白的板条，50ng/孔，每个克隆收集600μl上清，分别滴加到6个对应蛋白的酶标孔中，100μl/孔；37℃孵育1h，PBST洗三遍，将稀释好的分型二抗抗IgM，IgA，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3的抗体加入6个孔中，37℃孵育1h，PBST洗三遍，TMB显色；有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为该抗体的亚型。
经过两轮亚克隆及复检，确定以下阳性细胞株及亚型：9H5、10G4、13A11、13E1、13E3、13E11、15E2。
(8)最后确定的阳性细胞株号及亚型，确认阳性细胞株为：9H5；送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201973。
实施例4、腹水制备及抗体纯化
(1)腹水制备：将上述阳性细胞扩大培养并注射至Balb/C小鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。
(2)腹水纯化：将上述细胞的腹水，进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。纯化方法如下：辛酸硫酸铵+DEAE离子柱法纯化，腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积，用4倍体积的60mM醋酸缓冲液(pH4.0)1:3稀释，逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml稀释腹水)，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。10000r/min，4℃，20min，收集上清，加入1/10体积的10×PBS(0.1MpH7.4)。根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵(0℃条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，继续静置至少60min以上；10000r/min，4℃，20min，弃上清，将沉淀溶解于少量PBS中，对PBS透析，4℃透析过夜。
(3)纯化抗体的浓度测定：经杂交瘤细胞CCTCC No：C201973制备的腹水经纯化后获得NLRP3单克隆抗体9H5，使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为1.78mg/ml。
(4)纯化抗体的效价鉴定：50μg NLRP3截短片段原核表达的蛋白溶于10ml pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。
(5)间接免疫荧光法检测纯化抗体的特异性：
1瓶猪视网膜上皮细胞经0.25％胰酶消化，接种到96孔板，接种1×107CCU/ml猪猪肺炎支原体，2％的DMEM培养基继续培养2天；接种支原体2天后弃掉细胞上清液，每孔轻轻加PBS洗涤3次，避免细胞被悬浮；尽可能去除细胞孔里的液体，每孔加无水乙醇100μL4℃固定2小时。
弃掉固定液，干燥后加7株单抗的9H5、10G4、13A11、13E1、13E3、13E11、15E2的腹水1：100，加细胞上清作对照，37℃孵育1小时。
用PBS洗涤3次，轻轻拍板子甩干液体，加Sigma公司的抗鼠荧光抗体1：100，37℃孵育1小时。
用PBS洗涤3次，轻轻拍板子甩干液体，荧光显微镜下观察，见图2。结果表明9H5单抗反应原性较好。
实施例5、一种NLRP3截短蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立
一种NLRP3截短蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立方法如下：
(1)HRP酶标记抗体mAb2的制备
将HRP酶溶解到超纯水中，使其终浓度为10mg/ml，取1ml再取500ml 10mg/ml HRP酶，4℃反应1小时，再加入500μl1％乙二醇混合均匀，4℃反应1小时，在最终产物中取250μl加入5mg mAb2混合均匀，0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液中透析16小时，中途换一次液，再加入30μl 5mg/ml硼氢化钠终止反应，4℃2小时，用G25脱盐柱离心脱盐得到最终产物为HRP-mAb2酶标记物，加入50％甘油放置-20度保存。mAb2为NLRP3多克隆抗体，以NLRP3截短蛋白免疫小鼠制得。
(2)包被抗体及标记抗体浓度确定
采用棋盘滴定法确定包被抗体及标记抗体的最佳反应浓度
包被：分别取0.05M pH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释NLRP3单抗mAb1，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，包被量分别为50μg、100μg、200μg、400μg，4℃过夜；
封闭：PBST洗液洗3遍拍干，加入封闭液(0.02M PBS+5％脱脂奶粉+0.5％吐温20)，孵育1小时；
样品孵育：PBST洗液洗3遍拍干，每孔中加入浓度为0.1μg/ml的NLRP3截短蛋白100μl作为阳性样品，用PBS作为阴性对照，37℃孵育1小时；
二抗孵育：PBST洗液洗3遍拍干，加入HRP-mAb2每孔100μl，稀释度分别为1:20,1：40,1:80,1:160，37℃孵育1小时；
显色：TMB双组份显色液A液和B液按1:100比例配置好，加入酶标板中，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加入1M H2SO4终止反应。
A液：醋酸钠12.6g+柠檬酸1.6g+过氧化脲0.3g定容至500ml；
B液：EDTA-2Na 0.2g+柠檬酸0.95g+50ml甘油+四甲基联苯二胺0.2g(溶于1mlDMSO中)定容至500ml。
读数：用酶标仪在OD450nm下进行读数。
结果如表3和表4所示：
表3、不同包被抗体和标记抗体浓度的吸光值
Figure BDA0002262402570000081
表4、不同包被抗体和标记抗体浓度的吸光值
Figure BDA0002262402570000082
结果显示，最佳mAb1抗体包被量为200μg/孔，最佳包被浓度2～5μg/mL；标记抗体最佳稀释度为1:80，最佳反应浓度为10～15μg/mL。
实施例6、NLRP3截短蛋白双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测范围的确定
NLRP3截短蛋白双抗体夹心ELISA检测试剂盒标准曲线的绘制及检测范围确定的具体方法如下：
包被：分别取0.05M pH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释NLRP3单抗mAb1，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，包被浓度2～5μg/mL，4℃过夜；
封闭：PBST洗液洗3遍拍干，加入封闭液(0.02M PBS+5％脱脂奶粉+0.5％吐温20)，孵育1小时；
样品孵育：PBST洗液洗3遍拍干，将0.1μg/ml的NLRP3截短蛋白倍比稀释，共稀释11个浓度，用PBS作为阴性对照，37℃孵育1小时；
二抗孵育：PBST洗液洗3遍拍干，加入HRP-mAb2每孔100μl，浓度为10～15μg/mL，37℃孵育1小时；
显色：TMB双组份显色液A液和B液按1:100比例配置好，加入酶标板中，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加入1M H2SO4终止反应。
读数：用酶标仪在OD450nm下进行读数。
结果如表5所示：
表5、不同浓度吸光度
标准品浓度(ng/ml) 吸光度均值
100 3.1459
50 1.4233
25 0.9598
12.5 0.4323
6.3 0.2718
3.2 0.1728
1.6 0.1109
0.8 0.0903
0.4 0.0792
0.2 0.0715
0.1 0.0629
阴性对照 0.0423
绘制的标准拟合曲线附图3，标准曲线拟合方程为y＝0.0303x+0.0661，R2＝0.9949。确定的ELISA检测试剂盒可检测的最小浓度为0.1ng/ml，最大浓度为0.1μg/ml。
实施例7、NLRP3截短蛋白双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测猪肺组织样品的应用
选取猪肺炎支原体、蓝耳病病毒、圆环病毒-2、猪传染性胸膜肺炎检测阴性的5-15日龄健康仔猪40只，随机分成两组，一组为攻毒组接种感染猪肺炎支原体，另一组同样方法接种灭菌的PBS作为对照。于免疫后第7、14、21、28、35天分别采集猪肺组织样品液氮保存。称取0.1mg冻存的猪肺组织样品，加入900μL PBS充分研磨后8000rpm离心10min，取上清-20℃保存作为待检样品。
包被：分别取0.05M PH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释NLRP3单抗mAb1，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，包被浓度2～5μg/mL，4℃过夜；
封闭：PBST洗液洗3遍拍干，加入封闭液(0.02M PBS+5％脱脂奶粉+0.5％吐温20)，孵育1小时；
样品孵育：PBST洗液洗3遍拍干，加入肺组织待检样品，每个样品设用PBS作为阴性对照，37度孵育1小时；
二抗孵育：PBST洗液洗3遍拍干，加入HRP-mAb2每孔100μl，浓度为10～15μg/mL，37度孵育1小时；
显色：TMB双组份显色液A液和B液按1:100比例配置好，加入酶标板中，每孔100μl，37度避光孵育15min，加入1M H2SO4终止反应。
读数：用酶标仪在OD450nm下读取A值。
检测结果如表6所示：
表6、双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测猪肺组织样品结果
取样时间(天) 7 14 21 28 35
对照组A值均值 0.8767 1.0352 0.9842 0.9337 1.0645
攻毒组A值均值 1.0824 1.1662 1.2491 1.4446 1.2919
以实施例6中制作的标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比，并乘以稀释倍数计算待测标本的NLRP3蛋白含量。如附图4得到的结果显示，攻毒组NLRP3表达水平明显高于健康组，且随感染天数增加表达水平升高，至第28天达到最高水平，健康组NLRP3表达水平基本保持稳定。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 海南省农业科学院畜牧兽医研究所
山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 猪NLRP3截短片段在作为抗原结构蛋白中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Met Ala Ser Val Arg Cys Lys Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Glu Asp Val Asp Phe Lys Lys Phe Lys Met His Leu Glu Asp Tyr
20 25 30
Pro Ser Gln Lys Gly Cys Ile Ser Leu Pro Arg Gly Gln Thr Glu Lys
35 40 45
Ala Asp His Val Asp Leu Ala Thr Leu Met Ile Asp Phe Asn Gly Glu
50 55 60
Glu Lys Ala Trp Ala Met Ala Thr Trp Ile Phe Ala Ala Ile Asn Arg
65 70 75 80
Arg Asp Leu Tyr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Glu Pro Glu Trp Asp Asn
85 90 95
Ala Asn Leu Ser Val Ile Ser Gln Glu Glu Ser Leu Glu Glu Glu Trp
100 105 110
Met Gly Leu Leu Gly Tyr Leu Ser Arg Ile Ser Ile Cys Lys Lys Lys
115 120 125
Lys Asp Tyr Cys Lys Lys Tyr Arg Lys His Val Arg Ser Arg Phe Gln
130 135 140
Cys Ile Lys Asp Arg Asn Ala Arg Leu Gly Glu Ser Val Asn Leu Asn
145 150 155 160
Lys Arg Phe Thr Arg Leu Arg Leu Ile Lys Glu His Arg Ser Gln Gln
165 170 175
Glu Arg Glu His Glu Leu Leu Ala Ile Gly Arg Thr Ser Ala Lys Met
180 185 190
Gln Asp Gly Pro Val Ser Ser Leu Asn Leu Glu Leu Leu Phe Asp Pro
195 200 205
Glu Asp Gln His Ser Glu Pro Val His Thr Val Val Phe Gln Gly Ala
210 215 220
Ala Gly Ile Gly Lys Thr Ile Leu Ala Arg Lys Ile Met Leu Asp Trp
225 230 235 240
Ala Ser Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Lys Phe Asp Tyr Leu Phe Tyr Ile
245 250 255
His Cys Arg Glu Val Ser Leu Gly Thr Arg Arg Ser Leu Gly Asp Leu
260 265 270
Ile Ala Ser Cys Cys Pro Gly Pro Asn Pro Pro Ile Gly Lys Ile Val
275 280 285
<210> 2
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagcatgg caagcgtccg ctgcaagctg gctcgttacc tggaggacct agaagatgta 60
gattttaaga aattcaagat gcacttagaa gactatcctt ctcagaaggg ctgcatctct 120
ctccctcggg gccagacaga aaaagcagat catgtggatc tagccactct gatgatagat 180
ttcaatggag aggagaaggc atgggccatg gccacatgga tttttgctgc gatcaacagg 240
agagaccttt atgagaaagc taagagggat gagccagaat gggacaatgc aaatctttct 300
gtgataagcc aggaagaaag ccttgaagag gaatggatgg gtttactggg gtacctttcc 360
agaatctcta tttgtaagaa aaagaaagat tattgtaaga agtacagaaa gcacgtgaga 420
agcagattcc agtgcatcaa agacaggaat gcacgtctgg gtgagagtgt gaacctcaac 480
aaacgcttca ccaggctgcg tctcatcaag gaacaccgga gtcagcagga gagggagcat 540
gagctccttg ccattggcag gacctcagcc aagatgcaag atggccccgt gagttccctg 600
aacttggaat tgctgtttga tcctgaggac caacactctg agcctgtgca cacggtagta 660
ttccagggag cagcaggcat tgggaaaaca atactggcca ggaagatcat gttggactgg 720
gcatcagaga aactttacca ggaaaaattt gactatttgt tttacattca ctgtcgggag 780
gtgagcctag gaactcggag gagcctggga gacctgatcg ccagctgctg ccctggccca 840
aacccaccca taggcaagat tgtg 864

Claims (6)

1.一种猪NLRP3单克隆抗体，其特征在于：所述猪NLRP3单克隆抗体由生物保藏号为CCTCC NO：C201973的杂交瘤细胞分泌。
2.权利要求1所述猪NLRP3单克隆抗体在非疾病诊断中检测或纯化NLRP3蛋白中的应用。
3.含有权利要求1所述猪NLRP3单克隆抗体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为ELSIA试剂盒、胶体金单抗试剂盒。
5.一株稳定分泌猪NLRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株9H5，其特征在于，所述杂交瘤细胞株9H5的生物保藏号为CCTCC NO：C201973。
6.权利要求5所述杂交瘤细胞株9H5在制备猪NLRP3蛋白捕获剂的应用。
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