CN110760482B

CN110760482B - 一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4及单克隆抗体和应用

Info

Publication number: CN110760482B
Application number: CN201911013368.0A
Authority: CN
Inventors: 王建和; 张炼辉; 吴晓妍; 周筱帆; 陈群一
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN110760482A

Abstract

本发明公开了一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4及单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株5A4于2019年10月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2019219。所述杂交瘤细胞株5A4分泌的抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4能够特异地识别柑橘黄龙病菌膜蛋白Cmp1，通过免疫印迹反应证明单克隆抗体mAb 5A4可以特异地识别感病植物叶片组织中的病原菌CLas的膜蛋白Cmp1。该单克隆抗体mAb 5A4可用于制备检测柑橘黄龙病的制剂、试剂盒或试纸条，从而快速便捷地实现田间检测柑橘黄龙病，具有很好的推广应用前景。

Description

一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4 及单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫技术领域，具体地，涉及一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4及单克隆抗体和应用。

背景技术

柑桔黄龙病是一种毁灭性的柑桔病害，在全世界范围内造成巨大的经济损失。柑桔植株感染黄龙病之后，叶片萎缩掉落，结实率下降，果实偏小，颜色黄绿不均，最终导致植株死亡，且柑桔黄龙病传播性极强，短期内可蔓延整个果园。柑桔黄龙病的病原菌是革兰氏阴性细菌，其具有三种致病变种，分别为亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)、非洲种Candidatus Liberibacter africanus(CLaf)、美洲种CandidatusLiberibacter americanus (Clam)。目前针对柑桔黄龙病尚无有效的治疗措施和理想的抗性品种，因此开发高效的黄龙病检测方法，辨别黄龙病、及早预测黄龙病的发生是当前防治黄龙病的主要方向。

目前田间辨别柑桔黄龙病的方法主要是通过观察病害症状，但因为黄龙病病状复杂，难以与其他柑桔病害区分，容易受到环境影响而误诊。实验室诊断黄龙病的方法主要有电镜法、酶法诊断、ELISA、常规PCR、巢氏PCR、qPCR和LAMP等，尽管上述方法可以较为准确地检测黄龙病，但是由于检测设备和技术的门槛、成本较高，上述方法难以广泛地应用在实际田间柑桔黄龙病的检测中。

单克隆抗体在植物病原菌中的应用起步较早，其试材的同质性和均一特异性的优点，为植物病原细菌学中细菌种、小种或系统特异抗体的制作开辟了道路，不仅替代了病害诊断和细菌检出中的多克隆抗体，而且有希望应用于细菌的分类及生理生化研究中。因此，研发能特异性识别黄龙病病原菌的单克隆抗体，可用于开发检测灵敏度高、携带方便的黄龙病检测试纸，有利于控制黄龙病的发生和蔓延。目前有相关专利CN201810132721.6、CN201810132890.X分别报道过针对CLas McAb2、McAb1膜表面蛋白，设计了杂交瘤细胞株并得到其单克隆抗体。但柑橘黄龙病菌的外膜蛋白有很多种，以哪种外膜蛋白作为抗原制作单克隆抗体检测柑橘黄龙病菌的效果最好未见报道，且目前还尚未有针对柑橘黄龙病病菌亚洲种(CLas)膜蛋白Cmp1(WP_015452405.1)的单克隆抗体方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4。

本发明的另一发明目的在于提供上述杂交瘤细胞株5A4分泌的抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

本发明的另一发明目的在于提供上述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备检测柑橘黄龙病菌CLas的制剂中的应用。

本发明的另一发明目的在于提供上述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备快速检测柑橘黄龙病菌CLas的装置中的应用。

本发明的另一发明目的在于提供上述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备田间快速检测柑橘黄龙病菌CLas的试纸条和/或试剂盒中的应用。

本发明的另一发明目的在于提供一种检测柑橘黄龙病的药物和/或制剂。

本发明的另一发明目的在于提供一种柑橘黄龙病的ELISA检测试剂盒。

本发明的另一发明目的在于提供一种柑橘黄龙病的免疫胶体金检测试剂条。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4，所述杂交瘤细胞株5A4于2019年10月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2019219。

上述杂交瘤细胞株的制备方法如下：选取Cmp1其中一段多肽Cmp1p(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)并通过化学合成Cmp1p多肽；制备Cmp1p载体蛋白藕合物BSA-Cmp1p 和OVA-Cmp1p，用弗氏完全佐剂乳化的BSA-Cmp1p藕合物皮下注射BALB/c小鼠，再用弗氏不完全佐剂乳化；最后一次加强免疫后取免疫鼠脾脏，悬浮脾脏组织成游离细胞后用常规技术与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，以产生杂交瘤细胞。用ELISA检测细胞上清液，经过多次有限稀释亚克隆筛选，最后获得稳定分泌、高效价、高特异性的抗 CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5A4，然后进行保藏。

本发明还请求保护由上述杂交瘤细胞株5A4分泌得到的抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4，为IgG₁亚类、包含轻链Kappa。

所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4的制备方法为：用上述保藏编号为CCTCC NO：C2019219的杂交瘤细胞株注射用石蜡油预处理过的BALB/c小鼠生产腹水，腹水经分离纯化后得到抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

体外研究表明，所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4，能够特异地识别并结合化学合成多肽Cmp1p以及Cmp1完整蛋白，从而达到检测CLas的目的。

因此，本发明还请求保护所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备检测柑橘黄龙病菌CLas的制剂中的应用。

由于柑桔黄龙病病菌CLas多侵染柑桔的叶片，且制备柑桔叶片提取物较为简便，单克隆抗体5A4可以用于检测叶片提取物中的CLas，准确地检测出植株的感病情况。

本发明还请求保护所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备快速检测柑橘黄龙病菌CLas的装置中的应用。

本发明还请求保护所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备田间快速检测柑橘黄龙病菌CLas的试纸条和/或试剂盒中的应用。

本发明还请求保护一种检测柑橘黄龙病的药物和/或制剂，包括上述抗CLas膜蛋白 Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

本发明还请求保护一种柑橘黄龙病的ELISA检测试剂盒，包括上述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

本发明还请求保护一种柑橘黄龙病的免疫胶体金检测试剂条，包括上述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4，所述杂交瘤细胞株5A4于2019年10月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2019219。所述杂交瘤细胞株5A4分泌的抗CLas膜蛋白Cmp1 单克隆抗体mAb 5A4能够特异地识别柑橘黄龙病菌膜蛋白Cmp1，通过免疫印迹反应证明单克隆抗体mAb 5A4可以特异地识别感病植物叶片组织中的病原菌CLas的膜蛋白Cmp1。该单克隆抗体mAb 5A4可用于制备检测柑橘黄龙病的制剂、试剂盒或试纸条，从而快速便捷地实现田间检测柑橘黄龙病，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为实施例1中载体蛋白BSA和OVA与多肽Cmp1p耦合的示意图。

图2为实施例1中纯化的抗CLas膜蛋白多肽Cmp1p的单克隆抗体mAb 5A4的 SDS-PAGE电泳图谱；其中，泳道M为分子标记。

图3为实施例1中使用杂交瘤细胞上清液检测到的单克隆抗体亚类和亚型。

图4为实施例2中mAb 5A4检测OVA和OVA-Cmp1p的情况。

图5为实施例2中mAb 5A4检测原核表达GST-Cmp1和GST的情况。

图6为实施例3中mAb 5A4检测柑桔健康柑桔树、亚健康柑桔树和感病柑桔树的叶片Cmp1的情况及TaqMAN检测健康柑桔树、亚健康柑桔树和感病柑桔树的叶片DNA的情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

试验材料：BALB/c小鼠无限制地使用食物和水，在无病原体条件下饲养。用于本发明的所有小鼠均为5～6周龄、体重22～25克。所有动物方案都经中国广州华南农业大学动物实验中心的同意和批准。

实施例1一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4及其分泌的单克隆抗体mAb 5A4的制备和鉴定

一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4，所述杂交瘤细胞株5A4于2019年10月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2019219。

如上所述的杂交瘤细胞株5A4分泌的单克隆抗体mAb 5A4。所述单克隆抗体mAb5A4 是以Cmp1p-蛋白质(BSA或OVA)藕合物作为免疫原所制备的高质量小鼠单克隆抗体(mAb 5A4，IgG₁亚型)。

所述Cmp1p的氨基酸序列为FRREKATISLSAHDKEGSKHTMN。

所述杂交瘤细胞株5A4及其分泌的单克隆抗体mAb 5A4的制备和鉴定如下：

1、BSA-Cmp1p和OVA-Cmp1p的制备

牛血清白蛋白(BSA)和卵白蛋白(OVA)分别用缓冲液溶解(10mg/mL溶于0.1M 碳酸盐缓冲液；质量分数为0.9％的NaCl溶液，pH＝9；质量分数为0.1％的十二烷基硫酸钠溶液)，再加入戊二醛(孵育20μL质量分数为25％的戊二醛水溶液)，闭光于室温下反应1h。然后混合物用碳酸盐缓冲液过Sephadex G-25柱，以除去过量戊二醛。上述产物中加入过量Cmp1p于闭光、室温反应16h。最后加入甘氨酸(1μM终浓度)作用6h以终止反应，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析。冻干所得反应物，即得BSA-Cmp1p藕合物和OVA-Cmp1p藕合物(如图1所示)，储存在-20℃备用。

2、单克隆抗体的制备和鉴定

用弗氏完全佐剂乳化的BSA-Cmp1p藕合物，皮下注射BALB/c小鼠(200μg/只)。四周后连续3次加强免疫(100μg/只)，每次间隔两周，抗原用弗氏不完全佐剂乳化。在最后一次加强免疫3d后取免疫鼠脾脏，用组织培养基(含有4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清的DMEM培养基)悬浮脾脏组织成游离细胞。DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自 GIBCO公司。将细胞悬浮于10mL DMEM培养基中，然后于800×g离心，弃去上清液，并且将细胞沉淀物重悬于10mLDMEM培养基中。用常规技术与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，以产生杂交瘤细胞。用ELISA检测细胞上清液，通过有限稀释法亚克隆，筛选后得到两株阳性杂交瘤细胞株(5A4和2F9)，用BALB/c小鼠生产腹水来大量制备抗体。用得到的单克隆抗体mAb 5A4和单克隆抗体mAb 2F9的细胞培养上清测定了抗体与Cmp1p的相对亲和力。结果表明，单克隆抗体mAb 2F9和单克隆抗体mAb 5A4具有较高的亲和力(mAb 2F9的亲和常数为6.5×10⁹/M，mAb 5A4的亲和常数为7.3×10¹⁰/M)。

为了进一步分析，用矩阵法来确定最佳抗原包被浓度。在检测细胞培养上清中的抗体时，用OVA-Cmp1p包被96孔板。含有阳性单克隆细胞(5A4和2F9细胞)的上清用来测定抗体的效价、特异性和亲和力。阳性单克隆用150mL的细胞培养瓶培养，向用石蜡油预处理过的小鼠腹腔注射阳性单克隆细胞。8～10d后采集腹水，并用硫酸铵沉淀和蛋白A偶联琼脂糖柱纯化免疫球蛋白，使用SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度分析(结果如图 2所示)。

单克隆抗体的亚类和亚型用皮尔斯(Pierce)的ImmunoPure单克隆抗体亚类试剂盒 (HRP/ABTS)测定。用商业小鼠IgG(购自Santa Cruz Biotechnology公司)作特异性分析的对照。单克隆抗体的亚类和亚型分析结果表明，这两种单克隆抗体是IgG1亚类的和包含轻链KAPPA(如图3和表1所示)。

表1单克隆抗体mAb 5A4和mAb 2F9的特征

单克隆抗体	亚类	亚型	细胞上清培养基效价	亲和常数(M<sup>-1</sup>)
					mAb 5A4	IgG1	kapa	1:20000	7.3×10<sup>10</sup>/M
mAb 2F9	IgG1	kapa	1:40000	6.5×10<sup>9</sup>/M

实施例2单克隆抗体5A4对Cmp1p及Cmp1的检测

1、蛋白印迹分析

在进行SDS-PAGE电泳时分别用10μg等质量的OVA-Cmp1p螯合物和OVA上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，400mA，60min转NC膜，取下NC膜用含5％脱脂奶粉的PBST 封闭60min，封闭后取适量单克隆杂交瘤细胞的培养基上清孵育NC膜1h后用PBST洗三遍，每次10min，加入适量浓度(1：2500～1：50000)的HRP标记二抗孵育1h，随后用 PBST洗三遍，每次10min，加入适量发光液ECL并观察。

结果表明，mAb 5A4能特异识别Cmp1p(图4)，但是OVA不能。

2、原核表达蛋白Cmp1及印迹分析

因为Cmp1p为Cmp1(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的其中一段多肽，因此为了验证mAb 5A4抗体与Cmp1完整蛋白结合能力，通过原核表达获得了含有GST标签的 Cmp1蛋白，同时获得GST蛋白作为阴性对照。

具体步骤：合成基因cmp1，cmp1连接至pGEX-6P-1质粒中并转化到BL21(DE3) 菌株，在添加氨苄青霉素的LB培养基上培养到OD_600nm＝0.6～0.8时加入1mM IPTG，于 18℃诱导表达过夜后离心12000rpm、1min，收集菌体，加入适量PBS重悬菌体后加入蛋白酶抑制剂并超声破碎菌体，4℃、12000rpm离心20min后收集上清，用0.22μm细菌过滤器过滤上清，将上清转移至Glutathione Beads孵育去除杂蛋白，洗脱获得目的蛋白，将所得目的蛋白通过superdex increase 75分子筛进一步纯化，最终获得带有GST标签的 Cmp1蛋白产物，聚丙烯酰胺凝胶电泳验证目的蛋白。

结果表明，通过原核表达获得了含有GST标签的Cmp1蛋白，同时获得GST蛋白作为阴性对照(图5a)。

取单克隆细胞系5A4的培养基上清孵育到包被了GST-Cmp1和GST的ELISA板孔内(图5b)，取等量的GST-Cmp1蛋白和GST蛋白与mAb 5A4抗体进行Western blot实验。

结果表明，抗体能与GST-Cmp1结合产生正确条带，而不能与作为阴性对照的GST蛋白结合。即5A4单克隆细胞系产生的抗体既能特异识别并结合Cmp1p多肽，也能结合 Cmp1完整蛋白。

实施例3单克隆抗体mAb 5A4对CLas蛋白的检测应用

1、植物组织DNA提取与TaqMAN qPCR

按照AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit方法提取健康柑桔树、亚健康柑桔树和感病柑桔树叶片组织DNA，称取300mg的新鲜植物组织，剪成小块放入研钵中，加入液氮研磨至粉末状，研磨充分加入350μL PBS，随后按照试剂盒说明书提取DNA。取2μL提取液，合成引物和探针利用Real-Time PCR仪器测定其定量TaqMAN qPCR。

2、植物组织Western blot

取200～300mg健康柑桔树、亚健康柑桔树和感病柑桔树叶片，加入液氮研磨后，加入1mL lysis buffer(含1μL蛋白酶抑制剂、10μL 1M的DTT和10μg 100mM的PMSF)， 4℃孵育30min，期间涡旋混匀3次，于4℃、14000rpm离心10min，取上清并用0.22μm 细菌过滤器过滤后收集为蛋白提取液，并对蛋白定量(Bradford法)，分装保存于-80℃，取等体积健康和感病的蛋白提取液，通过Western blot实验检测分析。

结果表明(图6)，在亚健康叶片组织和感病叶片组织中，SDS-PAGE电泳检测到Cmp1蛋白，且mAb 5A4抗体识别并结合而产生阳性条带。而健康组织中，由于缺少Cmp1蛋白，无论是SDS-PAGE电泳和WB实验均无阳性条带产生，由此表明，mAb 5A4抗体可以检测出感病柑桔叶片中的Cmp1蛋白，即mAb 5A4抗体可以用于检测柑桔叶片中CLas 的存在。

本发明通过制备分泌抗柑橘黄龙病菌CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株 5A4可开发成在田间利用的柑橘黄龙病检测试纸，成为经济、快速和灵敏的检测柑橘黄龙病的方法。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4及单克隆抗体和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)

<400> 1

Phe Arg Arg Glu Lys Ala Thr Ile Ser Leu Ser Ala His Asp Lys Glu

1 5 10 15

Gly Ser Lys His Thr Met Asn

20

<210> 2

<211> 162

<212> PRT

<213> 柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)

<400> 2

Met Asn Phe Arg Ile Ala Met Leu Ile Ser Phe Leu Ala Ser Gly Cys

1 5 10 15

Val Ala His Ala Leu Leu Thr Lys Lys Ile Glu Ser Asp Thr Asp Ser

20 25 30

Arg His Glu Lys Ala Thr Ile Ser Leu Ser Ala His Asp Lys Glu Gly

35 40 45

Ser Lys His Thr Met Asn Ala Glu Phe Ser Val Pro Lys Asn Asp Glu

50 55 60

Lys Tyr Thr Ile Ser Ser Leu Thr Lys Lys Ile Glu Ser Asp Thr Asp

65 70 75 80

Phe Arg Arg Glu Lys Ala Thr Ile Ser Leu Ser Ala His Asp Lys Glu

85 90 95

Gly Ser Lys His Thr Met Asn Ala Glu Phe Ser Val Pro Lys Asn Asp

100 105 110

Glu Lys Tyr Thr Ile Ser Ala Cys Ala Ser Asp Asp Lys Gly Asn Lys

115 120 125

Ser Thr Leu Cys Val Glu Cys Pro Ser Pro Ser Thr Pro Gly Gln Tyr

130 135 140

Asp Leu Asn His Cys Ala Glu Cys Glu Asn Thr Thr Ser Lys Gly Leu

145 150 155 160

Cys Pro

Claims

1.一株分泌抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5A4，其特征在于，所述杂交瘤细胞株5A4于2019年10月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：C2019219。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株5A4分泌的抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb5A4。

3.权利要求2所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备检测柑橘黄龙病菌CLas的制剂中的应用。

4.权利要求2所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4在制备田间快速检测柑橘黄龙病菌CLas的试纸条和/或试剂盒中的应用。

5.一种检测柑橘黄龙病的药物和/或制剂，其特征在于，包括权利要求2所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

6.一种柑橘黄龙病的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。

7.一种柑橘黄龙病的免疫胶体金检测试剂条，其特征在于，包括权利要求2所述抗CLas膜蛋白Cmp1单克隆抗体mAb 5A4。