DE2322533C2 - Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zum Binden von Immunoglobulin und Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens

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DE2322533C2
DE2322533C2 DE2322533A DE2322533A DE2322533C2 DE 2322533 C2 DE2322533 C2 DE 2322533C2 DE 2322533 A DE2322533 A DE 2322533A DE 2322533 A DE2322533 A DE 2322533A DE 2322533 C2 DE2322533 C2 DE 2322533C2
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Binden von mindestens einem Immunoglobulin oder dessen freiem Fc-Fragment, wobei das Immunoglobulin in freier Form oder mit seinem Fab-Teil gebunden an ein Antigen, an das wahlweise eine oder mehrere Gruppen oder Substanzen gebunden sind, vorliegt, in Gegenwart einer Flüssigkeit an ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer mit Hilfe einer an das Polymer gebundenen Substanz sowie ein Hilfsmittel zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist bekannt Polypeptidantigene an unlösliche Polymere zu binden. Derartige gebundene Antigene können solche Immunoglobuline immunochemisch binden, die gegen das Antigen gerichtete Antikörper sind. (Hierbei binden sich die Fab-Teile der Antikörper an das Antigen.) Es ist auch bekannt, Antikörper an unlösliche Polymere zu binden. Derartige gebundene Antikörper können solche Antigene binden, gegen die die Antikörper gerichtet sind. Hierbei kann das Antigen beispielsweise
ίο ein Immunoglobulin (oder ein Fragment von einem Immunoglobulin, das ein glattes Äquivalent zum Immunoglobulin selbst darstellt) sein, wobei das Immunoghbulin (bzw. das Fragment davon) an die polymergebundenen Antikörper gebunden werden können. Beispiele von der Verwendung an fester Phase gebundenen Antigene oder Antikörper zur Bildung der entsprechenden Antikörper oder Antigene sind in einem Übersichtsartikel von I. Silman und E. Katchalski in Annual Review of Biochemistry Vol.35, 1966, Teil II, S.873-804, insbesondere Seite 896—904 beschrieben. Viele Methoden zur Bildung von Polypeptiden an unlösliche Polymere sind ebenfalls beschrieben, wie beispielsweise in der US-PS 36 45 852.
In Angew.Chem. 84, S. 319 (1972) und Annu. Rev. Biochem. 40, 259—278 (1971) wird ausgeführt, daß die Affinitätschromatographie eine neue Methode sei.
Zu Beginn der 70er Jahre war.die Technik der »Affinitätschromatographie« nicht mehr neu, sondern seit wenigstens 15 Jahren schon allgemein bekannt. Die allerersten Versuche, biologisch aktive Substanz an einen Träger unter Beibehaltung der Aktivität zu binden, wurden in den 20er und 30er Jahren durchgeführt; s. z. B. Annu. Rev. Biochem. 32 (1966) 873—874 und Literaturangäbe auf Seite 905.
Seit 1958 ist es bekannt, daß Protein A humanes y-Globulin präzipitiert (Acta Pathol. Microbiol. Scandinav. 44 (1958) 421 —428). Viel früher bereits hatte man verschiedene Methoden zur Reinigung von Immunoglobulinen der IgG-Klasse entwickelt, und zwischen den Jahren 1958 und 1972 wurden weitere Methoden entwickelt.
Die bisher bekannten Reinigungsmethoden für IgG waren alle sehr zeitraubend und enthielten mehrere verschiedene Reinigungsstufen mit einer schlechten Gesamtausbeute. Sie stellten im Prinzip ein »Auffischen« von Verunreinigungen dar, was prinzipiell zu einer schlechten Kontrolle über die verbleibenden Verunreinigungen führte.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache Reinigungsmethode für Immunoglobuline bereitzustellen, mit deren Hilfe ein sehr reines Produkt in sehr hoher Ausbeute erhalten wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem gattungsgemäßen Verfahren dadurch gelöst, daß das Immunoglobulin ein Immunoglobulin der Klasse IgG ist und daß die verwendete an das Polymer gebundene Substanz Protein A ist.
Im vorliegenden werden der Ausdruck »Immunoglobulin G« und »IgG« identisch benutzt.
Die Erfindung ermöglicht ein besonders einfaches, bequemes, spezifisches und reversibles Verfahren zum Binden von Immunoglobulin G in freier Form oder mit seinen Fab-Teilen gebunden an ein Antigen, an ein PoIymeres, das in der Flüssigkeit unlöslich ist. Da gemäß der Erfindung das Immunoglobulin über seinen Fc-Teil an die polymere feste Phase gebunden wird, wird der antigenspezifische Fab-Teil intakt gelassen. Der Fab-Teil
kann so an ein Antigen gebunden werden, oder der Fab-Teil kann veranlaßt werden, sich selbst an ein Antigen zu binden.
Das Funktionieren dieses Verfahrens war besonders überraschend, weil der Fachmann erwarten mußte, daß die Fähigkeit von Protein A, IgG biospezifisch zu binden, durch die kovalente Bindung von Protein A an einen unlöslichen Träger beeinträchtigt würde, und zwar insbesondere deshalb, weil Protein A ein kleines Protein ist und die Kupplung von Proteinen an den Träger mit Hilfe von Amino- und Carboxylgruppen erfolgt, die sich über die ganze Oberfläche des kleinen Proteins verbreiten, wodurch zu erwarten war, daß die Affinitätsstellen blockiert wurden.
Außerdem ist aus J. Imunol. 104 (2), S. 273-278 (1970) bekannt, daß die Affinität zwischen Protein A und IgG schwach ist, so daß der Fachmann erwarten mußte, daß eine effektive Absorption nicht zustande käme.
Das Immunoglobulin G oder sein an das Antigen zu bindendes Fc-Fragment kann von verschiedenen Tier-' arten, in erster Linie von Wirbeltieren, vorzugsweise von Säugetieren, stammen. Der Fc-Teil der Immunoglobuline G kann nach bekannten enzymatischen Methoden zu dem entsprechenden Fc-Fragment abgespalten werden.
Gemäß der Erfindung kann das Immunoglobulin G oder sein freies Fc-Fragment nicht markiert oder markiert sein. Unter »markiert« wird hier verstanden, daß das Immunoglobulin oder sein freies Fc-Fragment für analytische Zwecke mit charakteristischen Gruppen oder Atomen, wie z. B. radioaktive Atome oder diese enthaltende Gruppen oder auch fluoreszierende Gruppen oder ein oder mehrere Substituenten mit enzymatischer Wirksamkeit, versehen ist. In gleicher Weise können das Antigen oder die daran gebundenen Gruppen im vorstehenden Sinne nicht markiert oder markiert sein, wenn das Antigen an den Fab-Teil des Immunoglobulins gebunden ist.
Nach der Erfindung kann das Protein A z. B. Protein A von Staphylococcus aureus oder Fragmente dieses Proteins sein, wobei diese Fragmente von Polypeptid-Natur sind. Diese Polypeptide (Protein A und Fragmente davon), die von S. aureus abgeleitet sind, besitzen die Fähigkeit, zur IgG-Klasse gehörende Immunoglobuline an ihren Fc-Teilen zu binden.
Wie vorstehend erwähnt, wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart einer Flüssigkeit durchgeführt. Die Flüssigkeit ist in erster Linie eine wäßrige Flüssigkeit, wie z. B. eine gepufferte Kochsalzlösung von geeignetem pH-Wert, z. B. einem etwa neutralen pH-Wert.
Erfindungsgemäß kann das Protein A oder Fragmente davon, mit Hilfe von kovalenten Bindungen an das Polymer gebunden werden. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß das Protein A während der Waschvorgänge nicht aus der festen Phase herausgelöst oder entfernt wird. Das Protein A kann nach Methoden, die üblicherweise zum Binden von Polypeptiden, z. B. Proteinen, an polymere Substanzen verwendet werden, z. B. mit Hilfe von Cyanhalogeniden, Isocyanaten usw., an das Polymer gebunden werden. Die verwendeten polymeren Substanzen können Polymere sein, die üblicherweise für ähnliche Zwecke eingesetzt werden, z. B. Cellulose, Agarose und vernetzte Polysacchyride, wie Dextran, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist (Sephadex®).
Die aus dem Polymer bestehende feste Phase kann in verschiedener Form vorliegen. In vielen Fällen kann das Polymer in Teilchenform eingesetzt werden. Andere Beispiele schließen die Möglichkeit ein, daß das Polymer an der Wand eines Teströhrchens abgelagert ist
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Hilfsmittel verwendet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer enthält oder daraus besteht, an welches Protein A oder Fragmente davon gebunden ist bzw. sind.
Was vorstehend hinsichtlich des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt wurde, ist auch auf das Hilfsmittel anwendbar.
Die Erfindung kann auf verschiedenen Gebieten angewendet werden, wenn es erforderlich ist, spezifisch und — gegebenenfalls — reversibel Immunoglobuline G oder ihre Fc-Fragmente an eine polymere feste Phase zu binden. Beispiel für derartige Anwendungen sind die Reinigung eines Immunoglobulins G oder seines Fc-Fragmentes. Aufgrund der Tatsache, daß das Immunoglobulin G oder das Fc-Fragment unter milden Bedingungen, z. B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke, abgetrennt werden kann, können das immunogiobulin G oder sein Fc-Fragment in einer sehr reinen Form erhalten werden. Die Erfindung kann auch zur Trennung von einem oder mehreren Immunoglobulinen G von anderen Immunoglobulinklassen in einem Gemisch verschiedener Immunoglobuline angewendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht auch, ein Fc-Fragment aus einem Gemisch von Fc- und Fab-Fragmenten derart spezifisch zu binden, daß das Fab-Fragment leicht in reinem Zustand abgetrennt werden kann. Der gebundene Fc-Fragment kann dann von dem löslichen Polymeren nach einer üblichen Methode abgetrennt und in reinem Zustand erhalten werden.
Das Verfahren kann auch in Verbindung mit einer Anzahl von immunologischen Methoden zur Bestimmung von Immunoglobulinen oder Antigenen angewendet werden.
Bei solchen Methoden können Verfahren und das Hilfsmittel der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um ein Immunoglobulin G in freier Form oder in an ein Antigen gebundener Form oder auch dessen Fc-Fragmente unlöslich zu machen. Sie können im Zusammenhang hiermit auch markiert werden.
Wenn die Immunoglobuline G in freier Form gebunden werden, können ihre Fab-Teile verwendet werden, um Antigene, gegen die diese Fab-Teile gerichtet sind, zu binden. Das Antigen kann in einer markierten Form vorliegen. Das Antigen seinerseits kann an verschiedene Gruppen oder Substanzen, die im Sinne der vorstehenden Bedeutung markiert sein können, gebunden sein.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
B e i s ρ i e 1 1
I. Polypeptid-Herstellung
A. Herstellung eines rohen Extraktes von
Polypeptid-Fragment von Protein A aus
Staphylococcus aureus
Nach der von Sjöquist u. a. in European J. Biochem. Bd. 29 (1972) Seite 572 beschriebenen Methode wurde S. aureus, Stamm Cowan I (ATCC 12 598 = NCTC 8530), gezüchtet.
Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren entfernt und mit 0,9%iger NaCl-Lösung in Wasser gewaschen.
100 g Bakterien (Feuchtgewicht) wurden in 150 ml einer physiologischen Kochsalzlösung aufgeschlämmt 10 mg Trypsin (frei von Chymotrypsin) wurden zugesetzt Der pH-Wert betrug 7,2. Ein Enzym-Behandb.ngsverfahren wurde 30 Minuten bei 30° C und einem pH-Wert von 7,2 durchgeführt wonach 20 mg Trypsin-lnhibitor aus Sojabohnen zugesetzt wurden. Die Suspension wurde dann zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen und durch Milliporen-Filter steril filtriert.
Die steril filtrierte Flüssigkeit enthielt Fragmente von Protein A mit Polypeptid-Charakter im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen. Zur Reinigung der Fragmente, die fähig sind, sich an den Fc-Teil von IgG-MoIekülen zu binden, wurden diese mit Hilfe von Agarose, an die IgG gebunden war, isoliert.
B. Herstellung von Agarose, woran
IgG gebunden ist
Agarose in Form eines im Handel erhältlichen Präparates, Sepharose®4B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Üppsala, Schweden), wurde für diesen Versuch eingesetzt.
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40—190 μ) eingesetzt, die zur Quellung in Wasser fähig sind. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen. 100 ml der gepackten Teilchenmasse im Gemisch mit 50 ml Wasser wurde mit 10 g Cyanbromid in 50 ml Wasser unter Rühren bei 20°C versetzt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5 η NaOH bei 10—11 gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurden die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer in Wasser bei pH 9,0 und 4° C gewaschen.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde unter Rühren bei 4° C in 120 ml der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 mit einem Gehalt von 3,0 g menschlichem IgG (erhalten von Kabi AB, Stockholm, Schweden) aufgeschlämmt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration abgetrennt und mit der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 gewaschen,· wonach die Teilchenmasse in 1,51 einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 0,05 m 2-Aminoäthanol und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat von pH 9,0 aufgeschlämmt und 18 Stunden bei 4°C gerührt wurde. Die Teilchenmasse wurde dann mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff von pH 6,0 und anschließend mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser von pH 7,0 gewaschen, bis die OD 280 m der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glyein-HCl-Pufferlösung in Wasser von pH 3,0 und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung von pH 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro ml der gepackten Teilchenmasse.
C. Trennung der Polypeptid-Fragmente
von Protein A aus S. aureus
Eine chromatographische Säule wurde mit 100 ml der in der vorstehenden Stufe B erhaltenen gepackten Teilchenmasse, an die IgG bei pH 7,0 gebunden war, gefüllt. 100 ml des in der vorstehenden Stufe A erhaltenen rohen Extraktes von pH 7,0, der die Polypeptidfragmente von Protein A enthielt, wurden langsam bei 2O0C mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 50 ml pro Stunde durch die Säule mit der Teilchenmasse geleitet. Die Teilchenmasse wurde dann in der Säule mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei pH 7,0 sorgfältig gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 1 mg gebundene Polypeptide pro ml der gepackten Teilchenmasse.
ίο D. Trennung der Polypeptid-Fragmente
von Protein A von der Teilchenmasse
Die in der vorstehenden Stufe C erhaltenen, an die Teilchenmasse gebundenen Polypeptide wurden durch Eluieren der Säule mit 100 ml einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 aus der Teilchenmasse freigesetzt. Die gesammelte Glycin-HCl-Pufferlösung, die die zum Binden des Fc-Teils von IgG-Molekülen fähigen Polypeptide enthielt wurde durch Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex® G 25 (Teilchen von mit Epichlorhydrin vernetzten! Dextran) entsalzen. Durch Gefriertrocknen wurden etwa 100 mg Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 isoliert Durch Chromatographie konnte gezeigt werden, daß die Polypeptid-Fraktion mehrere eng verwandte Polypeptide enthielt, die alle die Fähigkeit zum Binden der Fc-Teile von IgG-Molekülen hatten. Durch u. a. immunologische Versuche konrue gezeigt werden, daß die Polypeptid-Fraktion rein von verunreinigenden Substanzen war.
In entsprechender Weise können die Polypeptid-Fragmente, die zum Binden des Fc-Teils von IgG-Molekülen fähig sind, isoliert werden, indem man zuerst Protein A isoliert und dann Protein A in Lösung bei z. B. pH 8,2 mit Trypsin in einer der vorstehenden analogen Weise behandelt wonach die Polypeptid-Fragmente mit den entsprechenden Eigenschaften in einer der vorstehenden analogen Weise abgetrennt werden, indem man sie an eine Agarose, an die IgG gebunden war, bindet und die Polypeptid-Fragmente anschließend abtrennt.
II. Herstellung von Agarose, an die
Polypeptid von Protein A aus S. aureus
gebunden ist
E. Herstellung von Agarose, an die
Polypeptid gebunden ist
Für diesen Versuch wurde eine Agarose in Form des im Handel erhältlichen Präparates Sepharose® 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) verwendet
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40—190 μ) verwendet, die in Wasser gequollen waren.
Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen. 10 ml der gepackten Teilchenmasse wurden mit 5 ml Wasser versetzt und dann unter Rühren bei 20° C mit 1 g Cyanbromid in 5 ml Wasser vermischt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 η NaOH bei 10 bis 11 gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit einer 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung in Wasser bei pH 9,0 und 40C gewaschen.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde in 12 ml der vorstehenden Pufferlösung bei pH 9,0 mit einem Gehalt von 25 mg reinem Polypeptid unter Rühren bei 4° C aufgeschlämmt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration gewonnen und mit der vorstehenden Pufferlösung bei pH 9,0 gewaschen, wonach die Teilchenmasse in 500 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 0,05 m 2-Aminoäthanol und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat mit einem pH-Wert von 9,0 suspendiert und 18 Stunden bei 4° C gerührt wurde. Die Teilchenmasse wurde dann mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff und einem pH-Wert von 6,0 und anschließend mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser bei pH 3,0 und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung bei pH 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt gebundenes Polypeptid, das zum Binden des Fc-Teils von IgG- Molekülen fähig war.
III. Binden von Immunoglobulin aus
menschlichem Serum
F. Binden an Agarose, an die
Polypeptid gebunden ist
10 ml der nach der vorstehenden Stufe E erhaltenen gepackten Teilchenmasse, an die ein Polypeptid durch covalente Bindungen gebunden war und die einen pH-Wert von 7,0 hatte, wurden in eine chromatische Säule eingeführt Dann wurden 10 ml menschliches Serum, die mit 10 ml der vorstehenden 0,1m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 verdünnt waren, durch die Säule geleitet, wobei die Teilchenmasse bei 200C und die Durchflußgeschwindigkeit bei 30 Minuten gehalten wurde. Die Teilchenmasse wurde dann in der Säule sorgfältig mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei pH 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt Immunoglobuline der IgG-Kiasse, die an die Teilchenmasse gebunden waren.
Die gebundenen Immunoglobuline können aus den Polymerteilchen durch einfache Verfahren, z. B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der ionenstärke, freigesetzt werden. So wurden die gemäß dem vorstehenden Versuch gebundenen Immunoglobuline durch EIuieren mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser bei pH 3,0 wieder von der Teilchenmasse getrennt Durch immunologische Versuche usw. wurde gezeigt, daß die wieder freigesetzten Immunoglobuline frei von zurückgebliebenen Serumproteinen waren und zur Immunoglobulin-Klasse IgG gehörten.
Beispiel 2
Binden von Immunoglobulin
aus Schweineserum
Der Versuch wurde in gleicher Weise wie der von Beispiel 1 durchgeführt In diesem Fall wurde jedoch die Teilcheninasse mit dem daran gebundenen Polypeptid nicht in eine Säule eingeführt, sondern das Immunoglobulin wurde in folgender Weise gebunden: 10 ml der gepackten Teilchenmasse mit dem covalent daran gebundenen Polypeptid (wobei das Polypeptid analog Stufe E von Beispiel 1 erhalten wurde) wurden in 50 ml einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 suspendiert Zu dieser Suspension wurden im Verlauf von 10 Minungen tropfenweise bei einer Temperatur von 200C 10 ml Schweineserum gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Teilchenmasse durch Filtration abgetrennt und sorgfältig mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Wie in Beispiel 1 waren auf diese Weise die zur Klasse IgG gehörenden Immunoglobuline an die Teilchenmasse gebunden worden. Dies konnte durch anschließende Abtrennung der gebundenen Immunoglobuline und nachfolgenden Analysen in einer Weise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, gezeigt werden.
Beispiel 3
I. Herstellung von reinem Protein A
aus S. aureus
A. Herstellung des rohen Extraktes
von Protein A aus Staphylococcus aureus
Nach der von Sjöquist u. a. in European J. Biochem. Bd. 29 (1972), S. 572 beschriebenen Methode wurde der Stamm Cowan I (ATCC 12 598 = NCTC 8530) von
S. aureus gezüchtet.
Aus den Bakterien wurde Protein A mit Hilfe des Enzympräparates Lysostaphin freigesetzt. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die flüssige Phase wurde gewonnen. Der pH-Wert wurde mit HCl auf 3,5 eingestellt, und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die Flüssigkeit wurde gewonnen. Der pH-Wert wurde dann gemäß der vorstehenden Literatur mit Hilfe von NaOH auf 0,7 eingestellt.
Die enthaltene Flüssigkeit stellte einen rohen Extrakt dar, der Protein A im Gemisch mit verunreinigenden Substanzen enthielt
B. Herstellung von Agarose, an
die IgG gebunden ist
Für diesen Versuch wurde Agarose in Form eines im Handel erhältlichen Präparates, nämlich Sepharose® 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) eingesetzt
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40 bis 190 μ) eingesetzt, die in Wasser gequollen waren. Die Teilchenmasse enthielt 4Gew.-°/o Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen. 100 ml
so der gepackten Teilchenmasse wurden mit 50 ml Wasser versetzt und dann unter Rühren bei 200C mit 10 g Cyanbromid in 50 ml Wasser gemischt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 5 η NaOH bei 10 bis 11 gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit einer 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung in Wasser bei pH 9,0 und 4" C gewaschen.
Die Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde in 120 ml der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 mit einem Gehalt von 3,0 g menschlichem IgG (erhalten von KaM AB, Stockholm, Schweden) bei 4° C unter Rühren aufgeschlämmt
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration gewonnen und mit der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 gewaschen. Die Teilchenmasse wurde dann in 1,51 einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 0,05 m 2-Aminoäthanol und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat bei pH 9,0 suspendiert und
18 Stunden lang bei 4°C gerührt. Anschließend wurde die Teilchenmasse mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff und einem pH-Wert von 6,0 und dann mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser bei pH 3,0 und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro ml der gepackten Teilchenmasse.
C. Trennung von Protein A aus
dem rohen Extrakt von S. aureus
Eine chromatographische Säule wurde mit 100 ml der in Stufe B erhaltenen gepackten Teilchenmasse mit daran gebundenem IgG und mit einem pH-Wert von 7,0 gefüllt. 500 ml des in Stufe A erhaltenen rohen Extraktes mit einem Gehalt von Protein A und einem ρ H-Wert von 7,0 wurden langsam bei 20° C durch die Säule geleitet, wobei die Durchflußgeschwindigkeit auf 50 ml pro Stunde eingestellt wurde. Die Teilchenmasse wurde dann in der Säule sorgfältig mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 3 mg gebundenes Protein A pro 1 ml der gepackten Teilchenmasse.
ü. Abtrennung von Protein A
aus der Teilchenmasse
Das gemäß der vorstehenden Stufe C an die Teilchenmasse gebundene Protein A wurde durch Eluieren der Säule mit 100 ml einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser bei pH 3,0 daraus freigesetzt Die das Protein A enthaltende gesammelte Glycin-HCl-Pufferlösung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, wonach das Protein A in fester Form durch Gefriertrocknen erhalten wurde. Auf diese Weise wurden etwa 250 mg Protein A in reiner Form erhalten. (Anstelle der Dialyse kann auch eine Entsalzung mit Hilfe einer Gelfiltration durchgeführt werden.) Durch immunologische Versuche konnte gezeigt werden, daß das Protein A frei von verunreinigenden Substanzen war.
II. Herstellung von Agarose, an die
Protein A aus S. aureus gebunden ist
E. Herstellung von Agarose, an die
Protein A gebunden ist
Für diesen Versuch wurde Agarose in Form des im Handel erhältlichen präparates Sepharose® 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) eingesetzt
Die Agarose wurde in Form kleiner Teilchen (40—190 μ) eingesetzt die in Wasser gequollen waren. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agarose. Die Teilchenmasse wurde zuerst mit Wasser gewaschen. 10 ml der gepackten Teilchenmasse wurde mit 5 ml Wasser versetzt und unter Rühren bei 200C mit 1 g Cyanbromid in 5 ml Wasser gemischt wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1 π NaOH bei 10 bis 11 gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse sorgfältig mit eiskaltem Wasser und dann mit einer 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung in Wasser von pH 9,0 und 4°C gewaschen.
Die mit Cyanbromid aktivierte Teilchenmasse wurde bei 4° C unter Rühren in 12 ml der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 mit einem Gehalt von 50 mg reinem Protein A aufgeschlämmt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse durch Filtration gewonnen und mit der vorstehenden Pufferlösung von pH 9,0 gewaschen, wonach die Teilchenmasse in 500 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 0,05 m 2-AminoäthanoI und 0,2 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat und einem pH-Wert von 9,0 suspendiert und 18 Stunden bei 40C gerührt wurde. Die Teilchenmasse wurde dann mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem Gehalt von
4 m Harnstoff und einem pH-Wert von 6,0 und anschließend mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde dann mit einer 0,1 m Glycin-HCl-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 und anschließend erneut mit der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt etwa
5 mg gebundenes Protein A pro ml der gepackten Teilchenmasse.
III. Binden von Immunoglobulin aus
menschlichem Serum
F. Binden an Agarose, an die
Protein A gebunden ist
10 ml der in Stufe E erhaltenen gepackten Teilchenmasse, an die Protein A covalent gebunden war und die einen pH-Wert von 7,0 aufwies, wurden in eine chromatographische Säule gefüllt Durch die Säule mit der Teilchenmasse wurden bei 200C in einer Durchflußzeit von 30 Minuten 10 ml menschliches Serum geleitet die mit 10 ml der vorstehenden 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 verdünnt waren. Die Teilchenmasse wurde dann in der Säule sorgfältig mit 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser von pH 7,0 gewaschen, bis die OD 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt Immunoglobuline der Klasse IgG gebunden an die Teilchenmasse.
Die gebundenen Immunoglobuline können durch einfache Verfahren, z. B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke, aus dem Polymerteilchen freigesetzt werden. So wurden die im vorstehenden Versuch gebundenen Immunoglobuline durch Eluieren mit 0,1 m Glycerin-HCl-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 3,0 wieder von der Teilchenmasse getrennt Durch immunologische Tests usw. wurde festgestellt daß die wieder freigesetzten Immunoglobuline rein von Serumproteinen waren und zur Klasse IgG der Immunoglobuline gehörten.
Beispiel 4
Binden von Immonuglobulin
aus Schweineserum
Dieser Versuch wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 3 durchgeführt wobei jedoch in diesem Fall die Teilchenmasse mit dem daran gebundenen Protein A
nicht in eine Säule eingeführt wurde, sondern das Immunoglobulin in folgender Weise gebunden wurde: 10 ml der gepackten Teilchenmasse mit dem covalent daran gebundenen Protein A (wobei das Protein A analog Stufe E von Beispiel 3 erhalten worden war) wurden in 50 ml einer 0,1 m Natriumphosphat-pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert. Diese Suspension wurde im Verlauf von 10 Minuten bei einer Temperatur von 200C tropfenweise mit 10 ml Schweineserum versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Teilchenmasse durch Filtration abgetrennt und sorgfältig mit einer 0,1 m Natriumphosphat-Pufferlösung in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen.
Wie in Beispiel 3 waren die Immunoglobuline der Klasse IgG an die Teilchenmasse gebunden worden. Dies konnte gezeigt werden, indem man die gebundenen Immunoglobuline wieder abgetrennte und anschließend die in Beispiel 3 beschriebenen Analysen durchge,-führte.
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Claims (12)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Binden von mindestens einem Immunoglobulin oder dessen freiem Fc-Fragment, wobei das Immunoglobulin in freier Form oder mit seinem Fab-Teil gebunden an ein Antigen, an das wahlweise eine oder mehrere Gruppen oder Substanzen gebunden sind, vorliegt, in Gegenwart einer Flüssigkeit an ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer mit Hilfe einer an das Polymer gebundenen Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin ein Immunoglobulin der Klasse IgG ist und daß die verwendete an das Polymer gebundene Substanz Protein A oder Fragmente davon ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein markiertes Immunoglobulin G oder ein markiertes freies Fc-Fragment des immunoglobulins G verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Verwendung eines Immunoglobulins G, an dessen Fab-Teil ein Antigen gebunden ist, das Antigen markiert.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es zur Reinigung von einem Immunoglobulin G anwendet.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es zu einer immunologischen Bestimmung anwendet
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit eine wäßrige Flüssigkeit verwendet
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Protein A oder Fragmente davon über kovalente Bindungen an das Polymer gebunden wird.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polymer in Form von Teilchen einsetzt.
9. Hilfsmittel zur Durchführung der Verfahren nach den Ansprüchen 1—8, dadurch gekennzeichnet, daß es ein in der Flüssigkeit unlösliches Polymer enthält oder daraus besteht, an welches Protein A oder Fragmente davon gebunden ist bzw. sind.
10. Hilfsmittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein A von Staphylococcusaureus erhalten worden ist.
11. Hilfsmittel nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß Protein A bzw. die Fragmente davon über kovalente Bindungen an das Polymer gebunden ist bzw. sind.
12. Hilfsmittel nach Anspruch 9 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daii das Polymer in Teilchenform vorliegt.
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2322562C2 (de) * 1972-11-06 1984-03-29 Pharmacia AB, Uppsala Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe
IL47372A (en) * 1975-05-27 1979-10-31 Yeda Res & Dev Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same
US4189466A (en) * 1975-09-19 1980-02-19 Technical Research Affiliates, Inc. Detection of rheumatoid factor by antibody sensitized microbial particles
DE2643208C2 (de) * 1976-09-25 1985-09-05 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Immunologisches Bestimmungsverfahren
ES471585A1 (es) * 1977-07-15 1979-01-16 Behringwerke Ag Procedimiento para la determinacion de reactivos fc
US4230685A (en) * 1979-02-28 1980-10-28 Northwestern University Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein
US4399229A (en) * 1980-04-14 1983-08-16 Immutron, Inc. Rapid radioimmunoassay product and method of making and using same
US4722896A (en) * 1981-01-26 1988-02-02 The Beth Israel Hospital Association Method for affinity purification of hybridoma antibodies
US4481298A (en) * 1981-04-13 1984-11-06 Amf Incorporated Pre-precipitated double antibody immunoassay method
US4374061A (en) * 1981-07-27 1983-02-15 Center For Blood Research, Inc. Means and methods for purifying Clq, Clr and Cls
US4452773A (en) * 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
US4483929A (en) * 1982-05-03 1984-11-20 Liposome Technology Incorporated Liposomes with glycolipid-linked antibodies
US4470925A (en) * 1982-05-05 1984-09-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies
US4479895A (en) * 1982-05-05 1984-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies
US4591552A (en) * 1982-09-29 1986-05-27 New York Blood Center, Inc. Detection of hepatitis B surface antigen (or antibody to same) with labeled synthetic peptide
US4634417A (en) * 1982-12-06 1987-01-06 Georgetown University Process for treatment of tumors and apparatus therefor
US4757002A (en) * 1983-06-13 1988-07-12 Regents Of The University Of Minnesota Method and kit for the estimation of serum immunoglobulin
US4617262A (en) * 1983-07-22 1986-10-14 Cooperbiomedical, Inc. Assaying for circulating immune complexes with labeled protein A
US4614513A (en) * 1984-08-13 1986-09-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and apparatus for treatment to remove immunoreactive substances from blood
DE3435744C2 (de) * 1984-09-28 1986-08-07 Organogen Medizinisch-Molekularbiologische Forschungsgesellschaft mbH, 6900 Heidelberg Trägermaterial zur Verwendung für Immunbestimmungen
SE448190B (sv) * 1985-06-03 1987-01-26 Pharmacia Ab Sett att bestemma fc-dels-bindande bakteriella polypeptider
US4900663A (en) * 1985-09-13 1990-02-13 Environmental Diagnostics, Inc. Test kit for determining the presence of organic materials and method of utilizing same
US5063151A (en) * 1985-09-20 1991-11-05 Biometallics, Inc. Immunoassay method and kit
US4900660A (en) * 1985-11-25 1990-02-13 University Of Florida Streptococcal fc rc
US4883754A (en) * 1986-03-06 1989-11-28 University Of Florida Research Foundation Bacterial FC receptors
US4954617A (en) * 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
IT1198233B (it) * 1986-12-23 1988-12-21 Eniricerche Spa Metodo per la determinazione di anticorpi antisporozoita di p. falciparum nel sangue umano
US5260373A (en) * 1987-03-13 1993-11-09 Repligen Corporation Immobilized immunoglobulin-binding proteins
US5449760A (en) * 1987-12-31 1995-09-12 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils
US5422258A (en) * 1987-12-31 1995-06-06 Tanox Biosystems, Inc. Methods for producing high affinity anti-human IgE-monoclonal antibodies which binds to IgE on IgEabearing B cells but not basophils
US4945157A (en) * 1988-05-27 1990-07-31 University Of Florida Novel Extraction procedure for protein G
US5153166A (en) * 1988-08-18 1992-10-06 Trustees Of At Biochem Chromatographic stationary supports
SE466259B (sv) * 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0485664A1 (de) * 1990-11-13 1992-05-20 Mallinckrodt Diagnostica (Holland) B.V. Verfahren zur Herstellung von einem diagnostischen Mittel zur Feststellung von Entzündungen
US5371208A (en) * 1992-12-30 1994-12-06 Guest Elchrom Scientific Ltd. Preparation of cross-linked linear polysaccharide polymers as gels for electrophoresis
US6861231B2 (en) * 2001-08-17 2005-03-01 Qiagen Gmbh Suppression of cross-reactivity and non-specific binding by antibodies using protein A
US6823684B2 (en) * 2002-02-08 2004-11-30 Tim Allan Nygaard Jensen System and method for cooling air
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
US20050233390A1 (en) * 2003-04-09 2005-10-20 Allen John W Device including a proteinaceous factor, a recombinant proteinaceous factor, and a nucleotide sequence encoding the proteinaceous factor
JP2005112827A (ja) * 2003-10-10 2005-04-28 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 抗体アフィニティ担体
EP1863908B1 (de) 2005-04-01 2010-11-17 Qiagen GmbH Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
CA2666053C (en) * 2006-12-06 2011-03-29 Repligen Corporation Nucleic acids encoding recombinant protein a
EP2728000B1 (de) 2011-06-03 2018-12-05 National Institute of Advanced Industrial Science And Technology Mutiertes protein mit verringerter affinität im sauren bereich und antikörpererfassungsmittel

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE343949B (de) * 1966-06-02 1972-03-20 Pharmacia Ab
SE337223B (de) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
SE343210B (de) * 1967-12-20 1972-03-06 Pharmacia Ab
US3790663A (en) * 1970-07-07 1974-02-05 Us Health Preparation of dry antiserum coated solid-phase for radioimmunoassay of antigens
DE2322552C2 (de) * 1972-11-06 1986-08-28 Pharmacia AB, Uppsala Verfahren zum Abtrennen von Protein A aus Staphylococcus aureus aus einer Flüssigkeit

Also Published As

Publication number Publication date
GB1441979A (en) 1976-07-07
NL7315193A (de) 1974-05-08
DK141583B (da) 1980-04-28
FR2205531B1 (de) 1978-11-17
US3995018B1 (de) 1986-06-24
US3995018A (en) 1976-11-30
JPS6129932B2 (de) 1986-07-10
DK141583C (de) 1980-11-03
DE2322533A1 (de) 1974-05-09
IL43462A0 (en) 1974-01-14
FR2205531A1 (de) 1974-05-31
US3995018B2 (en) 1987-07-07
JPS49133518A (de) 1974-12-21
IL43462A (en) 1976-10-31

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