CN106053806A - 一种hpv免疫胶体金诊断试纸条及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种hpv免疫胶体金诊断试纸条及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速、准确的HPV免疫层析检测试纸条及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的HPV检测法，本发明首次将免疫层析技术应用于HPV抗原蛋白检测，实现了高特异性、高灵敏的检测性能。与现有文献报道的巴氏和HPV‑DNA检测相比，其发明的优点主要包括：检测时间短（5~20分钟）；不需要任何特殊仪器；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低；对温度无特殊需求，无须冷冻，储存运输方便，室温可保存24个月。

Description

一种HPV免疫胶体金诊断试纸条及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测 HPV的免疫层析检测试纸的制备方法及应用，一种应用双抗夹心法原理的胶体金免疫层析法。
背景技术
HPV感染与宫颈癌的关系最初在19世纪70年代提出，此后许多流行病学和分子学研究均毫无疑问的证实了人乳头瘤病毒与宫颈癌的病因学联系。Bosch和Manos等通过收集来自22个国家的宫颈癌活检标本作PCR检测，发现99.7%的肿瘤中都可以检测到人乳头瘤病毒 DNA，而且各国间无显著差异。这是迄今为止所报道人类肿瘤致病因素中的最高检出百分数，同时表明人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的相关具有普遍意义。
HPV感染是宫颈上皮内瘤样病变（CIN）和宫颈癌的明确病因。 Mattheus等报道，在99.7％的浸润性宫颈癌中可以检测到13种高危型HPV，来自世界各国的宫颈癌组织标本的研究发现，人乳头瘤病毒16和18型感染率最高，在检出的所有型别中，人乳头瘤病毒16占50%，人乳头瘤病毒18占14%，人乳头瘤病毒45占8%，人乳头瘤病毒31占5%，其它型别的人乳头瘤病毒占23%。人乳头瘤病毒的型别与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中人乳头瘤病毒16占主要地位（51%的鳞状上皮细胞癌标本），而在宫颈腺状上皮细胞癌（56%腺状上皮细胞癌标本）和宫颈腺鳞细胞癌（39%腺鳞细胞癌标本）中人乳头瘤病毒18占主要地位。人乳头瘤病毒16、18型感染很普遍，没有明显的地区差异，有些人乳头瘤病毒型别有地理位置的差异。我国人乳头瘤病毒感染型别中52和58型检出率较高。在台湾进行的一项研究也表明，52和58型较常见。人乳头瘤病毒45型在非洲西部宫颈癌组织中很常见，而人乳头瘤病毒39和59型仅在美洲的中部和南部宫颈癌组织中出现。
宫颈癌与高危型HPV感染关系密切，其自然病程有一个从宫颈上皮不典型增生到原位癌再到浸润癌的一个连续发生、发展过程大约有10年的时间，所以做好癌前筛查是防治宫颈癌的关键所在。高危型HPV感染可导致宫颈癌及宫颈癌前病变（CIN），而持续性HPV感染与CIN病变进展的关系又甚为密切，故高危型HPV检测对宫颈癌的早期筛查、防治及在预测CIN的自然转归、治疗后的随诊上都有重要的作用。目前采用的HPV检测方法都有共同的局限：费时和操作程序复杂。
病例-对照研究是检验病因假说的一种分析流行病学方法。不论是在拉丁美洲采用准确性较低的检测技术（FISH）进行的大规模流行病学研究，还是采用较高灵敏度检测技术（PCR，HC-II）的研究,所有的结果均显示人乳头瘤病毒感染与宫颈癌有明显的相关性（OR=3.6-254.2），尤其是人乳头瘤病毒16型和18型。Muňoz等在哥伦比亚和西班牙（宫颈癌发病率前者比后者高8倍）进行的人群基础上的病例-对照研究中，包括436例组织学确诊的病例和随机抽取的387例来自病例所在人群的对照，同时采用了三种人乳头瘤病毒 DNA检测技术（ViraPap、SH 和PCR）。这一研究避免了人群和地区的选择性偏移，同时又考虑到检测技术间的差异，在调整了一些混杂因素后三种检测方法都得出相同的结论：在两个国家中人乳头瘤病毒16，18，31，33和35型与宫颈癌均呈强相关性，提示人乳头瘤病毒与宫颈癌具有病因关系。队列研究是用来验证疾病病因假说另一种重要的分析流行病学方法，它能够直接体现人乳头瘤病毒感染与宫颈癌发生的时序性，更有力地验证病因假说。Campion对100例轻度宫颈上皮内病变（CIN I）随访了两年多，56%的人乳头瘤病毒16，18阳性者进展为重度宫颈上皮内病变（CIN III），而人乳头瘤病毒6阳性的对象仅20%发生进展。Murthy等用原位杂交方法的研究显示，63例宫颈不典型增生发展为原位癌，对组织标本检测人乳头瘤病毒16/18，阳性率为68.3%，而44例非进展性不典型增生其阳性率为27.3%，相对危险度为5.9（95%CI：2.5-14.1）,具有显著的统计学意义。此外，在细胞学和分子生物学方面也获得了人乳头状瘤病毒致癌的有力证据。1995年WHO和IARC已将人乳头瘤病毒确定为是宫颈癌的病因。
文献报道HPV检测方法有两种，巴氏涂片（Pap Smear）及HPV-DNA检测技术。巴氏涂片指宫颈脱落细胞涂片 ，是指从子宫颈部取少量的细胞样品，放在玻璃片上，然后在显微镜下研究是否异常。巴氏涂片虽然造价比较低，但灵敏度低，特异度不高，而且需要评估细胞学片子的病理学家。
HPV-DNA检测技术是取病变组织和局部组织粘液、分泌物通过PCR技术进行HPV-DNA检测，该技术具有高灵敏度，但特异度低，检测费用昂贵，且造成高昂的过度治疗费用。
免疫层析法（Immunochromatography）是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当干燥的纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，型成肉眼可见的检测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等，其中纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。
以胶体金作为示踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术（Immunecolloidal gold technique，GICT）。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗环血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团型成牢固结合，由于这种结合式静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其他生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、型状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
与现有技术巴氏涂片和HPV-DNA检测相比，免疫层析法检测的优点主要包括：
（1）使用方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在20分钟内完成；
（2）成本低，不需要特殊的仪器设备；
（3）应用范围广，可适应多种检测条件；
（4）可以进行多项检测，弱阳性样本比较难获得，多项检测可以减省样品，降低成本；
（5）标记物稳定，标记样品在4℃储存两年以上，无信号衰减现；
（6）胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害；
在自体免疫性疾病诊断方面，已出现较多的免疫层析试纸，但基于HPV检测的免疫层析试纸在国内外市场上仍没有问市。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用到HPV的检测中，通过把抗HPV抗体蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上，实现对样品中HPV的高特异、高灵敏度、高准确性的检测，快速筛查HPV阳性标本，为宫颈癌的筛查和治疗提供快速的辅助诊断。
本发明的目的之一在于提供一种快速、准确的HPV免疫层析检测试纸条及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的HPV检测法。
作为本发明的一种HPV免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板，分析膜上设置检测带和质控带，所述底板的上部贴合有分析膜，分析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，结合垫上部的一端贴合有样品垫。
所述的结合垫结合纳米金标记物，结合垫为一层。
所述HPV免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤1:结合垫(2)的制备
（1）纳米金标记物的制备：用纳米金溶液标记HPV单克隆抗体
（2）结合垫(2)的制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，将步骤(1)制备的纳米金标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。
步骤2.分析膜（3）制备
A.检测带T线（4）制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被抗体，如结合垫上的结合蛋白含HPV单克隆抗体，检测带T线包被蛋白是抗人HPV IgG抗体。
B.质控带C线(5)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择质控带C线包被抗体，如结合垫上的标记蛋白是抗人HPV IgG抗体，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体。
步骤3.样品垫制备
将玻璃纤维膜或聚脂膜经处理液浸渍烘干备用，或者直接使用。
步骤4.试纸条组装
把步骤1~ 3所制做完成的材料，按图1搭接，根据底版的规格切割成一定的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。优选地，试纸条长度为6.5㎜，宽度为3㎜或4㎜。
所述的抗HPV的抗体是以HPV为免疫源，鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆忼体或多克隆抗体。
所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体，比如该抗人IgG抗体是鼠抗人IgG，它的抗体是羊抗鼠IgG的抗体或其他非鼠源的鼠IgG抗体。
在本发明的另一方面，提供一种HPV检测方法，用本发明第一方面方法及步骤所制备的HPV免疫层析试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤：
（1）样本处理：取血清、血浆或全血样本；
（2）把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5~ 20分钟，观察T线和C线；
（3）结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C 线显现，结果为阴性；T线和C线均不显现，提示试纸失效。
本发明的检测原理：
选用金标标记抗HPV抗体，喷涂在结合垫上，制呈结合垫；在检测带上包被能与标记抗体，目的物蛋白复合物发生免疫反应的抗体，当把待检样本加样到样品垫上后，样本中的HPV蛋白与结合垫上的标记抗体形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫方向泳动，此复合物与包被与检测带T线上的抗体发生特异性免疫结合反应，形成金标抗HPV抗体- HPV抗原蛋白-抗HPV抗体三联体复合物而被截留在检测在线，逐渐富集形成较深的紫红色条带；由于毛细效应继续泳动向前，金标标记抗HPV抗体与包被在质控线上的IgG多抗发生特异性的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出线条带的判为阳性结果；若血清样品中不含有HPV，标记抗体到达检测线时，不与包被在检测线上的相应抗体发生免疫反应，因此在检测线处没有出现显色带，而金标标记HPV抗体继续泳动向前与包被于质控线处的相应包被IgG多抗发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。
本发明的有益效果：本发明首次将免疫层析技术应用于HPV抗原蛋白检测，实现了高特异性、高灵敏的检测性能。与现有文献报道的巴氏和HPV-DNA检测相比，其发明的优点主要包括：检测时间短（5~ 20分钟）；不需要任何特殊仪器，；操作简便，只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低；对温度无特殊需求，无须冷冻，储存运输方便，室温可保存24个月。
附图说明
图1本发明的侧面结构示意图1。
图2为本发明检测带为1条时阳性和阴性结果示意图。
图2中a是条带示意图；b为阳性结果；c为阴性结果；d和e表示试纸条失效。
具体实施方式
本发明所述的HPV检测免疫层析试纸，如图1所示，该试纸是在底板7上由一侧向另一侧顺次相互搭接地粘贴分析膜3、结合垫2、样品垫1、吸水垫6。
结合垫2上喷涂有金标标记蛋白，分析膜3上设置检测带4和质控带5，根据结合垫上标记蛋白的不同，选用相应的检测带包被蛋白和质控带包被蛋白。优选地，在结合垫上喷涂的标记蛋白为鼠抗人HPV抗体，则检测带上的包被蛋白为抗人HPV单克隆抗体，质控带上的包被蛋白为抗鼠IgG多克隆抗体。
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
实施例1金标试纸各组分制备：
1胶体金液制备：将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入每100mL HAuCl4溶液加入适量的还原剂溶液，颜色从蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7~10min出现透明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜（0.45uM）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色颗粒状沉淀物杂质时弃用。
其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠、鞣酸-柠檬酸三钠、白磷，优选使用柠檬酸三钠，更优选地使用1%柠檬酸三钠。其中所用的玻璃容器应绝对清洁，用前需经酸洗。其水应为去离子超纯水。
胶体金溶液制备过程中，各溶液的配制方法如下：HAuCl4的配制：用超纯水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4℃备用，有效期三个月；1000mL1% HAuCl4溶液配方：10g HAuCl4、超纯水定容至1000mL；1%柠檬酸三钠（Sodium Citrate）的配制：用超纯水溶解Sodium Citrate，配成1%溶液，0.22uM膜滤过，现配现用。
金标蛋白制备：本发明待标记金标蛋白包括但不限于鼠抗人HPV IgG抗体、兔抗人HPV IgG抗体、羊抗人HPV IgG抗体。用0.1M碳酸钠调节胶体金pH7.0~8.5，按每毫升胶体金溶液缓慢加入5~25ug待标记蛋白，混匀，静置10~30min，然后加入BSA至终浓度0.5~1%，混匀，静置5~10min，3000rpm离心5min，去沉淀，将上层溶液转至新管，9000rpm离心30min，去上清，加入重悬液至原量，将溶液移至新管，9000rpm再次离心30min，加入用十分之一初始体积的保存液将沉淀重悬，置4℃备用。
3分析膜制备：分析膜选择：分析膜的材质可选硝酸纤维素膜（NC）或醋酸纤维素膜，商品化的硝酸纤维素膜包括S&SAE99、whatman8um、millipore M135、sartorius CN140等。使用哪种规格的具体NC膜或醋酸纤维素膜不是本发明的关键，但是在每次测定中，上述几种NC膜可以作为优选。不同厂家使用的含不同表面活性剂的不同缓冲液处理的膜，与所用检测线抗体溶液亲和力有不同程度的差距，也会很大程度造成线条不均匀，拖带或是弥散的现象，因此运用组装试纸来选择优选的NC膜。
分析膜制备：用包被缓冲液稀释检测待包被蛋白至0.5~1.5mg/mL浓度，用划膜喷金仪，距离结合垫1cm处，以0.5~1.5uL/cm喷涂于膜上，构成检测带4，质控带5，检测带与质控带距离约5mm，质控带同时距离吸水垫约1cm。分析膜37℃烘干，封装备用。
所使用的包被缓冲液可以是硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、Tris-HCl或Tris-磷酸盐等，缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使蛋白牢固包被于NC膜，缓冲液pH值一般约为6~9.5范围内，优选为6.5~7.5的中性缓冲范围内，且最优选缓冲液的pH值为7.0~7.4范围内。
A分析膜1：
检测带T线：将鼠抗人HPV单克隆抗体与pH为7.2的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为0.4mg/mL混合溶液，喷在硝酸纤维素膜上，涂布量为1uL/cm。
质控带C线：将羊抗鼠IgG多克隆抗体与pH为7.5的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为0.5mg/mL混合溶液，喷在硝酸纤维素膜上，涂布量为1uL/cm。
B分析膜2
检测带T线：将兔抗人HPV单克隆抗体与pH为7.2的10mM 碳酸盐缓冲溶液混合配制成为浓度为0.4mg/mL混合溶液，喷在硝酸纤维素膜上，涂布量为1uL/cm。
质控带C线：用pH为7.5的10mM碳酸盐缓冲溶液配制羊抗兔IgG多克隆抗体，浓度为0.5mg/mL，喷在NC膜上，涂布量为1uL/cm。
C分析膜3
检测带T线：用pH为7.2的10mM PB缓冲溶液配制羊抗人HPV单克隆抗体，浓度为0.4mg/mL，喷在硝酸纤维素膜上，涂布量为1.2uL/cm。
质控带C线：用pH为7.5的10mM PB缓冲溶液配制马抗羊IgG多克隆抗体，浓度分别为0.5mG/mL和0.6mG/mL，1:1混合，喷在硝酸纤维素膜上，涂布量为1uL/cm。
4结合垫的制备
结合垫的处理：结合垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸泡结合垫，在37℃下1h烘干后，将抗体或者蛋白以4uL/cm的用量喷涂在预处理的聚酯膜上，37℃干燥1h后得结合垫，结合垫置于2~8℃的环境下备用；结合垫处理液的组成为：pH为7.0~9.0的10mM PB缓冲溶液，含1%BSA，10~20%蔗糖，0.1% Tween-20。结合垫也可不做预处理，直接使用，本次所用结合垫材质为聚酯膜。
A结合垫1 聚酯膜，单层，鼠抗人HPV单抗；
B结合垫2 聚酯膜，单层，兔抗人HPV单抗；
C结合垫3聚酯膜，单层，羊抗人HPV单抗。
5样品垫的制备：
样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，在37℃下1h烘干，样品垫缓冲液的组成为：pH为7.0~9.0的10mM PB缓冲溶液，含1%BSA，10~20%蔗糖，0.1%Tween-20。样品垫也可不做预处理，直接使用，此次所用样品垫材质为玻璃纤维素膜。
实施例2 胶体金标记抗HPV抗体蛋白检测试纸1~3制备
用裁切机将实施例1制备的并干燥的样品垫、结合垫、分析膜、吸水纸分别剪切1.7cm、0.8cm、2.5cm和1.5cm宽的窄条，按图1方式搭接成大板，用切条机将大板切成单人份，每人份宽度根据底板卡壳的不同而异，本发明优选3mm宽度。将单人份已切好的试纸组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结果显示窗对应检测区和质控区，组装时温度控制在25~37℃，湿度20~30%。
金标试纸条1~3的各组分如下表：
结合垫 分析膜 宽度
金标试纸条1 聚酯膜，单层，鼠抗人HPV单抗 NC膜，T线鼠抗人HPV单克隆抗体，C线羊抗鼠IgG多克隆抗体 3mm
金标试纸条2 聚酯膜，单层，兔抗人HPV单抗 NC膜，T线兔抗人HPV单克隆抗体，C线羊抗兔IgG多克隆抗体 3mm
金标试纸条3 聚酯膜，单层，羊抗人HPV单抗 NC膜，T线羊抗人HPV单克隆抗体，C线马抗羊IgG多克隆抗体 3mm
实施例3样本处理
血清样本：取全血1~5mL于血清采集管中，静置30min~2h，3000~5000g离心5~10min，取上清即得。根据试纸条的检测精度，把样本用加样缓冲液稀释0~100倍，取50~100uL滴加到试纸条的加样孔中，静置5~20min后观察结果。
血浆样本：取全血1~5mL于枸橼酸钠或肝素钠抗凝管中混匀，1000~3000g离心5~10min，取上清即得到血浆样本。根据试纸条的检测精度，把样本用加样缓冲液稀释0~100倍，取50~100uL滴加到试纸条的加样孔中，静置5~20min后观察结果。
全血标本：取指尖或耳垂新鲜血约50uL，滴加到加样孔中，马上用50uL加样缓冲液滴加到加样孔中稀释，静置5~20min后观察结果。

Claims (7)

1.一种HPV免疫层析检测试纸条，包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，所述检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上，其特征在于：HPV IgG单克隆抗体结合在结合垫(2)上或包被在检测带T线(4)上。
2.根据权利要求1所述的HPV免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述的结合垫(2)包被胶体金标记物或胶乳标记物。
3.根据权利要求1所述的HPV免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述的结合垫(2)为一层，且与分析膜搭接。
4.一种HPV免疫层析检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：结合垫(2)的制备：
(1) 纳米金标记物的制备：用纳米金溶液标记HPV单克隆抗体；
(2) 结合垫(2)的制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，将步骤(1)制备的纳米金标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用；
步骤2：分析膜(3)的制备：
A、检测带T线(4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被抗体，如结合垫上的结合蛋白含HPV单克隆抗体，检测带T线包被蛋白是抗人HPV IgG抗体；
B、质控带C线(5)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择质控带C线包被抗体，如结合垫上的标记蛋白是抗人HPV IgG抗体，质控带C线的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体；
步骤3：样品垫(1)制备：将玻璃纤维膜或聚脂膜经处理液浸渍烘干备用；或者直接使用；
步骤4：把步骤1 ~ 3所制作完成材料，根据底板的规格切割成一定的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。
5.根据权利要求4所述的一种HPV免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的抗人IgG抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的一种HPV免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的抗人IgG抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体。
7.一种HPV免疫层析检测方法，其特征在于：用根据权利要求1~ 3所述的免疫层析试纸条对待检样品进行检测，具体步骤包括：
(1) 样本处理：取血清、血浆、或全血样本，用加样缓冲液稀释 1~ 100倍；
(2) 把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5~ 30分钟，观察T线和C线；
(3) 结果判读：T线和C线均显现结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阳性；T线和C线均不显现或其他现象，提示试纸失效。
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