CN115629212A - 一种猴痘病毒抗原检测试剂、试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猴痘病毒抗原检测试剂、试剂盒及制备方法,该检测试剂以将猴痘病毒A29L作为特异性靶点,制备猴痘病毒检测试剂或检测试剂盒,不但灵敏度高,而且特异性强;其通过样品垫、样品垫处理液可以提升试剂的样本兼容性。样品垫处理液中EDTA‑4Na螯合剂和样本提取液中的磷酸缓冲体系相互作用,形成抗干扰能力强且具有缓冲能力的复合体系,有效缓冲不同样本间的电解质,适用于多种检测样本,如口咽拭子、体液、血液和皮肤病灶组织(包括水疱液、脓疱液、痂皮等)。
Description
技术领域
一种猴痘病毒抗原检测试剂、试剂盒及制备方法,属于体外诊断技术领域。
背景技术
自2022年5月13日以来,多国相继报告发现猴痘病毒感染确诊病例。2022年5月21日,世界卫生组织发布猴痘疫情暴发预警,并将此次在中非和西非以外国家引发的猴痘疫情定义为“极度不寻常事件”。截至2022年5月26日,已有英国、美国、以色列、加拿大等23个国家报告的猴痘病毒感染确诊病例共计257例,疑似病例120例。
猴痘是一种由猴痘病毒(Monkeypox virµs,MPXV)感染所致的人兽共患病毒性疾病,主要流行于中非和西非。猴痘病毒(MPXV)在电镜下猴痘病毒颗粒呈砖形或椭圆形,大小为200nm×250nm,有包膜,病毒颗粒包括结构蛋白和DNA依赖的RNA多聚酶,基因组为双链DNA,长度约197 kb。猴痘病毒的潜伏期较长,潜伏期为5-21天,通常为6至13天。猴痘病毒(MPXV)归类于痘病毒科正痘病毒属,发病早期出现寒战、发热,体温多在38.5℃以上,可伴头痛、嗜睡、乏力、背部疼痛和肌痛等症状。多数患者出现颈部、腋窝、腹股沟等部位淋巴结肿大。发病后1~3天出现皮疹,皮疹经历从斑疹、丘疹、疱疹、脓疱疹到结痂几个阶段的变化,疱疹和脓疱疹多为球形,直径约0.5~1厘米,质地较硬,可伴明显痒感和疼痛。人主要通过接触感染动物病变渗出物、血液、其它体液,或被感染动物咬伤、抓伤而感染,病毒经黏膜和破损的皮肤侵入人体。人与人之间主要通过密切接触传播,飞沫传播,接触被病毒污染的物品也有可能感染,还可通过胎盘垂直传播,尚不能排除性传播病毒。
根据世界卫生组织2022年5月23日发布的《猴痘病毒实验室检测》中期指导文件内容,实验室确认猴痘的建议样本类型是皮肤病变材料,包括病变表面和/或渗出物拭子、多个以上病变的表层或病变结痂。标本应在收集后1小时内冷藏(2至8°C)或冷冻(-20°C或以下)。目前,国内外检测猴痘病毒的主要检测方法是生物学的聚合酶链反应PCR,需要依赖设备,对检测设备或平台要求较高,取样困难且较易产生污染。目前尚未建立除PCR检测法外的其他诊断方法,因此建立快速准确的猴痘病毒诊断方法迫在眉睫。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供了一种猴痘病毒抗原检测试剂、试剂盒及制备方法,以猴痘病毒A29L蛋白作为特异性结合靶点,制备出的检测试剂或检测试剂盒,可以快速准地确定猴痘病毒的感染情况,且灵敏度高。
为解决上述技术问题,本发明提供一种猴痘病毒A29L蛋白作为特异性靶点在制备猴痘病毒检测试剂中应用。猴痘病毒A29L蛋白全长110个氨基酸,分子量为12.55KDa,申请人选取第17-34位(氨基酸序列为:TEFFSTKAAKNPETKREA)和第88-110位(氨基酸序列为:LRAAMISLAKKIDVQTGRRPYE)作为特异性表位制备猴痘病毒检测试剂。该猴痘病毒检测试剂可以用来检测生物样本中是否感染猴痘病毒。该应用包括将来自机体的生物样品与检测试剂相接触,检测样本中是否有猴痘病毒。所述检测试剂可以为抗猴痘病毒A29L蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体或抗原结合片段,在不同的检测平台上与猴痘病毒A29L蛋白特异性结合,并显示检测结果。作为一个实施例,检测平台可以是分子检测平台或免疫检测平台。作为另一个实施例,分子检测平台可以是PCR检测试剂,针对猴痘病毒A29L蛋白上特异性位点设计引物探针,进行核酸检测。作为另一个实施例,免疫检测平台可以是免疫层析检测、酶联免疫或化学发光检测等。优选地,免疫检测平台可以为胶体金双抗夹心层析检测,针对A29L蛋白上两个不同的位点制备抗体或抗原结合片段,作为一抗和二抗,通过在试纸条上显色表示待测样本是否含有猴痘病毒。
作为本发明的一个目的,提供了一种猴痘病毒A29L蛋白作为特异性靶点在制备猴痘病毒抗原检测试剂盒中应用。猴痘病毒A29L蛋白全长110个氨基酸,分子量为12.55KDa,申请人选取第17-34位(氨基酸序列为:TEFFSTKAAKNPETKREA)和第88-110位(氨基酸序列为:LRAAMISLAKKIDVQTGRRPYE)作为特异性表位制备猴痘病毒检测试剂。该猴痘病毒检测试剂可以用来检测生物样本中是否感染猴痘病毒。该应用包括将来自机体的生物样品与检测试剂相接触,检测样本中是否有猴痘病毒。所述检测试剂可以为抗猴痘病毒A29L蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体或抗原结合片段,在不同的检测平台上与猴痘病毒A29L蛋白特异性结合,并显示检测结果。作为一个实施例,检测平台可以是分子检测平台或免疫检测平台。作为另一个实施例,分子检测平台可以是PCR检测试剂,针对猴痘病毒A29L蛋白上特异性位点涉设计引物探针,进行核酸检测。作为另一个实施例,免疫检测平台可以是免疫层析检测、酶联免疫或化学发光检测等。优选地,免疫检测平台可以为胶体金双抗夹心层析检测,针对A29L蛋白上两个不同的位点制备抗体或抗原结合片段,作为一抗和二抗,通过在试纸条上显色表示待测样本是否含有猴痘病毒。
作为本申请的另一个目的,提供一种猴痘病毒抗原检测的试剂盒,包括抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ和抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ。
进一步,所述试剂盒还包括样本提取液和采样拭子。
进一步,所述样本提取液含有浓度为0.01M PBS缓冲液、质量分数为0.5-1%的吐温20和体积百分数为0.05%的Proclin-300,其中,PBS缓冲液的pH7.2。
所述试剂盒可以为免疫层析试剂盒、酶联免疫试剂盒或化学发光试剂盒。作为本申请的一个具体实施例,酶联免疫试剂盒可以包括酶标板、抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ、显色液、终止液、稀释液、洗涤液和标准品,其中酶标板包被抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ;试剂盒的制备可以采用常规的方法,在此不做赘述;作为本申请的另一个具体实施例,化学发光试剂盒可以包括中性亲和素或链霉亲和素偶联磁微球、生物素化的抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ、吖啶酯标记的抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ,校准品、样本稀释液和化学发光底物;试剂盒的制备可以采用常规的方法,在此不做赘述。
进一步地,作为本申请优选的具体实施例,所述免疫层析试剂盒包括检测卡,检测卡包括:底板、样品垫、结合垫、滤血垫、硝酸纤维素膜和吸水纸;底板为PVC板;所述的样品垫、结合垫、滤血垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上;结合垫上喷涂有鸡IgY抗体和抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ标记的示踪标志物,示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒,划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为:C线、T线,其中C线包被羊抗鸡IgY抗体,T线包被的抗体为抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ。本申请,C线包被抗体为羊抗鸡IgY抗体,与现有技术中采用的羊抗鼠IgG抗体相比,可以避免或减小检测过程与检测抗体发生交叉反应,从而影响检测结果的准确性,进而大大的提高了检测灵敏度及检测准确度。
进一步,所述试剂盒还包括外壳,检测卡组装在上壳和下壳扣合而成的外壳中,上壳上设置有加样孔和观察窗,加样孔对应于样品垫,观察窗对应于T线和C线。
进一步,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ的浓度为0.5-2mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ的浓度为2-20µg/mL;优选地,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ的浓度为1-2mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ的浓度为8-18 µg/mL ;更优选地,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ的浓度为1.5mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ的浓度为15µg /mL。
作为本发明的另一个目的,提供一种上述猴痘病毒抗原检测的试剂盒的制备方法,具体过程如下:
1)胶体金结合垫的制备:取1mL的胶体金,加入2µL的K2CO3,涡旋混匀;加入10µg的抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ,涡旋混匀;在室温条件下静止孵育1h,每隔0.5h涡旋混匀;加入250µL的封闭液,涡旋混匀;在室温条件下静止孵育1h,每隔0.5h涡旋混匀;离心6000rpm,30min,去除上清;加入50µL保存液,涡旋混匀;用喷金仪按4µL/cm溅射于聚酯膜上,37℃干燥2h,制得胶体金结合垫;
2)样品垫的制备:将8964玻璃纤维素膜用样品垫处理液浸湿,样品垫处理液的用量为5mL/条,37℃干燥过夜,制得样品垫;
3)NC膜划线:用划膜缓冲液分别将C线抗体和T线抗体稀释;将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上,划液量:1μL/cm;划膜速度:50mm/s;将划好的硝酸纤维素膜置于35-45℃环境烘干2-12h;其中,划膜缓冲液包括浓度为20mM的Tris-HCl,质量分数为20%的蔗糖,pH8.2;
4)组装、成品。
进一步,所述封闭液包括质量分数为5-10%的BSA。
进一步,所述保存液包括浓度为20mM 的Tris-HCl缓冲液、质量分数为0.5-1%的酪蛋白、质量分数为1-2%的蔗糖、质量分数为0.5-1%的海藻糖、以及质量分数1-2%的BSA,其中,Tris-HCl缓冲液的pH8.2。
进一步,所述样品垫处理液包括浓度为20mM的 Tris-HCl缓冲液,浓度为100mM的柠檬酸三钠,质量分数为0.5-1%的PVP40,体积分数为0.05-0.1%的吐温20,质量分数为0.3%的EDTA-4Na,浓度为1.0mg /mL的抗体阻断剂;其中,Tris-HCl缓冲液的pH8.2。
作为本发明的另一个目的,提供一种利用上述的试剂或试剂盒进行猴痘病毒抗原检测的非疾病诊断的检测方法。
进一步,检测样本为离体的口咽拭子、体液、血液或皮肤病灶组织,其中,皮肤病灶组织为水疱液、脓疱液或痂皮。
本发明所达到的有益技术效果:
1.本发明公开了将猴痘病毒A29L作为特异性靶点,制备猴痘病毒检测试剂或检测试剂盒,不但灵敏度高,而且特异性强。
2.利用该靶点制备的试剂盒,其通过样品垫、样品垫处理液可以提升试剂的样本兼容性。样品垫处理液中EDTA-4Na螯合剂和样本提取液中的磷酸缓冲体系相互作用,形成抗干扰能力强且具有缓冲能力的复合体系,有效缓冲不同样本间的电解质,适用于多种检测样本,如口咽拭子、体液、血液和皮肤病灶组织(包括水疱液、脓疱液、痂皮等)。
3.同时,样本提取液和样品垫中添加表面活性剂、亲水性聚合物、抗体阻断剂等,可有效防止样本中的脂肪、细菌、细胞碎片、红细胞等因素与抗原、抗体非特异性结合,在保护待测抗原的基础上,降低假阳出现的几率,提高检测准确度。
附图说明
图1为本发明之具体实施例所示猴痘病毒检测试剂盒结构示意图;
图2为本发明之具体实施例所示猴痘病毒检测试剂盒检测结果示意图;
图3A-图3F为本发明之具体实施例所示猴痘病毒检测试剂盒针对不同样本源的检测结果图;其中,图3A为口咽拭子样本,图3B为体液样本,图3C为血液样本,图3D为水疱液样本,图3E为脓疱液样本,图3F为痂皮样本;
图4A-图4F为本发明之对比例所示试剂盒一针对不同样本源的检测结果图;其中,图4A为口咽拭子样本,图4B为体液样本,图4C为血液样本,图4D为水疱液样本,图4E为脓疱液样本,图4F为痂皮样本;
图5A-图5F为发明之对比例所示试剂盒二针对不同样本源的检测结果图;其中,图5A为口咽拭子样本,图5B为体液样本,图5C为血液样本,图5D为水疱液样本,图5E为脓疱液样本,图5F为痂皮样本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,实施例中未注明具体条件,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1 用于猴痘病毒检测的免疫层析试剂盒
如图1所示,所述免疫层析试剂盒包括检测卡,检测卡包括:底板6、样品垫5、结合垫3、滤血垫4、硝酸纤维素膜2和吸水纸1;底板6为PVC板;所述的样品垫5、结合垫3、滤血垫4、硝酸纤维素膜2和吸水纸1依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板6上;结合垫3上喷涂有分别用抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ和鸡IgY抗体标记的示踪标志物,示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒,划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为:C线、T线,其中C线包被羊抗鸡IgY抗体,T线包被的抗体为抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ。
所述试剂盒还包括外壳,检测卡组装在上壳和下壳扣合而成的外壳中,上壳上设置有加样孔和观察窗,加样孔对应于样品垫,观察窗对应于T线和C线。
具体制备过程如下:
1)结合垫的制备:取1mL的胶体金,加入2µL的K2CO3,涡旋混匀;加入抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ,涡旋混匀;在室温条件下静止孵育1h,每隔0.5h涡旋混匀;加入250µL的封闭液,涡旋混匀;在室温条件下静止孵育1h,每隔0.5h涡旋混匀;离心6000rpm,30min,去除上清;加入50µL保存液,涡旋混匀;用喷金仪按4µL/cm溅射于聚酯膜上,37℃干燥2h,制得胶体金结合垫;
2)样品垫的制备:将8964玻璃纤维素膜用样品垫处理液浸湿,样品垫处理液的用量为5mL/条,37℃干燥过夜,制得样品垫;
3)NC膜划线:用划膜缓冲液分别将C线抗体羊抗鸡IgY和T线抗体抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ稀释;将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上,划液量:1μL/cm;划膜速度:50mm/s;将划好的硝酸纤维素膜置于35-45℃环境烘干2-12h;其中,划膜缓冲液包括浓度为20mM的Tris-HCl,质量分数为20%的蔗糖,pH8.2;
4)组装、成品。
将检测卡、样本提取液、采样拭子和说明书装盒即为猴痘病毒检测的免疫层析试剂盒成品。
其中:所述封闭液为质量分数为5-10%的BSA;所述保存液包括浓度为20mM 的Tris-HCl缓冲液、质量分数为0.5-1%的酪蛋白、质量分数为1-2%的蔗糖、质量分数为0.5-1%的海藻糖、以及质量分数1-2%的BSA,其中,Tris-HCl缓冲液的pH8.2。所述样品垫处理液包括浓度为20mM的 Tris-HCl缓冲液,浓度为100mM的柠檬酸三钠,质量分数为0.5-1%的PVP40,体积分数为0.05-0.1%的吐温20,质量分数为0.3%的EDTA-4Na,浓度为1.0mg /mL的抗体阻断剂;其中,Tris-HCl缓冲液的pH8.2。
实施例2 猴痘病毒检测方法
采用实施例1制备的猴痘病毒检测试剂盒针对猴痘病毒的检测过程如下:
(1)检测:
a、检测样本可以为口咽拭子、体液、血液和皮肤病灶组织,其中皮肤病灶组织包括水疱液、脓疱液或痂皮;
b、在试剂管中加入400µL样本提取液;
c、取样过程:
口咽拭子:用取样拭子擦拭舌根及两侧扁桃体至少三次;痂皮:用消毒镊子收集;体液、水疱液或脓疱液:用取样管收集100µL;将收集的样本浸入样本提取液中,充分搅拌均匀,作为待测样品液;
d、滴加100µL全血或步骤c制得的待测样品液到检测卡的加样孔,待测样品液通过加样孔到达试纸条,15分钟观察结果,20分钟后结果无效;
(2)结果判断:
a、阳性:若样本中含有猴痘病毒,在经过所述结合垫的过程中,与胶体金标记的抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ特异性结合形成复合物;所述复合物在经过硝酸纤维素膜的过程中,与T检测线上包被的抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ特异性结合;则T检测线处出现红色或紫红色,样本为猴痘病毒抗原阳性,参照图2。
b、阴性:当样本中不含有猴痘病毒,则T检测线未出现红色或紫红色,C质控线出现红色或紫红色,样本为阴性,参照图2。
c、无效:当C质控线未出现红色或紫红色,则表明胶体金失效或者实验操作有误,实验结果无效,需要重新检测,参照图2。
实施例3 猴痘病毒检测实验
1.本发明试剂盒检测效果试验:将猴痘病毒重组抗原,分别采用经处理的口咽拭子样本液、体液样本液、血液样本液、水疱液样本液、脓疱液样本液和痂皮样本液梯度稀释至1000、100、50、20、10pg/mL制作待测样本。采用实施例1的试剂盒对各个待测样本进行检测,每个梯度重复测试20次,检测结果取平均值。其中,所用抗体浓度分别:抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ的浓度为1.5mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ的浓度为15μg/mL,羊抗鸡IgY抗体的浓度为1.5mg/mL。检测结果如表1、图3A-图3F所示,其中图3A对应表1中本申请试剂盒针对口咽拭子样本的检测结果;图3B对应表1中本申请试剂盒针对体液样本的检测结果;图3C对应表1中本申请试剂盒针对血液样本的检测结果;图3D对应表1中本申请试剂盒针对水疱液样本的检测结果;图3E对应表1中本申请试剂盒针对脓疱液样本液的检测结果;图3F对应表1中本申请试剂盒针对痂皮液样本液的检测结果。结果表明,本申请试剂盒对不同样本源检测灵敏度高,最低检测限达50pg/mL甚至更低。其中,针对口咽拭子、血液、水疱液和脓疱液,检测限为20pg/mL。由此可知,本申请试剂盒能够检测出样本中是否携带猴痘病毒,并且检测灵敏度高。
表1 本发明试剂盒检测结果
备注:“+”表示阳性,“+-”表示弱阳性,“+--”表示临界阳性,“-”表示阴性。
2.不同浓度抗体对猴痘病毒检测效果的影响实验:将猴痘病毒重组抗原,分别采用经处理的口咽拭子样本液、体液样本液、血液样本液、水疱液样本液、脓疱液样本液和痂皮样本液梯度稀释至1000、100、50、20、10pg/mL制作待测样本。采用实施例1的不同抗体浓度试剂盒对各个待测样本进行检测,每个梯度重复测试20次,检测结果取平均值,检测结果如表2-4所示。其中,表2所用抗体浓度分别:抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ为0.5mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ为5μg/mL;表3所用抗体浓度分别:抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ为1.5mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ为15μg/mL;表4所用抗体浓度分别:抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ为2mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ为20μg/mL。
表2 不同抗体浓度试剂盒检测结果表(浓度一)
备注:“+”表示阳性,“+-”表示弱阳性,“+--”表示临界阳性,“-”表示阴性。
表3不同抗体浓度试剂盒检测结果表(浓度二)
备注:“+”表示阳性,“+-”表示弱阳性,“+--”表示临界阳性,“-”表示阴性。
表4不同抗体浓度试剂盒检测结果表(浓度三)
备注:“+”表示阳性,“+-”表示弱阳性,“+--”表示临界阳性,“-”表示阴性。
由表2可以看出,该抗体浓度试剂盒对口咽拭子、水疱液和脓疱液的检测限为100pg/mL,对体液、血液和痂皮的检测限为200 pg/mL。故,该抗体浓度,试剂盒可以用于猴痘病毒检测,但对于不同样本源,检测灵敏度有所不同,其中对口咽拭子、水疱液和脓疱液检测灵敏度相对于体液、血液和痂皮的检测灵敏度较高。
由表3可以看出,该抗体浓度试剂盒对口咽拭子、血液、水疱液和脓疱液的检测限为20pg/mL,对体液和痂皮的检测限为50 pg/mL。故,该抗体浓度,试剂盒可以用于猴痘病毒检测,且灵敏度高。其中对口咽拭子、血液、水疱液和脓疱液检测线达20pg/mL。
由表4可以看出,该抗体浓度试剂盒对口咽拭子、血液、水疱液和脓疱液的检测限为20pg/mL,对体液和痂皮的检测限为50 pg/mL。故,该抗体浓度,试剂盒可以用于猴痘病毒检测,且灵敏度高。其中对口咽拭子、血液、水疱液和脓疱液检测线达20pg/mL。
3.本发明试剂盒特异性分析试验:针对本申请试剂盒的特异性验证,申请人选取与猴痘病毒相似的痘类病毒、常见的疱疹病毒类、新型冠状病毒、以及机体常见的病原微生物作为干扰物与阴性待测样本和阳性待测样本分别混合,检测干扰物的存在对待测样本检测结果的影响。该试验设有两组,分别为实验组和对照组。
实验组:干扰物+阴性待测样本;
干扰物+阳性待测样本;
对照组:阴性待测样本和阳性待测样本。
其中,阴性待测样本为样本提取液,阳性待测样本为在阴性待测样本中加入一定浓度的阳性质控,干扰物的种类及浓度如表5所示。采用实施例1所述的试剂盒进行检测,猴痘病毒的检出情况如表6所示。
表5 各个干扰物的种类及浓度统计
表6 干扰物存在的情况下猴痘病毒的检测结果
备注:“++”表示强阳性,“+”表示阳性,“-”表示阴性。
由表6结果显示,向阴性待测样本中加入干扰物后,检测结果全为阴性,与对照组检测结果一致。向阳性待测样本中加入干扰物后,检测结果与对照组检测结果也是一致的。由此可见,本申请的关于猴痘病毒检测试剂盒抗干扰能力强,对猴痘病毒检测的特异性好。
对比例1 针对不同抗原靶点抗体试剂盒的检测效果试验
对比试剂盒一:试剂盒结构如实施例1所示,区别在于将抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ和抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ,分别变为抗猴痘病毒M1R蛋白单克隆抗体Ⅰ和抗猴痘病毒M1R蛋白单克隆抗体Ⅱ;
对比试剂盒二:试剂盒结构如实施例1所示,区别在于将抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ和抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ,分别变为抗猴痘病毒B6R蛋白单克隆抗体Ⅰ和抗猴痘病毒B6R蛋白单克隆抗体Ⅱ。
将对比试剂盒一和对比试剂盒二分别对不同来源的待测样本进行检测,结果如表7及图4A-图4F和表8及图5A-图5F所示。
表7 对比试剂盒一检测试验结果统计
备注:“+”表示阳性,“+-”表示弱阳性,“+--”表示临界阳性,“-”表示阴性。
从表7和图4A-图4F的结果可以看出,采用抗M1R蛋白的抗体制备的试剂盒,其对猴痘病毒的检测灵敏度较A29L蛋白抗体试剂盒低。其中,口咽拭子样本、体液样本、血液样本及水疱液样本的检测限均为50pg/mL,脓疱液和痂皮样本的检测限则为100pg/mL。
表8对比试剂盒二检测试验结果统计
备注:“+”表示阳性,“+-”表示弱阳性,“+--”表示临界阳性,“-”表示阴性。
从表8和图5A-图5F的结果可以看出,采用抗B6R蛋白的抗体制备的试剂盒,其对猴痘病毒的检测灵敏度较A29L蛋白抗体试剂盒低。其中,口咽拭子样本、体液样本、血液样本及痂皮样本的检测限均为50pg/mL,水疱液和脓疱液样本的检测限则为100pg/mL。
综上所述,针对猴痘病毒不同靶点制备的猴痘病毒检测试剂盒,其检测灵敏度差别很大。以A29L蛋白作为靶点制备的猴痘病毒检测试剂盒检测灵敏度最高,针对口咽拭子、血液、水疱液和脓疱液,检测限为20pg/mL。以M1R蛋白和B6R蛋白作为靶点制备的猴痘病毒检测试剂盒灵敏度较低,检测限为50-100pg/mL。
以上已以较佳实施例公布了本发明,然其并非用以限制本发明,凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (15)
1.猴痘病毒A29L蛋白作为特异性靶点在制备猴痘病毒检测试剂中应用。
2.猴痘病毒A29L蛋白作为特异性靶点在制备猴痘病毒检测试剂盒中应用。
3.一种猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:包括抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ和抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ。
4.根据权利要求3所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括样本提取液和采样拭子。
5.根据权利要求4所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:所述样本提取液含有浓度为0.01M PBS缓冲液、质量分数为0.5-1%的吐温20和体积百分数为0.05%的Proclin-300,其中,PBS缓冲液,pH7.2。
6.根据权利要求3-5任一项所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒为免疫层析试剂盒、酶联免疫试剂盒或化学发光试剂盒。
7.根据权利要求6所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:所述免疫层析试剂盒包括检测卡,检测卡包括:底板、样品垫、结合垫、滤血垫、硝酸纤维素膜和吸水纸;底板为PVC板;所述的样品垫、结合垫、滤血垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的底板上;结合垫上喷涂有抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ标记的示踪标志物,示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒,划线位置从吸水纸往加样孔方向依次为:C线、T线,其中C线包被羊抗鸡IgY抗体,T线包被的抗体为抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ。
8.根据权利要求7所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括外壳,检测卡组装在上壳和下壳扣合而成的外壳中,上壳上设置有加样孔和观察窗,加样孔对应于样品垫,观察窗对应于T线和C线。
9.根据权利要求7-8任一项所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒,其特征在于:抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅰ的浓度为0.5-2mg/mL,抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ的浓度为5-20µg /mL。
10.根据权利要求7-8任一项所述的猴痘病毒抗原检测的试剂盒的制备方法,其特征在于:
1)胶体金结合垫的制备:取1mL的胶体金,加入2µL的K2CO3,涡旋混匀;加入抗猴痘病毒A29L蛋白单克隆抗体Ⅱ,涡旋混匀;在室温条件下静止孵育1h,每隔0.5h涡旋混匀;加入250µL的封闭液,涡旋混匀;在室温条件下静止孵育1h,每隔0.5h涡旋混匀;离心6000rpm,30min,去除上清;加入50µL保存液,涡旋混匀;用喷金仪按4µL/cm溅射于聚酯膜上,37℃干燥2h,制得胶体金结合垫;
2)样品垫的制备:将8964玻璃纤维素膜用样品垫处理液浸湿,样品垫处理液的用量为5mL/条,37℃干燥过夜,制得样品垫;
3)NC膜划线:用划膜缓冲液分别将C线抗体和T线抗体稀释;将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上,划液量:1μL/cm;划膜速度:50mm/s;将划好的硝酸纤维素膜置于35-45℃环境烘2-24h;其中,划膜缓冲液包括浓度为20mM的Tris-HCl,质量分数为20%的蔗糖,pH8.2;
4)组装、成品。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于:所述封闭液包括质量分数为5-10%的BSA。
12.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于:所述保存液包括浓度为20mM 的Tris-HCl缓冲液、质量分数为0.5-1%的酪蛋白、质量分数为1-2%的蔗糖、质量分数为0.5-1%的海藻糖、以及质量分数1-2%的BSA,其中,Tris-HCl缓冲液的pH8.2。
13.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于:所述样品垫处理液包括浓度为20mM的Tris-HCl缓冲液,浓度为100mM的柠檬酸三钠,质量分数为0.5-1%的PVP40,体积分数为0.05-0.1%的吐温20,质量分数为0.3%的EDTA-4Na,浓度为1.0mg /mL的抗体阻断剂;其中,Tris-HCl缓冲液的pH8.2。
14.一种利用权利要求1所述的试剂或权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行猴痘病毒抗原检测的非疾病诊断的检测方法。
15.根据权利要求14所述的检测方法,其特征在于:检测样本为离体的口咽拭子、体液、血液或皮肤病灶组织,其中,皮肤病灶组织为水疱液、脓疱液或痂皮。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116284349A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-06-23 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种猴痘抗体检测试剂盒 |
CN116425865A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-07-14 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 抗体及其用于猴痘病毒检测中的应用 |
CN118130785A (zh) * | 2024-05-08 | 2024-06-04 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种猴痘病毒免疫标记物及其在磁/光三模式免疫层析检测猴痘病毒中的应用 |
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116284349A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-06-23 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种猴痘抗体检测试剂盒 |
CN116425865A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-07-14 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 抗体及其用于猴痘病毒检测中的应用 |
CN116284349B (zh) * | 2023-03-24 | 2023-08-04 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种猴痘抗体检测试剂盒 |
CN116425865B (zh) * | 2023-03-24 | 2023-08-25 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 抗体及其用于猴痘病毒检测中的应用 |
CN118130785A (zh) * | 2024-05-08 | 2024-06-04 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种猴痘病毒免疫标记物及其在磁/光三模式免疫层析检测猴痘病毒中的应用 |
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