CN110244046A - 一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条及其制备方法、试剂盒 - Google Patents

一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条及其制备方法、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柑橘黄龙病胶体金检测试剂盒及制备方法，试纸条包括从加样端依次搭接在底板上的样品垫、金垫、NC膜、吸水纸，所述金垫上包被有胶体金标记的第一抗体，所述第一抗体为SDE‑1的单克隆抗体、SDE‑1的兔多克隆抗体或SDE‑1的鼠多克隆抗体，所述NC膜的检测线上包被有第二抗体，所述第二抗体为兔多克隆抗体或鼠多克隆抗体，质控线上包被有第三抗体，所述第三抗体为羊抗兔抗体、羊抗鼠抗体或羊抗大鼠抗体。本发明利用胶体金免疫层析技术，采用直接检验柑橘叶脉等简单易行方法，进而可以得出用于早期发现、早期诊断是否患有黄龙病的检测试剂盒，达到快速、准确、操作简便。

Description

一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条及其制备方法、试剂盒
技术领域
本发明属于生物学检测领域，尤其是涉及一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条及其制备方法、试剂盒。
背景技术
诊断试剂在疾病的预防和诊断方面有很大的作用，作为生物制药的子行业，诊断试剂在20多年的发展过程中，其应用范围不断扩大，胶体金试纸条检测方法具有易学、快速、方便、成本低、无需任何仪器设备条件和所用试剂无毒害性等优点，适合在实际生产当中的各项要求。通过检测剪碎柑橘叶脉通过胶体金呈现出颜色反应。从而判断柑橘是否患有黄龙病。
目前柑橘黄龙病(HLB)的防控原则是，第一，以控制病原为基础；第二，以防除木虱为关键；第三，以政府监管为保障，基于这一原则，可知黄龙病的诊断在综合防控阶段起非常重要的作用：第一，可减少因诊断不清而大量误砍、误伐造成的损失；第二，可减少因诊断不力或存在侥幸心理(因为部分黄化在春夏季有复绿的表现)而出现大批毁园造成的损失。由此可见，胶体金试剂盒有强大的市场需求。
柑橘黄龙病(HLB)是一种柑橘毁灭性病害，当地政府部门通过喷洒农药来进行传染源的控制。针对黄龙病，目前无有效的治疗措施，唯一的方法是在早发现的基础上将树木铲除焚烧，以达到阻止病原体扩散的目的。目前针对黄龙病的检测方法有很多：传统的田间检测，PCR检测，光谱成像检测等。果农能亲自参与的检测只有传统的田间检测依靠经验来观察叶子果实的情况判断是否患有黄龙病，但是此种方法仅能看出以表现出症状的处于中晚期的患病植株，早期患病的植株表现不出症状，还很容易跟营养不良混淆。PCR检测，光谱成像检测等方法不仅价格昂贵并且还不能做到实时监测。但由于地理因素以及生物因素的局限性无法做到全部杀灭；所以柑橘树每年都会受到政府部门的监管，抽样进行PCR检测监控柑橘树是否患有黄龙病，但PCR检测方法价格昂贵，提取方法繁琐，由此对当地果农造成较大的经济压力，而其他方法操作复杂、难以即时使用，因此价格优惠、方便快捷的检测方法，有较大的应用前景、市场潜力及竞争力。直至2018年，我国柑橘栽培面积达4000余万亩，产量达3900多万吨，柑橘是我国栽培面积及产量最大的水果。然而，柑橘黄龙病(HLB)是严重限制我国柑橘产业发展的“癌症”病害之一，一旦感染，目前无法完全根治，这成为限制我国柑橘产业发展的一个重要因素。
目前黄龙病诊断的难点有：A.症状与其他病症比较相似如植物营养不良症；B.病菌在感染植株后通常有很长的潜伏期一般为数月或一年以上；C.病原菌不能体外培养；D.经典方法为PCR检测，但菌体在植株的分布不均，需要采集大量样本，费时费力。可知市场上还没有满足能够田间检测且实时监测植株是否染黄龙病的产品，在这一方面本项目占据极大优势。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条及其制备方法、试剂盒，以解决在实际生活中在柑橘黄龙病的检测普遍依靠PCR的方法进行检测，价格昂贵的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条，包括从加样端依次搭接在底板上的样品垫、金垫、NC膜、吸水纸，所述金垫上包被有胶体金标记的第一抗体，所述第一抗体为SDE-1的单克隆抗体、SDE-1的兔多克隆抗体或SDE-1的鼠多克隆抗体，所述NC膜的检测线上包被有第二抗体，所述第二抗体为兔多克隆抗体或鼠多克隆抗体，质控线上包被有第三抗体，所述第三抗体为羊抗兔抗体、羊抗鼠抗体或羊抗大鼠抗体。
进一步的，所述第一抗体的浓度为4-20ug/ml。
进一步的，所述第二抗体为兔多克隆抗体，所述兔多克隆抗体的浓度为0.2-1.5mg/ml。
进一步的，所述第二抗体为鼠多克隆抗体，所述鼠多克隆抗体的浓度为0.5-2mg/ml。
进一步的，所述第三抗体为的浓度为0.2-1mg/ml。
上述试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备胶体金；
(2)制备包被有胶体金标记的第一抗体的金垫；
(3)制备包被抗原的NC膜：将第二抗体稀释液包被于检测线上，将第三抗体稀释液包被于质控线上；
(4)将样品垫、金垫、NC膜、吸水纸依次粘附在底板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
进一步的，所述胶体金的制备方法包括如下步骤：
称取0.5-2.0g柠檬酸三钠加100ml超纯水，制成浓度为0.5-2.0％的柠檬酸三钠溶液；称取0.5-2.0g氯金酸和100ml超纯水，制成氯金酸溶液并在4℃下保存；称取氯金酸溶液1.0-4.0ml加入100ml超纯水用搅拌加热器加热至沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠溶液2.0-6.0ml，继续搅拌加热3min，直至溶液由深灰色变成酒红色时取出，继续搅拌10min，冷却至室温，用超纯水定容至原体积100ml，用一次性滤膜过滤后，4℃保存备用。
进一步的，所述金垫的制备方法包括如下步骤：
向pH值为7-9的胶体金中加入1-20μg的第一抗体，静置30min-60min后加入封闭物进行封闭，再次静置30min-60min，静置后以7000-12000的转速离心15min-60min收集沉淀，分别对获得的第一抗体的沉淀中加入复溶液对沉淀进行复溶，再将所得复溶的溶液混合，混匀后均匀铺在或喷在玻璃纤维素膜表面，真空冻干、真空抽干或烘干后，即得到包被有胶体金标记的第一抗体的金垫。
进一步的，所述复溶液按重量百分比计包括：0.1％-2％Tris、0％-2％PVP、0.1％-0.5％Tween-20、2％-20％蔗糖、0.1％-1％BSA，余量为水。
进一步的，所述复溶液的添加量为100-1000μL。
进一步的，所述胶体金的pH值通过向每1ml胶体金添加2-20μL 0.2M K2CO3溶液调整。
进一步的，所述封闭物为酪蛋白或质量分数为20％的BSA。
进一步的，所述NC膜的检测线上包被的第二抗体稀释液的制备方法包括如下步骤：将第二抗体用pH为7.0-8.0的碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释即得到第二抗体的稀释液。
进一步的，所述NC膜的质控线上包被的第三抗体稀释液的制备方法包括如下步骤：将第三抗体使用pH为7.0-8.0的碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释至即得到第三抗体的稀释液。
一种柑橘黄龙病胶体金检测试剂盒，包括上述试纸条、刀片、加样滴管、第一溶液，所述第一溶液为PBS、PBS+0.1％～1％Triton-x100或PBS+0.1％～1％Tween20。
相对于现有技术，本发明所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条及其制备方法、试剂盒具有以下优势：
本发明运用细胞生物学、分子生物学、生物化学、免疫学等原理，利用胶体金免疫层析技术，采用直接检验柑橘叶脉等简单易行方法，进而可以得出用于早期发现、早期诊断是否患有黄龙病的检测试剂盒，达到快速、准确、操作简便。
附图说明
图1为本发明双抗夹心法测试结果。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
试剂盒的制备：
取1ml胶体金，加2-17μL的0.2M K2CO3，混合后再加入17μg SDE-1的单克隆抗体，混匀静置60min后加入20μL 20％BSA封闭，再次混匀静置60min离心8000rpm/min弃上清，沉淀用100-1000μL复溶液复溶，均匀铺在玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜上，烘干、真空抽干或真空冻干均可，干燥后密封、干燥保存，即得到包被金垫。
NC膜的制备：
包被工艺：将兔多克隆抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.7mg/ml；将羊抗鼠抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.3mg/ml；将所得稀释液分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用。
将玻璃纤维素膜(样品垫)、上述获得的铺金的金垫、包被抗原的NC膜、吸水纸依次粘附在PVC板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
表1试纸条检测极限的测定结果
SDE-1标准品浓度 检测结果
100ng/ml -
500ng/ml +
1000ng/ml +
2000ng/ml +
3000ng/ml +
4000ng/ml +
阴性对照 -
实施例2
试剂盒的制备：
取1ml胶体金，加2-17μL的0.2M K2CO3，混合后再加入17μg SDE-1的单克隆抗体，混匀静置60min后加入20μL 20％BSA封闭，再次混匀静置60min离心8000rpm/min弃上清，沉淀用510ul复溶液复溶，均匀铺在玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜上，烘干、真空抽干或真空冻干均可，干燥后密封、干燥保存，即得到包被金垫。
NC膜的制备：
包被工艺：将鼠多克隆抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.7mg/ml；将羊抗鼠抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.3mg/ml；将所得稀释液分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用。
将玻璃纤维素膜(样品垫)、上述获得的铺金的金垫、包被抗原的NC膜、吸水纸依次粘附在PVC板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
表2试纸条检测极限的测定
SDE-1标准品浓度 检测结果
100ng/ml -
500ng/ml +
1000ng/ml +
2000ng/ml +
3000ng/ml +
4000ng/ml +
阴性对照 -
实施例3
试剂盒的制备：
取1ml胶体金，加12μL的0.2M K2CO3，混合后再加入17μg SDE-1兔多克隆抗体，混匀静置1h，加20μL 20％BSA封闭，再次混匀静置30min，离心8000rpm/min，弃上清，沉淀用510μL复溶液复溶；
NC膜的制备：
包被工艺：将SDE-1的鼠多克隆抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至1mg/ml，将羊抗兔抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.2mg/ml；将所得稀释液分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用。
将玻璃纤维素膜(样品垫)、上述获得的铺金的金垫、包被抗原的NC膜、吸水纸依次粘附在PVC板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
表3试纸条检测极限的测定
实施例4
试剂盒的制备：
取1ml胶体金，加12μL的0.2M K2CO3，混合后再加入17μg SDE-1兔多克隆抗体，混匀静置1h，加20μL 20％BSA封闭，再次混匀静置30min，离心8000rpm/min，弃上清，沉淀用510μL复溶液复溶。
NC膜的制备：
包被工艺：将SDE-1的兔多克隆抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至1mg/ml，将羊抗兔抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.2mg/ml；将所得稀释液分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用。
将玻璃纤维素膜(样品垫)、上述获得的铺金的金垫、包被抗原的NC膜、吸水纸依次粘附在PVC板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
表4试纸条检测极限的测定
SDE-1标准品浓度 检测结果
100ng/ml -
300ng/ml -
1000ng/ml -
2000ng/ml +
3000ng/ml +
4000ng/ml +
阴性对照 -
实施例5
试剂盒的制备：
取1ml胶体金，加10μL的0.2M K2CO3，混合后再加入15μg SDE-1鼠多克隆抗体，混匀静置1h，加20μL 20％BSA封闭，再次混匀静置30min，离心8000rpm/min，弃上清，沉淀用740μL复溶液复溶；
NC膜的制备：
包被工艺：将SDE-1兔多克隆抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.5mg/ml，将羊抗大鼠抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.3mg/ml；将所得稀释液分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用。
将玻璃纤维素膜(样品垫)、上述获得的铺金的金垫、包被抗原的NC膜、吸水纸依次粘附在PVC板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
表5试纸条检测极限的测定
SDE-1标准品浓度 检测结果
100ng/ml -
300ng/ml -
1000ng/ml +
2000ng/ml +
3000ng/ml +
4000ng/ml +
阴性对照 -
实施例6
试剂盒的制备：
取1ml胶体金，加10μL的0.2M K2CO3，混合后再加入10μg SDE-1兔多克隆抗体，混匀静置1h，加20μL 20％BSA封闭，再次混匀静置30min，离心8000rpm/min，弃上清，沉淀用740μL复溶液复溶；
NC膜的制备：
包被工艺：将SDE-1兔多克隆抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.5mg/ml，将羊抗大鼠抗体用pH＝7.0的PBS缓冲液稀释至0.2mg/ml；将所得稀释液分别固定在NC膜上T线和C线位置上，包被后室温晾干后，密封干燥保存待用。
将玻璃纤维素膜(样品垫)、上述获得的铺金的金垫、包被抗原的NC膜、吸水纸依次粘附在PVC板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
表6试纸条检测极限的测定
SDE-1标准品浓度 检测结果
100ng/ml -
300ng/ml -
1000ng/ml +
2000ng/ml +
3000ng/ml +
4000ng/ml +
阴性对照 -
实施例7
对上述获的试纸条和刀片、加样滴管、PBS溶液组装成试剂盒并进行检测，利用本发明的试纸条分别对患有柑橘黄龙病的样品进行有效的检测，健康的样本15个，染黄龙病的样本20个，加样量80uL，具体操作方法为：用刀片将样本表面刮除部分组织，并用第一溶液溶解，将溶解后的溶液使用加样滴管滴加于试纸条的加样端进行检测，部分检测结果见图1，其中显示阴性结果的均为健康样本，阳性结果的均为染病样本，该检测方法提高了检测效率，能够有效的指导果农对此类疾病的诊断以及后期对于病树的处理。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柑橘黄龙病胶体金检测试纸条，其特征在于：包括从加样端依次搭接在底板上的样品垫、金垫、NC膜、吸水纸，所述金垫上包被有胶体金标记的第一抗体，所述第一抗体为SDE-1的单克隆抗体、SDE-1的兔多克隆抗体或SDE-1的鼠多克隆抗体，所述NC膜的检测线上包被有第二抗体，所述第二抗体为兔多克隆抗体或鼠多克隆抗体，质控线上包被有第三抗体，所述第三抗体为羊抗兔抗体、羊抗鼠抗体或羊抗大鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条，其特征在于：所述第一抗体的浓度为4-20ug/ml，优选为17ug/ml，所述第三抗体为的浓度为0.2-1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条，其特征在于：所述第二抗体为兔多克隆抗体，所述兔多克隆抗体的浓度为0.2-1.5mg/ml。
4.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条，其特征在于：所述第二抗体为鼠多克隆抗体，所述鼠多克隆抗体的浓度为0.5-2mg/ml。
5.权利要求1-4所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备胶体金；
(2)制备包被有胶体金标记的第一抗体的金垫；
(3)制备包被抗原的NC膜：将第二抗体稀释液包被于检测线上，将第三抗体稀释液包被于质控线上；
(4)将样品垫、金垫、NC膜、吸水纸依次粘附在底板上，斩切、组装后即得检测试纸条。
6.根据权利要求5所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述胶体金的制备方法包括如下步骤：
称取0.5-2.0g柠檬酸三钠加100ml超纯水，制成浓度为0.5-2.0％的柠檬酸三钠溶液；称取0.5-2.0g氯金酸和100ml超纯水，制成氯金酸溶液并在4℃下保存；称取氯金酸溶液1.0-4.0ml加入100ml超纯水用搅拌加热器加热至沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠溶液2.0-6.0ml，继续搅拌加热3min，直至溶液由深灰色变成酒红色时取出，继续搅拌10min，冷却至室温，用超纯水定容至原体积100ml，用一次性滤膜过滤后，4℃保存备用。
7.根据权利要求5所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述金垫的制备方法包括如下步骤：
向pH值为7-9的胶体金中加入1-20μg的第一抗体，静置30min-60min后加入封闭物进行封闭，再次静置30min-60min，静置后以7000-12000的转速离心15min-60min收集沉淀，分别对获得的第一抗体的沉淀中加入复溶液对沉淀进行复溶，再将所得复溶的溶液混合，混匀后均匀铺在或喷在玻璃纤维素膜表面，真空冻干、真空抽干或烘干后，即得到包被有胶体金标记的第一抗体的金垫。
8.根据权利要求7所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述复溶液按重量百分比计包括：0.1％-2％Tris、0％-2％PVP、0.1％-0.5％Tween-20、2％-20％蔗糖、0.1％-1％BSA，余量为水，优选地，所述复溶液的添加量为100-1000μL；优选地，所述封闭物为酪蛋白或质量分数为20％的BSA，优选地，所述胶体金的pH值通过向每1ml胶体金添加2-20μL 0.2M K2CO3溶液调整。
9.根据权利要求5所述的柑橘黄龙病胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述NC膜的检测线上包被的第二抗体稀释液的制备方法包括如下步骤：将第二抗体用pH为7.0-8.0的碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释即得到第二抗体的稀释液；所述NC膜的质控线上包被的第三抗体稀释液的制备方法包括如下步骤：将第三抗体使用pH为7.0-8.0的碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释至即得到第三抗体的稀释液。
10.一种柑橘黄龙病胶体金检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一所述的试纸条、刀片、加样滴管、第一溶液，所述第一溶液为PBS、PBS+0.1％～1％Triton-x100或PBS+0.1％～1％Tween20。
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