JPS63501819A - イムノアッセイ法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イムノアッセイ法およびキット 発明の分野 本発明は、一般的にイムノアッセイ法に関し、さらに詳しくは、イムノアッセイ 法および３次元抗体タンパク質Ａ細胞壁複合体を多孔性マトリックス中に物理的 に取込んだキットに関する。

発明の背景 本発明は、受精の正確な時期を決定するためおよび／または妊娠の早期発見のた めの動物体液中のステロイドホルモンであるプロゲステロンの濃度の測定に特に 重要である。本発明の方法およびキットは、そのようなプロゲステロンの測定が 使用後使い捨て可能な該キット自体以外に装置のない野外において実施可能であ るという点で特に有利である。

イムノアッセイ法は以前から知られており、ラジオイムノアッセイ、酵素−イム ノアッセイおよび蛍光イムノアッセイを包含する。

これらの全ての方法において、標識抗原は該検定の間にそれ自体を前もって選択 した抗体に結合し、その後肢抗体と結合した標識抗原の量を測定する。

ラジオイムノアッセイの場合、該抗原を放射性元素で標識し、一方、酵素または 蛍光イムノアッセイにおいては、該標識は酵素または蛍光可能成分にて行なわれ る。明らかなごとく、放射能標識抗原を放射能検出器で検出し、蛍光標識抗原を 蛍光検出器で検出する。

明らかなごとく、該ラジオイムノアッセイ法および該蛍光イムノアッセイ法は、 該検定を行なうために放射線カウンターまたは特殊な光のような特殊な装置を必 要とする。したがって、これらのテストは、この装置に関する正しい使用および 安全予防措置を管理できる実験室には十分適している。

しかしながら、該ラジオイムノアッセイおよび蛍光イムノアッセイ法は、動物体 液中の抗原濃度の野外での測定には適していない。

他方、酵素標識抗原は、基質（反応物）をそれに加え、視覚観察可能な着色反応 生成物を生成させることにより検出できる。

特殊な実験室装置を用いる必要がないため、酵素イムノアッセイ法はラジオイム ノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ法より野外でのイムノアッセイに用いられ る可能性が大きい。これは、例えば、ウシ、ウマおよびブタの飼育者に特に重要 である。

プロゲステロンは、月経周期の黄体期の間の卵巣中の黄体線および妊娠期間中の 胎盤から生じることがよく知られている。

動物の最低プロゲステロン濃度は発情期（排卵の時期）に該当し、最高プロゲス テロン濃度は通常の卵巣周期の中間点付近で生じる。

該周期の間に、プロゲステロン濃度は発情期の間５ｎｇ／ｍＱまでまたはそれ以 下に低下し、その後動物によりｌＯ〜３０ｎｇ／ｍＱの間の濃度に上昇する。

通常、約５ｎｇ／ｍｆｆまでプロゲステロン濃度が低下した後、受精が起こり、 該動物を妊娠させる。その後、該周期の１８〜２２日目の間の高プロゲステロン 濃度は妊娠を示す。

全ての近代ウシ繁殖操作において人工受精が用いられているので、イムノアッセ イ法の重要な用途は、プロゲステロンａ変に限定される。

現在、発情期は視覚によって観察されているが、しばしば、動物は発情期に対応 する視覚可能な徴候を示さず、結果として、発情期の発見は不正確なものとなる 。

このようなことが生じた場合、人工受精が妊娠を生ぜしめうる前に約２１日の遅 延が生じることは明らかである。

これは飼育者に対する時間と金の重大な損失を意味し、このため、野外での正確 なプロゲステロン濃度検定法およびキットが非常に望まれている。

先に指摘したように、ラジオイムノアッセイおよび蛍光イムノアッセイは野外で の使用に適さず、このためウシ飼育者の要求を満足させることができない。

時間は、また、プロゲステロン濃度の１こめの野外にて許容されるイムノアッセ イ法の開発における重要な面である。該テストは、大規模繁殖操作において多数 の動物のそれぞれに対して個々に実施しなければならないので、時間または日数 を要するテストは実用的でない。

この問題は、ケルトンら（Ｋｅｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）の米国特許第４３９ ９２２９号に提出された。時間のかからないラジオイムノアッセイ法を考案する 試みにおいて、ケルトンは、抗体を該タンパク質Ａが細菌スタフィロコッカス・ アウレウス（Ｓ　ｔ、ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に関 係しているタンパク質Ａに結合した。

当該分野においてよく知られているように、この方法は、遊離抗体を用いる場合 に要するインキュベーション時間を減少させる。

タンパク質Ａ細胞を用いる利点は、タンパク質Ａがほとんど全ての抗体のＦｃ部 分に結合し、ならびに、該タンパク質Ａがタンｌくり質Ａ１分子当り４つのＦｃ 結合領域を有しているので、該タンパク質Ａは、該抗体分子を正しく配列し、か つ、多数の抗体分子を所定の体積にａ縮するという事実による。

結果として得られた物は、該タンパク質Ａの表面上に正しく配列され、かつ、該 細胞壁から伸長している抗体分子を有する３次元の構造的に適切に組織され１こ 網状組織である。

該細胞壁が物理的大きさおよび組織の両方を該抗体複合体に付与するように該細 胞壁を含有する未精製タンパク質Ａを用いることが重要である。

結果として得られた大きな型は、該タンパク質Ａ−抗体複合体をフィルターマト リックス等の中に懸濁することを可能にする。

この分野における研究および開発の量の増加ならびに成し遂げられた著しい進歩 にもかかわらず、実用的、迅速、有効かつ安価な野外でのプロゲステロンイムノ アッセイ法またはキットは得られていない。

そのような方法およびキットの開発における問題の多くは抗プロゲステロン抗体 とタンパク質Ａスタフィロコッカス・アウレウス細胞の結合に関係している。そ のような結合が生じうろことは一般に知られているが、正確な方法は依然として 未知である。

さらに、適当な抗体タンパク質Ａ結合の調製後、該結合を適当な多孔性マトリッ クスに担持する際に改良する必要がある。

本発明は従来技術の問題の多くを解決し、かつ、本発明は一般に小さな分子に適 用できるとともに抗プロゲステロン抗体とタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱 殺菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞の結合の特殊な方法を提供する。さら に重要なことには、本発明は、前もって選択した抗体の濃縮と該タンパク質Ａ細 胞中への前もって選択した抗体の分散を提供する。

さらに、本発明は、多孔性マトリックスに取込まれた抗体の製造法ならびにキッ トの製造法および血漿、乳、唾液および血液を含む動物体液中のプロゲステロン の存在をテストするためのキットを提供する。結局、本発明の装置は、以下にさ らに詳しく説明するように酵素標識抗原の非特異的結合を示すことにより本発明 のイムノアッセイ法の自己検査を提供する。

本発明は、「サンドイッチ」タイプのイムノアッセイと区別しなければならない 。この最後に述べたイムノアッセイ法は、固体基質に結合する１つのタイプの抗 体の抗原への結合、ついで酵素（または他のタイプの標識）で標識した別の抗体 を含有する溶液の添加を包含し、該標識抗体は該抗原上の異る部位に結合する。

このため、該抗原は、該抗体の間に「サンドイッチ」される。

該サンドイッチイムノアッセイ法は、それに結合しｆこ２つの抗体に物理的に充 分適合した大きさの抗原分子を必要とする。

本発明は、主として、２つの抗体がそれに結合するにはあまりに小さすぎる抗原 の検定に関する。

発明の要約 抗体とタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウ ス細胞の結合の方法は、タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコ ッカス・アウレウス細胞と抗体をインキュベートし、それに結合した抗体を有す るタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウスの 処理細胞を形成する工程を包含する。

その後、タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレ ウス細胞の未処理細胞を該処理細胞に加える。

ついで、該抗体と該処理細胞を架橋する薬剤を該処理細胞および未処理細胞の混 合物に添加し、ついで、該架橋剤を不活性化する薬剤を該混合物に加える。

これは、該抗体が該処理細胞上に濃縮され、同時に、それに結合した抗体を有し ない、未処理細胞中に該処理細胞が均一に分散された処理および未処理細胞の混 合物を生じる。さらに、該架橋剤は、また、該処理および未処理細胞を相互に架 橋すると仮定される。

本発明の最初のインキュベーション工程の間に、該タンパク質Ａおよび抗プロゲ ステロンモノクローナル抗体であってよい該抗体の間の結合の大部分を引き起こ す条件を付与する。

さらに詳しくは、該抗プロゲステロンモノクローナル抗体と該処理細胞を架橋す る薬剤はパラホルムアルデヒドからなり、該パラホルムアルデヒドを不活性化す る薬剤はウシ血清アルブミンからなる。

前記方法は、抗体取込み多孔性マトリックスを製造する本発明の方法に包含され る。

さらに詳しくは、抗体とタンパク質Ａの結合の前記方法は、リン酸塩生理食塩水 緩衝液中タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカスと抗プロ ゲステロン抗体をインキュベートしてそれに結合した抗プロゲステロン抗体を有 する処理細胞を形成する工程を包含する。その後、該処理細胞をリン酸塩生理食 塩水緩衝液から分離し、分離した処理細胞を別のリン酸塩生理食塩水緩衝液で洗 浄する。洗浄した処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩衝液中のタンパク質Ａ陽性ホ ルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞で希釈して処理およ び未処理細胞の混合物を形成する。この混合物にパラホルムアルデヒドを加える ◇ついで、リン酸塩生理食塩水緩衝液を該パラホルムアルデヒド処理および未処 理細胞に加え、該処理および未処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩衝液およびパラ ホルムアルデヒドから分離する。次の工程は、分離した処理および未処理細胞の ウシ血清アルブミン中懸濁、ついで該処理および未処理細胞のウシ血清アルブミ ンからの分離を包含する。

最終的に、前記工程の分離した処理および未処理細胞をリン酸塩生理食塩水溶液 中に懸濁し、以下により詳細に述べるように多孔性マトリックス中に沈殿させて それに結合した抗プロゲステロン抗体を有する該未処理および処理細胞を取込む 。

多孔性マトリックスは、約１５μｍ〜約２０μｍの孔を有する多孔性ポリエチレ ンおよび該多孔性マトリックスの全表面の小部分上のみに沈殿したリン酸塩生理 食塩水緩衝液中に懸濁した該処理および未処理細胞を含宵することができる。

したがって、本発明によれば、発色が動物体液中の前もって選択した抗原の前も って選択した濃度を示す動物体液中の抗原濃度のイムノアッセイ測定に有用な装 置が提供される。

この装置は、その中に細菌細胞を取込むのに適した孔の大きさを限定する手段を 有する多孔性マトリックスを包含する。この多孔性マトリックスは第１表面およ び第２表面ならびにその間を該多孔性基質の最小表面寸法より実質的に小さく調 整した厚さを有する。

本発明の多孔性マトリックスがバックグラウンドを提供するのに適した色を有し ているか色を有していないため、反応生成物が視覚によってそれから区別できる ということも重要である。

前記のように、それに結合した抗体を有する細菌智胞の一部を該多孔性マトリッ クス第１表面に近接した多孔性マトリックスの孔中に沈殿させる。前もって選択 した抗原と結合できる抗体の一部は、実質的に該多孔性マトリックスの全体積よ り小さい全体積を有する。

該多孔性マトリックス中の該一部の性質は、該多孔性マトリックス第１表面にお ける該一部の寸法が、実質的に該多孔性マトリックスの最小表面寸法より小さい ようなものである。

これは、以下に述べる本発明のキットに供する反応物によって起こる該一部内に て生じる反応が該一部のみにおいて生じる前もって選択したプロゲステロン濃度 にて発色を引き起こし、以下により詳しく述べるように半定量的にプロゲステロ ンの濃度を示すという意味において重要な特徴である。

吸収剤が供され、流体が該多孔性マトリックスを通過する時、該全多孔性マトリ ックス第２表面を通してそれから流体の回収を助けるために該多孔性マトリック ス第２表面に対して配置される。

さらに詳しくは、本発明の装置は、また、該流体が該多孔性マトリックスを通過 し、該吸収剤手段中を通る前に該多孔性マトリックス第１表面上に注ぐ流体を維 持するため該多孔性マトリックスの外縁部に対してぴったり接触した容器手段を 包含する。

該多孔性マトリックスは、約１５μｍ〜約２０μｍの孔の大きさを有する多孔性 ポリエチレンからなり、約１インチの直径および約ｌ／１６インチ〜１７８イン チの厚さを有するディスクの形態にて供しうる。

この装置は、さらに、該抗体と結合するための前もって選択したタイプの酵素標 識抗原からなる第１流体および該酵素により着色反応生成物を形成しうる第１基 質または基質およびクロモゲンからなる第２流体を包含するキットとともに本発 明のキットの本質的部分を提供する。

該キットは、また、該酵素により反応生成物を形成しうる第２基質または第２ク ロモゲンを提供しうる。該第２基質または第２クロモゲンは該酵素により無色反 応生成物または着色反応生成物を形成し、さらに、該第１および第２基質または クロモゲンは酸化型反応生成物を提供しうる。

２つの基質またはクロモゲンを用いる重要性は、発色を正確に調節して、前もっ て選択したプロゲステロンの濃度を示すことができるという事実にある。

本発明は、また、抗プロゲステロン抗体とタンパク質Ａを結合する工程および該 イムノアッセイを行なうために必要な流体を供給する工程を包含する方法を用い る動物体液中のプロゲステロン濃度を測定するのに有用なキットの製造方法を包 含する。

同様に、本発明は、多孔性マトリックス上に沈殿させるリン酸塩生理食塩水緩衝 液中の処理および未処理細胞懸濁液を供給するため、抗プロゲステロン抗体とタ ンパク質Ａを結合する方法に関する前記工程を包含するタンパク質Ａスタフィロ コッカス領域の？！４濁液を調製する工程を包含するプロゲステロンの存在をテ ストする方法を包含する。

その後、該マトリックスをプロゲステロンの存在をテストすべき動物体液と接触 させる。この工程後、該マトリックスを酵素標識プロゲステロンと接触させ、そ の後、リン酸塩生理食塩水緩衝液ですすぐ。該すすぎ工程後、該マトリックスを 該酵素により着色反応生成物を形成しうる基質と接触させ、その後、該着色反応 生成物を観察してプロゲステロンの存在を測定する。

この方法は、血漿、乳および唾液からなる群から選択されるような体液に対して 適用できる。

しかしながら、本発明は、また、全血中のプロゲステロンの存在をテストする方 法を提供する。さらに、この方法は、該多孔性マトリックスを全血と接触させた 後、細胞溶解溶液を用いる該多孔性マトリックスの洗浄を包含する。

図面の簡単な説明 本発明の利点および特徴は、添付図面に関して考察した以下の説明から明らかで ある。

第１図は、それに結合した抗体を示し、かつ、該タンパク質Ａ細胞を用いた抗体 の濃縮および分散を説明した処理および未処理タンパク質Ａ細胞を表わした図、 第２図は、公知のタンパク質Ａを用いた抗体の濃縮および分散を表わした図、第 ３図は、検定感度に関する抗体濃度の影響を示した吸光度対プロゲステロン濃度 のプロット、第４図は、抗体に依然として結合している酵素標識に起因する残留 バックグラウンド着色を示した乳に対する代表的定量ＥＩＡ検定の吸光度対プロ ゲステロンのプロット、第５図は、本発明の装置の断面図および第６図は、動物 体液中のプロゲステロンの濃度の測定における本発明の使用および結果を示した 図である。

発明の詳細 な説明は、拮抗的イムノアッセイ法を包含する。この方法において、該抗体を該 多孔性マトリックス中に固定化し、結果として、抗原試料および同種の酵素標識 抗原が該抗体マトリックス上の部位にて拮抗する。

過剰の遊離酵素標識抗原および遊離抗原を洗浄したら、該酵素により着色反応生 成物を生成しうる基質を該マトリックスに加え、該結合酵素の作用の結果として 着色が生じる。

はとんどまたは全く酵素で標識されていない抗原が抗体と結合する場合、着色は 生じない。これは、該抗体上の結合部位の大部分が試料抗原に占領された場合に 生じる。このため、生じた着色は、該抗体に結合した試料抗原の量に逆比例する 。すなわち、着色が濃いほど該試料中の抗原は少なく、着色が薄いほど該試料中 の抗原は多い。この方法はよく知られている。

本発明の方法は、多くの小分子に有用であるが、本記載は、そのような分子の代 表である抗プロゲステロン抗原に限定される。

特に、本発明の抗プロゲステロン抗体とタンパク質Ａの結合は、第１に、リン酸 塩生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中のタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌ス タフィロコッカス・アウレウスとトリトンｘ−ｔｏｏのような界面活性剤と抗プ ロゲステロンであるＰＢＳ中のマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｔまたはＩｇ Ｇａ）のインキュベーションの工程を必要とする。このインキュベーションを、 該混合物の継続撹拌下、室温にて約３時間までの期間維持する。この工程におい て、長いインキュベーション期間を付与すると、該抗体は、該抗体と結合するタ ンパク質Ａの本質的に全ての部位を飽和する。

このインキュベーション期間後、抗体の濃度および量が一般に非常に多いので、 問題のプロゲステロンの低濃度（０〜約２０　ｎｇ／　ｍＱ）における正確な分 析は不可能である。

したがって、未処理タンパク質Ａ細胞で希釈することにより抗体の量を減じ、か つ、その濃度を減じる。ここに、未処理細胞とは、抗体でインキュベートしてい ない細胞を意味する。

これは、抗体処理細胞の未処理細胞中懸濁液を生じる。

第り図は、未処理タンパク質Ａ細胞ｌＯを該タンパク質Ａ上の受容部位の実質的 に全てに抗体１４を結合させた処理タンパク質Ａ細胞１２に結合させて生じた懸 濁液を示している。

これは、該タンパク質Ａ上の部位が飽和されておらず、むしろ該タンパク質細胞 のそれぞれが抗体と不飽和結合を有し、該分析に必要な濃度の抗体を生じるケル トンの米国特許第４３９９２２９号に記載されているような従来のタンパク質Ａ 抗体懸濁液の製造と対比すべきである（１６が不飽和部位を有するタンパク質Ａ 細胞を示す第２図参照）。第２図に示したような濃度は、タンパク質Ａおよび抗 体を、希釈抗体を用いて比較的短時間インキュベートさせることによって生じる 。

本発明において、該抗体飽和タンパク質Ａ細胞を未処理細胞で希釈して適当な５ 度の抗体にする。さらに、何か他の水溶液よりもむしろ未処理細胞での希釈は、 該Ｐ！！濁液の安定性に寄与する。該抗体タンパク質Ａ懸濁液は、室温にて数日 間依然として安定であることが判明した。室温安定性は、該＠温液を野外試験装 置にて用いる場合に重要である。それは、また、冷却輸送費などの削除に重要で ある。

処理および未処理細胞の混合物をＰＢＳで洗浄した後、それらをＰＢＳ中の２％ 抗体処理細胞懸濁液に希釈し、その後パラホルムアルデヒドを加えて、それらが 血清試料中に存在するいずれもの種々雑多な抗体分子によって置換されえないよ うに該抗体分子１４と該タンパク質Ａ細胞！２を架橋する。さらに、この工程は 、また、第１および２図の点線１８によって示されているように該細胞を相互に 化学的に架橋すると仮定される。

架橋後、該細胞をＰＢＳで洗浄し、その後遠心分離し、ついで、ウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）中室温にて１５〜３０分間再懸濁して残存パラホルムアルデヒド 部位の全てを結合し、該試料または酵素標識抗体のその上への非特異的吸着を防 止する。

本発明のような拮抗的酵素イムノアッセイにおいて、検定感度に及ぼす抗体量お よび濃度の影響は、問題のプロゲステロン抗原の濃度、すなわち、０〜約２０ｎ ｇ／ｍＱにて非常に大きい。

前記のように、０〜５ｎｇ／ｍｃのプロゲステロン濃度および１０ｎｇ／１ｎ（ １以上のプロゲステロン濃度の間の差を正しく検出するための高感度で正確な検 定法を有していることは非常に重要である。

第３図は、血清試料中のプロゲステロン濃度に対して、／＝４９０ｎｍにて分光 光度計を用いて定量的に測定した吸光度（Ａｂｓ＝　Ｉ　／ＩＯ）の変化の３つ のプロット６０．６２．６４を示している。該抗体濃度を約５倍（ＭＡｂ＝［Ｘ ］〜ＭＡｂ＝［Ｘ５コ）まで変化させた時の発色の感度を示すため、定量的ミク ロ滴定プレートフォーマットを用いてこのプロゲステロン酵素イムノアッセイデ ータ（ＥＩＡ）を得た（本発明の方法ではない）。該酵素標識濃度は１０’Ｏｎ ｇ／ｍＩ２にて一定に保ち、用いた基質は０−フェニレンジアミンとＨｔ　Ｏｚ であった。

〜２０　ｎｇ／ｒｎＱのプロゲステロン濃度における色の変化が劇的であるとい うことを見ることができる。

第４図は、乳試料中のプロゲステロン濃度に対して１，７＝４９０ｎｍにて分光 光度計を用いて定量的に測定した吸光度（Ａｂｓ＝　Ｉ　／　Ｉ　０）の変化の プロット６６を示している。０−フェニレンジアミンを基質として用いた場合に 生じるバックグラウンドに起因する吸光度も示している。このバックグラウンド 着色６８は、該拮抗的イムノアッセイ法において、該試料中の抗原の濃縮にもか かわらず、いくらかの酵素標識抗原が依然として該抗体に結合しているために生 じる。

例えば、該試料が１１００ｎ／ｍＱのような非常に高濃度のブロゲステロンを存 する場合、それは全ての抗体部位を完全に飽和せず、第４図に示したように残留 バックグラウンド着色を生じる該抗体に結合したいくらかの酵素標識抗原残部を 有する。

第５図に図で示した装置２０は、本発明による動物体液の抗原濃度のイムノアッ セイ測定に有用である。

一般に、その中に細菌細胞を取込むのに適した大きさの孔２４を有する多孔性マ トリックス２２を用意する。好適な孔の大きさは、約１５μ〜約２０μであるこ とが判明している。

該多孔性マトリックスは、その間を約１７１６イ冫チ〜約１／８インチに調整し た厚さｔを有する第１表面２８および第２表面３０を宵するディスク２６（第５ 図参照）の形状を存してよく、該ディスクは約１インチの直径を有する。

好ましくは、該多孔性マトリックスは、反応生成物をそれから視覚により区別で きるバックグラウンドを提供するのに適した白色のポリエチレンからなる。さら に、該多孔性ポリエチレンを公知の方法にて処理して親水性にする。

第１表面に近接し１こ該多孔性マトリックス内にて、それに結合した抗体を有す る細菌細胞の一部３４を孔２４中に取込む。

一部３４の体積を前もって選択し、該検定に利用できる抗体の量を定める。前記 のように、抗体量および濃度の影響は、検定感度に対して非常に重要である。

本発明において、該一部の抗体の量および濃度を前もって選択し、かっ、定める ので、試料、標識抗原および基質の量は臨界的ではない。このため、本発明の方 法は、試料、標識抗原および基質の添加が正確でない場合もある野外のテストに 非常に適している。

抗プロゲステロン抗体とタンパク質Ａの結合の方法に関連して先に述べたように 、該抗体をプロゲステロンのような前もって選択した抗原と結合させることがで きる。

一部３４は、多孔性マトリックス２２の全体積より実質的に小さい全体積を有し 、かつ、該一部は、多孔性マトリックス第１表面２８にて多孔性マトリックスデ ィスク２６の直径りより実質的に小さい寸法ｄを有する。

第５図に示したように、吸収剤パッド４０またはその類似物を全多孔性マトリッ クス第２表面３０を通してそれから流体（示していない）を回収するため該多孔 性マトリックス第２表面３０に対して配置する。

多孔性マトリックス第１表面２８上に注いだ流体４２を維持するため、多孔性マ トリックスディスク２６の外縁部４６にシリンダー４４をぴったり接触させてよ い。

前記のように、該細菌細胞は、タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフ ィロコッカス・アウレウス細胞とすることができ、該抗体は、抗プロゲステロン モノクローナル抗体とすることができる。

装置２０を野外にて用い、以下のように血漿または乳試料中のプロゲステロン濃 度を検定することができる。

８〜１０適の血漿または新鮮な乳試料を多孔性マトリックスディスク２６の中央 部に滴下する。５〜６分待った後、セイヨウワサビパーオキシダーゼ標識プロゲ ステロンであってよい酵素標識プロゲステロン５〜６滴（８０〜４００　ｎｇ／ ｍＱ）を加え、生じるｆ二めにこれに許容された約３０秒〜２分間で該多孔性マ トリックス２２を通して該吸収剤４０中へ通過させる。

その後、該多孔性マトリックスを約２〜３ｍＱの蒸留水ですすぎ、その項５０ま で容器４４をほぼ満す５〜２０滴の基質を加える。

該基質は、ｌ　Ｏ−’ＭＨｔＯｔ中のテトラメチルベンジジン（ｐＨ５）とする ことができる。約５分後、テトラメチルベンジジンのために青色になった着色ス ポットの出現は、低プロゲステロンを示している（第６Ａ図参照）。着色スポッ トの欠如は、比較的高いプロゲステロン濃度に相当する（第６Ｃ図）。

該検定は、乳および血清試料に通常見られる１〜５０　ｎｇ／　ｍＱのプロゲス テロン濃度の分析に用いることができる。該検定は、また、１〜１０ｎｇ／ｍ１ ２の範囲のプロゲステロン濃度の分析に用いることができ、この臨界的範囲は、 発情期および早期の妊娠の発見のためのものである。テストする濃度は、加える 流体の濃縮によって調整する。

前記のように、高プロゲステロン濃度においてさえいくらかの酵素標識抗原が依 然として該抗体に結合しているため、バックグラウンド着色が該一部に生じうる 。

該バックグラウンド着色は、該酵素濃度または該抗体と抗原の間の接触時間の期 間を変えることによって除去することは不可能である。

しかしながら、本発明によれば、２またはそれ以上の基質またはクロモゲンの使 用がバックグラウンド着色を除去し、かつ、あるプロゲステロン濃度以上で着色 スポットが見られない正確な切断点を得ることができる。

この具体例において、２つのクロモゲンを酵素ＨＲＰと結合して用い、その結果 １つのクロモゲンが無色の酸化生成物（肉眼で見えない酸化生成物）を形成し、 一方、もう１つのクロモゲンは肉眼で見える酸化生成物を形成する。

酸化生成物以外の適当な無色および着色反応生成物も用いることができる。

第６図は、第１が低プロゲステロン（〜ｌｎｇ／ｍ（りを有し、第２が５ｎｇ／ ｍ（ｉプロゲステロンを有し、第３が高プロゲステロン（ＩＯｎｇ／ｍｆ２）を 有する３種の試料を用いて本発明により行なった酵素イムノアッセイテストの結 果を示している。

２つの基質、すなわち、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＸ２ミリモル／ｆ２） およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨＸｏ、４ミリモル／１ ２）を過酸化水素（２ミリモル／Ｑ）とともに加えて該テストを発色させ、これ らの結果を第６図に示した。

無色の酸化生成物がＮ　Ａ　Ｄ　Ｈおよび該酵素の間に形成されるため、バック グラウンド着色は高プロゲステロン濃度にて生じない（第６Ｃ図）。酵素による ＴＭＢの酸化ラジカル形態は、約６５２ｙ＋ｍの波長の青色を有するが、この色 の強度は第２のクロモゲンの使用により調整される。

血清もしくは他の体液中に浸すことができる平らな計深棒上またはその側面を該 細菌抗体結合にて被覆した試験管形態のような他の形態のタンパク質Ａと結合し た抗プロゲステロン抗体を用いることができる。

計深棒（示していない）を用いる場合、それを５分間のインキュベーションの間 試料中に浸し、ついで洗浄し、酵素溶液に浸し、洗浄し、最後に基質溶液に浸し て色を生じさせる。

しかしながら、前記の本発明の好ましい装置は、それが該多孔性基質内での酵素 標識抗原の非特異的結合の存在を測定するための手段を提供するために重要であ る。この測定は、該一部内以外の範囲の多孔性基質における発色によって明らか にされる。該多孔性マトリックスを適切にすすがない場合、該酵素標識抗原の非 特異的結合は、一部２４の外側で生じうる。

これが生じた場合、着色の外観は、第６Ａおよび６Ｂ図に示したように該一部の 直径を有する明確な点ではなく、むしろ該多孔性マよび／または表面２８に対す る全多孔性マトリックスを変色させる不明確な形状である。

したがって、本発明は、プロゲステロンのような抗原についての検定を行なうた めにすすぎおよび示した種々の流体の添加において適切な工程がとられていると いうことを検証するための手段を包含する。

寒乳鯉 以下に本発明の代表的実施例および好ましい具体例を示す。明らかなように多く の変形が可能であるので、本発明はそれらに限定されるものではない。

例えば、実施例は、特に、セイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような 酵素を挙げているが、用いることのできる他の酵素は、アルカリホスファターゼ 、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼまたはカタラーゼである。

２つの好ましい酵素は、ＨＲＰおよびＨＲＰと結合したアルカリホスファターゼ を包含し、非常に明確な色彩を生じる好ましい基質は、青色を生じるテトラメチ ルベンジジン／過酸化物または緑色を生じる２、２′−アジノジ（３−エチルベ ンゾチアゾリン−６−スルホネートＸＡＢＴＳ）／過酸化物である。アルカリホ スファターゼと結合した好ましい基質は、フェノールフタレインホスフェート（ 赤またはピンク）、インドキシルホスフェート（青）、５−ブロモ−４−クロロ −３−インドキシルホスフェート（青）ま１こはチモールフタレインホスフェー ト（青）を包含する。

実施例１ 抗体取込みフィルターマトリックスの製造（ディスクコーティング法） 撹拌下、ｌＯ％タンパク質Ａホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウ レウス４部（０，１％トリトンＸ−１００を含む生理的リン酸塩食塩水緩衝液（ Ｐ　Ｂ　Ｓ　ＸｐＨ〜７．２）中）を抗プロゲステロンモノクローナル抗体（Ｉ ｇＧｙまたは１ｇＧ３Ｘ同一緩衝液中）（抗体の最終濃度が３〜４ｊ！９抗体／ ｍＱとなるように）１部とともに室温にて３時間インキュベートする。

細胞をトリトンＸ−１００を含む２倍の体積の同一リン酸塩緩衝液で２回洗浄し 、同一緩衝液で２％抗体処理細胞懸濁液に希釈する。

該２％抗体処理細胞を１％未処理細胞でｌ／２０．１１５０、ｌ／７５に希釈す る。等体積の１％パラホルムアルデヒドをこの結合した細胞＠濁液に加える。こ の細胞懸濁液をパラホルムアルデヒドとともに３７℃で４５分間撹拌する（この 工程は抗体分子をタンパク質Ａ細胞に架橋するので、それらは血清試料中に存在 するいずれもの種々雑多な抗体分子によって置換されえない。この工程は、また 、該細胞を相互に架橋する。）。

トリトンＸ−１００を含有する数倍の体積のＰＢＳを加え、該細胞を遠心分離し 、洗浄し、ついで室温にて１５〜３０分間１％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ ＸＰ　Ｂ　Ｓ中）中に再懸濁させる（該ＢＳＡの目的は、全ての残存パラホルム アルデヒド部位を結合して該試料または酵素の非特異的吸着を防止するためであ る。）。

２０Ｑの１％細胞懸濁液の一部を白色多孔性ポリエチレンディスク１５〜２０ｍ μ多孔質の中央に加える。該ディスクは直径約１インチ、厚さ１部８インチ〜１ ／１６インチである。

真空デシケータ中に該ディスクを約１時間放置して過剰の水分を除去する。

実施例２ 血漿または乳試料中のプロゲステロンの検定全工程を大体室温（２２〜２５℃） にて実施する（他の温度では、相対的時間を調整しなければならない。）。

１．８〜１０滴の血漿または新鮮な乳試料を該ディスクの中央に加える（１滴ず つ）。５〜６分間待つ。

２．５〜６滴の酵素標識プロゲステロン（例えば、８０〜４００ｎｇ／　ｍＱの セイヨウワサビ−パーオキシダーゼ標識プロゲステロン）を加える。３０秒〜２ 分間待つ。

３、約２〜３ｍＱの蒸留水ですすぐ。

４．５−２０滴の基質（例えば、１０−３Ｍ　８２０　＊中ノテトラメチルベン ジジン（ｐＨ５））を加える。５分間待つ。

着色スポット（例えば、テトラメチルベンジジンによる青色）の出現は、低プロ ゲステロンを示している。着色スポットの欠如は、比較的高いプロゲステロン濃 度に相当する。該検定を用いて、通常、乳および血清試料に見られる１〜５０　 ｎｇ／　ｍＱ程度のプロゲステロン濃度を分析することができる。該検定を用い て、また、発情期および早期の妊娠の発見の臨界的範囲である１−１０ｎｇ／ｍ Ｑの範囲のプロゲステロン濃度を分析することができる。

実施例３ 全血試料中のプロゲステロンの検定 ＥＤＴＡのヘパリンのような抗凝血剤を含有する試験管に捕集した新鮮な乳試料 を用いなければならない。全工程は室温（２２〜２５℃）にて実施される。

１．５〜６滴の全血を該ディスクの中央に加える。５〜６分間待つ。

２、赤色の血液色が全て消失するように蒸留水、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　 Ｄ　Ｓ　Ｘまたは、種々の他の薬剤）の溶液のような細胞溶解溶液２〜４＋ｎ＋ ２で該ディスクを十分洗浄する。

３．５〜６滴の酵素標識プロゲステロン（例えば、８０〜４００ｎｇ／ｍ１２の セイヨウワサビ−パーオキダーゼ標識プロゲステロン）を加える。３０秒〜２分 間待つ。

３．約２〜３ｍ１２の蒸留水ですすぐ。

４、該容器の上部貯蔵槽を完全に充すまで基質５〜２０滴を加える（該基質は、 例えば、ｌ　Ｏ−３ＭＨｔＯｔ中のテトラメチルベンジジン（ｐＨ５）である。

）。５分間待つ。

着色スポット（例えば、テトラメチルベンジジンが該基質であり、ＨＲＰが該酵 素である場合、青色）の出現は、低プロゲステロンを示している。着色スポット の欠如は、比較的高いプロゲステロン濃度に相当する。該検定を用いて、通常、 血液試料中に見られる１〜５０ｎｇ／ｙ、Ｑの程度のプロゲステロン濃度を分析 することができる。

該検定を用いて、また、１〜１０ｎｇ／ｍＱの範囲のプロゲステロン濃度を分析 することができる。

該ディスクに結合した抗体の量ならびに用いる酵素標識の量および濃度を調整す ることによって該検定を所望の濃度にて感受性であるようにそれを調整すること ができる。

（公刈孜術フ プロゲステロンｎｇ／ｍｌ プロゲステロン口９７ｍ１ バックグラワンド吸光度 ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　６ 国際調査報告 等１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号／　Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ｃ− ８４１２−４Ｂ０１２　Ｐ　２１／ＤＯＤ−６７１２−４Ｂ■発　明　者　ロッ ジ、デブラ・ジェイ　アメリカ合衆国プ・レイン３９幡 特衣昭６３−５０１８１９　（１６） ペンシルベニア州１９０６７、ヤードリイ、レナッ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウ レウス細胞と抗体をインキュベートして、それに結合した抗体を有するタンパク 質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウスの処理細胞を 形成し、ｂ）タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・ア ウレウスの未処理細胞を該処理細胞に加え、ｃ）該抗体と該処理細胞を架橋する ための薬剤を該処理および未処理細胞に加え、ｄ）該抗体と該処理細胞を架橋す るための薬剤を不活性化するための薬剤を該処理および未処理細胞に加える工程 からなることを特徴とする抗体とタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタ フィロコッカス・アウレウス細胞の結合および安定化方法。 （２）ａ）タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウ レウス細胞と抗プロゲステロン抗体をインキュベートして、それに結合した抗プ ロゲステロン抗体を有するタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロ コッカス・アウレウスの処理細胞を形成し、ｂ）タンパク質Ａ陽性ホルマリン処 理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウスの未処理細胞を該処理細胞に加え、 ｃ）該プロゲステロン抗体と該処理細胞を架橋するための薬剤を該処理および未 処理細胞に加え、ｄ）該抗プロゲステロン抗体と該処理細胞を架橋するための薬 剤を不活性化するための薬剤を該処理および未処理細胞に加える工程からなるこ とを特徴とする抗プロゲステロン抗体とタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺 菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞の結合および安定化方法。 （３）該抗プロゲステロン抗体と該処理細胞を架橋するための薬剤がパラホルム アルデヒドからなる前記第（２）項の方法。 （４）該抗プロゲステロンモノクローナル抗体を該処理細胞に架橋するための薬 剤を不活性化する薬剤がウシ血清アルブミンからなる前記第（３）項の方法。 （５）該抗プロゲステロン抗体が抗プロゲステロンモノクローナル抗体からなる 前記第（４）項の方法。 （６）該インキュベーションが、実質的に抗体を受容する該タンパク質Ａ上の部 位の全てを抗体で飽和するための期間行なわれる前記第（５）項の方法。 （７）該インキュベーションが室温にて約３時間までの期間行なわれる前記第（ ６）項の方法。 （８）ａ）リン酸塩生理食塩水緩衝液中タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺 菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞と抗プロゲステロン抗体をインキュベー トして、それに結合した抗プロゲステロン抗体を有する処理細胞を形成し、ｂ） 該処理細胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液から分離し、ｃ）該分離処理細胞をリ ン酸塩生理食塩水緩衝液で洗浄し、ｄ）該洗浄処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩 衝液中のタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレ ウス細胞で希釈して処理および未処理細胞の混合物を形成し、ｅ）パラホルムア ルデヒドを該処理および未処理細胞に加え、ｆ）リン酸塩生理食塩水緩衝液を該 パラホルムアルデヒド処理および未処理細胞に加え、ｇ）該処理および未処理細 胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液およびバラホルムアルデヒドから分離し、ｈ） 該分離処理および未処理細胞をウシ血清アルブミン中に懸濁し、ｉ）該処理およ び未処理細胞をウシ血清アルブミンから分離し、ｊ）分離した工程ｉ）の処理お よび未処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁し、ｋ）リン酸塩生理食塩 水緩衝液中に懸濁した正確に前もって選択した量の該処理および未処理細胞を多 孔性マトリックス上に沈殿させて、それに結合した抗プロゲステロン抗体を有す る該未処理細胞および処理細胞を取込む工程からなることを特徴とする抗体取込 み多孔質の製造方法。 （９）リン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁した該処理および未処理細胞を多孔性 マトリックスの全表面の小部分に沈殿させる前記第（８）項の製造方法。 （１０）該多孔性マトリックスが約１５μｍ〜約２０μｍの孔を有する多孔性ポ リエチレンからなる前記第（９）項の製造方法。 （１１）該多孔性マトリックスが約１インチの直径および約１／１６インチ〜約 １／８インチの間の厚さを有し、かつ、約２０μｌの該処理および未処理細胞の 一部を該ディスクの一方の側に沈殿させる前記第（１０）項の製造方法。 （１２）さらに、リン酸塩生理食塩水緩衝液中の該処理および未処理細胞をその 上に沈殿させた後、該ディスクを乾燥させる工程からなる前記第（１１）項の製 造方法。 （１３）該リン酸塩生理食塩水緩衝液が界面活性剤を含有し、該抗プロゲステロ ン抗体および該タンパク質陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・ア ウレウス細胞の間の非特異的結合を減少させる前記第（８）項の製造方法。 （１４）該界面活性剤がトリトンＸ−１００からなる前記第（１３）項の製造方 法。 （１５）発色が動物体液中の前もって選択した抗原の濃度を示す動物体液中の抗 原濃度のイムノアッセイ測定に有用な装置であって、多孔性マトリックスがその 中に細菌細胞を取込むのに適した孔の大きさを限定する手段を有し、該多孔性マ トリックスが第１および第２表面ならびにその間を該多孔性基質の最小表面寸法 より実質的に小さく調整した厚さを有し、該多孔性マトリックスが反応生成物を それから視覚によって区別できるようなバックグラウンドを提供するのに適した 色を有するかまたは色を有さず、細菌細胞の一部が、該多孔性マトリックス第１ 表面に近接した多孔性マトリックスの孔内に配置したそれに結合した抗体を有し 、該抗体を前もって選択した抗原と結合させることができ、該一部が該多孔性マ トリックスの全体積より実質的に小さな全体積を有し、該一部が、該多孔性マト リックス第１表面にて該多孔性マトリックスの最小表面寸法より実質的に小さな 寸法を有し、吸収剤手段を均質な多孔性マトリックス第２表面を通じてそれから 流体を取除くため該多孔性マトリックス第２表面に対して配置することを特徴と する装置。 （１６）さらに、該流体が該多孔性マトリックスを通過し、該吸収剤手段中に入 る前に該多孔性マトリックス第１表面上に注いだ流体を維持するため該多孔性マ トリックスの外縁部にぴったり接触した容器手段からなる前記第（１５）項の装 置。 （１７）該細菌細胞がタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱細菌スタフィロコッ カス・アウレウス細胞からなり、かつ、該抗体が抗プロゲステロン抗体からなる 前記第（１６）項の装置。 （１８）該多孔性マトリックスが約１５μｍ〜約２０μｍの孔の大きさを有する 多孔性ポリエチレンからなる前記第（１７）項の装置。 （１９）該多孔性マトリックスが約１インチの直径および約１／１６インチ〜約 １／８インチの間の厚さを有するディスクからなる前記第（１８）項の装置。 （２０）該多孔性マトリックスおよびその中の細菌細胞の一部が該多孔性マトリ ックス内の酵素標識抗原の非特異的結合の存在を測定するための手段を提供し、 該測定が該一部内以外の範囲の該多孔性マトリックスにおける発色によって示さ れる前記第（１５）項の装置。 （２１）発色が動物体液中の前もって選択した抗原の濃度を示す拮抗的イムノア ッセイ法を用いた動物体液中の抗原濃度の酵素イムノアッセイ測定用キットであ って、多孔性マトリックスがその中に細菌細胞を取込むのに適した孔の大きさを 限定する手段を有し、該多孔性マトリックスが第１および第２表面ならびにその 間を該多孔性マトリックスの最小表面寸法より実質的に小さく調整した厚さを有 し、該多孔性マトリックスが反応生成物をそれから視覚によって区別できるよう なバックグラウンドを提供するのに適した色を有するかまたは色を有さず、細菌 細胞の一部が、該多孔性マトリックス第１表面に近接した多孔性マトリックスの 孔内に配置したそれに結合した抗体を有し、該抗体を前もって選択した抗原と結 合させることができ、該一部が該多孔性マトリックスの全体積より実質的に小さ い全体積を有し、該一部が、該多孔性マトリックス第１表面にて該多孔性マトリ ックスの最小表面寸法より実質的に小さな寸法を有し、吸収剤手段を均質な多孔 性マトリックス第２表面を通してそれから流体を取除くため該多孔質マトリック ス第２表面に対して配置し、第１流体が該抗体と結合させるための前もって選択 した種類の酵素標識抗原からなり、第２流体が該酵素とともに着色反応生成物を 形成しうる第１基質からなることを特徴とするキット。 （２２）さらに、該流体が該多孔性マトリックスを通過し、該吸収剤手段中に入 る前に該多孔性マトリックス第１表面上に注いだ流体を維持するための該多孔性 基質の外縁部にぴったり接触した容器手段からなる前記第（２１）項のキット。 （２３）該細菌細胞がタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッ カス・アウレウス細胞からなり、かつ、該抗体が抗プロゲステロンモノクローナ ル抗体からなる前記第（２２）項のキット。 （２４）該第１基質が該酵素とともに着色反応生成物を形成する前記第（２３） 項のキット。 （２５）さらに、該第２流体が該酵素とともに反応生成物を形成しうる第２基質 からなる前記第（２１）項のキット。 （２６）該第２基質が該酵素とともに無色の反応生成物を形成する前記第（２５ ）項のキット。 （２７）該第１基質が該酵素とともに第１着色生成物を形成し、該第２基質が該 酵素とともに第２着色生成物を形成し、かつ、該第１および第２着色生成物が互 いに異る色を有する前記第（２１）項のキット。 （２８）該多孔性マトリックスが約１５μｍ〜約２０μｍの孔の大きさを有する 白色多孔性ポリエチレンからなる前記第（２７）項のキット。 （２９）該多孔性マトリックスが約１インチの直径および約１／１６インチ〜約 １／８インチの間の厚さを有するディスクからなる前記第（２８）項のキット。 （３０）該部分の体積が約２０μｌである前記第（２９）項のキット。 （３１）該多孔性マトリックスおよびその中の細菌細胞の一部が該多孔性マトリ ックス内の酵素標識抗原の非特異的結合の存在を測定するための手段を提供し、 該測定が該一部内以外の範囲中の該多孔性マトリックスにおける発色によって示 される前記第（２１）項のキット。 （３２）動物体液中のプロゲステロン濃度を測定するのに有用なキットの製造方 法であって、該方法がａ）リン酸塩生理食塩水緩衝液中タンパク質Ａ陽性ホルマ リン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞と抗プロゲステロン抗体 をインキュベートして、それに結合した抗プロゲステロン抗体を有する処理細胞 を形成し、ｂ）該処理細胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液から分離し、ｃ）該分 離処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩衝液で洗浄し、ｄ）該洗浄処理細胞をリン酸 塩生理食塩水緩衝液中のタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコ ッカス・アウレウス細胞で希釈して処理および未処理細胞の混合物を形成し、ｅ ）パラホルムアルデヒドを該処理および未処理細胞に加え、ｆ）リン酸塩生理食 塩水緩衝液を該パラホルムアルデヒド処理および未処理細胞に加え、ｇ）該処理 および未処理細胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液およびパラホルムアルデヒドか ら分離し、ｈ）該分離処理および未処理細胞をウシ血清アルブミン中に懸濁し、 ｉ）該処理および未処理細胞をウシ血清アルブミンから分離し、ｊ）分離した工 程ｉ）の処理および未処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁し、ｋ）リ ン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁させた該処理および未処理細胞を多孔性マトリ ックス上に沈殿させて、それに結合した抗プロゲステロン抗体を有する該未処理 細胞および処理細胞を取込み、１）該多孔性マトリックスをその上に取込んだ該 処理細胞と反応させるための流体に暴露するのに適した容器に該多孔性マトリッ クスを配置し、ｍ）該多孔性マトリックスに接触する酵素標識プロゲステロンか らなる第１流体を供給し、ｎ）該酵素と接触した場合、着色反応生成物を形成し うる第１基質からなる第２流体を供給する工程からなることを特徴とする製造方 法。 （３３）該酵素と接触した場合、該第１基質が着色反応生成物を形成する前記第 （３２）項の製造方法。 （３４）さらに、該酵素と接触した場合、該第２流体が反応生成物を形成しうる 第２基質からなる前記第（３３）項の製造方法。 （３５）該酵素と接触した場合、該第２基質が無色の反応生成物を形成する前記 第（３４）項の製造方法。 （３６）該酵素と接触した場合、該第１基質が第１着色酸化生成物を形成し、該 酵素と接触した場合、該第２基質が第２着色酸化生成物を形成し、かつ、該第１ および第２着色酸化生成物が相互に異る色を有する前記第（３２）項の製造方法 。 （３７）Ａ）ａ）リン酸塩生理食塩水緩衝液中タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理 加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞と抗プロゲステロン抗体をインキ ュベートして、それに結合した抗プロゲステロン抗体を有する処理細胞を形成し 、ｂ）該処理細胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液から分離し、ｃ）該処理細胞を リン酸塩生理食塩水緩衝液で洗浄し、ｄ）該洗浄処理細胞をリン酸塩生理食塩水 緩衝液中のタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウ レウス細胞で希釈して処理および未処理細胞の混合物を形成し、ｅ）パラホルム アルデヒドを該処理および未処理細胞に加え、ｆ）リン酸塩生理食塩水緩衝液を 該パラホルムアルデヒド処理および未処理細胞に加え、ｇ）該分離処理および未 処理細胞をウシ血清アルブミン中に懸濁し、ｈ）該処理および未処理細胞をウシ 血清アルブミンから分離し、ｉ）分離した工程ｈ）の処理および未処理細胞をリ ン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁し、Ｂ）リン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁し た該処理および未処理細胞の一部を多孔性マトリックス上に沈殿させて該未処理 および処理細胞を取込み、Ｃ）該マトリックスとプロゲステロンの存在を試験す べき動物体液を接触させ、Ｄ）工程Ｃ）後、該マトリックスと酵素標識プロゲス テロンを接触させ、Ｅ）工程Ｄ）後、該マトリックスをリン酸塩生理食塩水緩衝 液ですすぎ、Ｆ）その後、該マトリックスと、該酵素と接触した場合、着色反応 生成物を形成しうる基質を接触させ、Ｇ）該着色反応生成物を観察してプロゲス テロンの存在を測定する工程からなることを特徴とするプロゲステロンの濃度の 試験方法。 （３８）該動物体液が、血漿、乳および唾液からなる群から選ばれる前記第（３ ７）項の試験方法。 （３９）該多孔性マトリックス上に沈殿させる処理および未処理細胞の一部を該 多孔性マトリックスの表面に近接した多孔性マトリックスの孔中に配置し、該一 部が該多孔性マトリックスの全体積より実質的に小さな全体積を有し、かつ、該 多孔性マトリックス表面にて該多孔性マトリックスの最小表面寸法より実質的に 小さな寸法を有する試験方法であって、かつ、該方法が、さらに、該一部以外の 範囲の該多孔性マトリックスの発色を観察することによって該多孔性マトリック ス内での該酵素標識プロゲステロンの非特異的結合の存在を測定する工程からな る前記第（３７）項の試験方法。 （４０）Ａ）ａ）リン酸塩生理食塩水緩衝液中タンパク質Ａ陽性ホルマリン処理 加熱殺菌スタフィロコッカス・アウレウス細胞と抗プロゲステロン抗体をインキ ュベートして、それに結合した抗プロゲステロン抗体を有する処理細胞を形成し 、ｂ）該処理細胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液から分離し、ｃ）該処理細胞を リン酸塩生理食塩水緩衝液で洗浄し、ｄ）該洗浄処理細胞をリン酸塩生理食塩水 緩衝液中のタンパク質Ａ陽性ホルマリン処理加熱殺菌スタフィロコッカス・アウ レウス細胞で希釈して処理および未処理細胞の混合物を形成し、ｅ）パラホルム アルデヒドを該処理および未処理細胞に加え、ｆ）リン酸塩生理食塩水緩衝液を 該パラホルムアルデヒド処理および未処理細胞に加え、ｇ）該処理および未処理 細胞を該リン酸塩生理食塩水緩衝液およびバラホルムアルデヒドから分離し、ｈ ）該分離処理および未処理細胞をウシ血清アルブミン中に懸濁し、ｉ）該処理お よび未処理細胞をウシ血清アルブミンから分離し、ｊ）分離した工程ｉ）の処理 および未処理細胞をリン酸塩生理食塩水緩衝液中に懸濁し、Ｂ）リン酸塩生理食 塩水緩衝液中に懸濁した該処理および未処理細胞の一部を多孔性マトリックス上 に沈殿させて該未処理および処理細胞を取込み、Ｃ）該多孔性マトリックスとプ ロゲステロンの濃度を試験すべき全血を接触させ、Ｄ）該多孔性マトリックスを 細胞溶解溶液で洗浄し、Ｅ）工程Ｄ）後、該多孔性マトリックスと酵素標識プロ ゲステロンを接触させ、Ｆ）工程Ｅ）後、該多孔性マトリックスをリン酸塩緩衝 液ですすぎ、Ｇ）その後、該多孔性マトリックスと、該酵素と接触した場合、着 色反応生成物を形成しうる基質を接触させ、Ｈ）該着色生成物を観察して、プロ ゲステロンおよび該酵素標識プロゲステロンの非特異的結合の存在の両方を測定 する工程からなることを特徴とする全血中のプロゲステロンの濃度の試験方法。 （４１）該多孔性マトリックス上に沈殿させる処理および未処理細胞の一部を該 多孔性マトリックスの表面に近接した多孔性マトリックスの孔中に配置し、該一 部が該多孔性マトリックスの全体積より実質的に小さな前もって選択した全体積 を有し、かつ、該多孔性マトリックス表面にて該多孔性マトリックスの最小表面 寸法より実質的に小さな寸法を有する試験方法であって、かつ、該方法が、さら に、該一部以外の範囲の該多孔性マトリックスの発色を観察することによって該 多孔性マトリックス内での該酵素標識プロゲステロンの非特異的結合の存在を測 定する工程からなる前記第（４０）項の試験方法。