Im Zuge von die Zusammensetzung von eiweisshaltigen Na turstoffenlbetreffendenUntersuchungen wurde festgestellt, dass die meisten dieser eiweisshaltigen Naturstoffe ein bei dei
Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von
9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander liegenden Banden langsamer als Albumin jedoch schileller als y-Globulin wanderndes Protein in sehr geringen und von der Jahreszeit und der Ernihrung (bei Tieren) abhin- gigen Mengen enthalten und dass dieses Protein, mit Ionen gewisser zweiwertiger Metalle chelatisiert, eine hervorragende antiinflammatorische Wirkung besitrt.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, dieses Protein Metall-Chelat in möglichst reiner Form aus natiirlichen
Eiweissquellen zu isolieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Protein-Metall-Chelaten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Protein aus einer natirlichen Eiweissquelle in einem wässrigen Medium mit zweiwertigen Metallionen zusammenbringt und das erhaltene Protein-Metall-Chelat aus dem Reaktionsmedium isoliert.
Bevorzugte, nach dem erflndungsgemiissen Verfahren herzu stellende Protein-Metall-Chelate sind diejenigen, bei denen mindestens 65 Gew.-% des Metallgehaltes aus den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/oder Kupfer bestehen, wobei die entsprechenden Protein-Magnesium Chelate speziell bevorzugt sind. Diese bevorzugten Protein Metall-Chelate können entweder durch direkte Chelierung unter Verwendung der entsprechenden Metallionen oder auch durch Umchelierung von als Zwischenprodukt hergestellten anderen Metall-Chelaten erzeugt werden.
Zwei speziell bevorzugte Arbeitsverfahren zur Herstellung dieser bevorzugten Protein-Metall-Chelate nach dem erfindungsgemlssen Verfahren werden wie folgt durchgefiihrt:
Eines der beiden bevorzugten Arbeitsverfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelates, in welchez dieses einen Metallgehalt von 0,1-1,0% aufweist und mindestens 65 Gew.-% dieses Metallgehaltes aus den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/oder Kupfer besteht und das Protein-Metall-Chelat antiinflammatorische Eigenschaften aufweist und bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von zwei oder drei Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als Globulin wandert,
wird so durchgefiihrt, dass man ein Protein aus einer natiirlichen Eiweissquelle in einem wiissrigen System mit 2-wertigen lonen der Metalle Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/ oder Kupfer zusammenbringt, wobei sich das Protein-Metall Chelat bildet und dieses Fraktionierschritten unterwirft, und eine kurzzeitige Erhitzung auf eine Temperatur bis etwa 75 C durchfiihrt, um wirmelabile Proteine abzutrennen und schliesslich das gewflnschte Protein-Metall-Chelat aus dem Reaktionsmedium isoliert.
Das andere bevorzugte Arbeitsverfahren ist das oben er wihnte, bei dem wahrend der Verfahrensführung eine Transchelierung durchgefiihrt wird. In diesem Fall arbeitet man zweckmissigerweise so, dass man ein Protein aus einer natiir- lichen Eiweissquelle in einem wiissrigen System mit zweiwertigen Metallionen, die jedoch keine Magnesium-, Calcium-, Eisen-, Zink-, Kobalt- und/oder Kupferionen sind, zusammenbringt, die das Protein-Metall-Chelat enthaltende Lösung Fraktionierschritten und einer kurzzeitigen Erhitzung auf eine Temperatur von bis zu 75 C zwecks Abtrennung wirmelabiler Proteine unterwirft,
und anschliessend das Protein-Metall Chelat durch Umsetzung mit Ionen der Metalle Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt und/oder Kupfer in ein Metall Chelat dieser Metalle iiberfiihrt, dieses Material isoliert, wobei man ein Protein-Metall-Chelat mit einem Metallgehalt von 0,1-1,0% erhält, in dem mindestens 65% des Gesamtmetall gehaltes von den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink,
Kobalt oder Kupfer gebildet werden.
Speziell vorteilhaft ist es dabei, wenn man das Protein aus einer natiirlichen Eiweiss quelle mit einem wlsrigen System zusammenbringt, das Man ganionen enthilt und das als Zwischenprodukt erhaltene Protein-Mangan-Chelat durch Umsetzung mit entsprechenden
Metallionen in das Protein-Metall-Chelat umwandelt, in wel chem mindestens 65% des Metallgesamtgehaltes von den Metallen Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kobalt oder Kupfer gebildet werden.
Wie bereits erwähnt wurde, ist ein bevorzugtes, nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Protein-Metall Chelat das entsprechende Protein-Magnesium-Chelat. Dieses kann beispielsweise erhalten werden, indem man durch direkte Umsetzung mit Magnesiumionen oder durch Transchelierung mit Magnesiumionen ein Protein-Magnesium-Chelat bildet, wobei dieses, falls es durch Transchelierung eines als Zwischenprodukt gewonnenen Protein-Mangan-Chelates erzeugt wild, einen Mangangehalt aufweist, der weniger als 10 Gew. % des Gesamtmetallgehaltes des Protein-Metall-Chelates ausmacht.
Das Protein, das dem erfindungsgemässen Verfahren unterworfen wird, und welches zu den Globulinen gehört, kann unter Anwendungan sich bekannter Arbeitsverfahren (vgl.
Ullmann's Enzyklopädie der Technischen Chemie , 3. Auflage, Band 14, Seiten 409-412) aus verschiedensten natiir- lichen Proteinquellen isoliert werden.
Bei den Ausfiihrungsarten des erfindungsgemlssen Verfahrens soll Sorge getragen werden, dass das erwünschte Protein Metall-Chelat in möglichst reiner Form erhalten wird. Es ist daher zweckmässig, im Zuge jedes Verfahrensschrittes diejenige Fraktion auszuwählen und der weiteren Behandlung zu unterwerfen, die dasjenige Protein-Metall-Chelat enthilt, das bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander liegenden Banden (in der Regel 2 oder 3 je nach Auflösungsvermögen) langsamer als Albumin jedoch schneller als y-Globulin wandert. Diese Substanz soll als Endprodukt in möglichst reiner Form erhalten werden.
Bei der Durchfuhrung des erfindungsgemässen Verfalirens kann das erwiinschte Protein-Metall-Chelat gewonnen werden, indem man eine natiirliche Eiweissquelle mit einem zweiwertigen Metallionen, vorzugsweise Manganionen enthaltenden Puffer extrahiert und die erhaltene Lösung entweder einer Gelscheiben-Elektrophorese unterwirft, und zwar sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8, das in Form von knapp beieinander liegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y-Globulin wanderndes Material isoliert, oder durch Chromatographieren tiber ein Molekularsieb,
das erwunschte Protein-Metall-Chelat in einer solchen Reinheit erhilt, dass seine antiinflammatorische Wirkung beeinträchtigende Begleitstoffe nur mehr in geringen Mengen vorhanden sind. Es erscheint jedoch angezeigt, der Gel-Elektrophorese oder dem Chromatographieren iiber ein Molekularsieb bereits eine Proteinfraktion zuzuführen, welche in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch fraktioniertes Flllen mittels Salzen und/oder Lösungsmitteln, von der Hauptmenge der das erfindungsgemäss zu isolierende Protein begleitenden Proteins befreit worden ist, um die bei der Gel-Elektrophorese bzw. beim Chromatographieren aufzuarbeitende Substanzmenge möglichst gering zu halten und damit eine schirfere Auflösung der Banden (Fraktionen) erzielen zu können.
Zwecks Isolierens des bei der Gelscheiben-Elektrophoreses mit typischer Geschwindigkeit relativ zu anderen Proteinen wandernden Protein-Metall-Chelats ist es j edoch nicht unbedingt erforderlich, eine Gel-Elektrophorese vorzunehmen oder zu chromatographieren, sondern es können auch, wenn auch in weniger vorteilhafter Weise, andere für das Fraktionieren von Proteinen an sich bekannte Fralttionier- schritte aneinandergereiht werden, wobei es lediglich erforderlich ist, beim Aufsuchen neuer Kombinationen an sich bekannter Methoden bzw.
beim Aufsuchen neuer Wege den Gehalt der erhaltenen Fraktionen an dem bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beieinander liegenden Banden langsamer als Albumin, jedoch schneller als y Globulin wandernden Protein-Metall-Chelat mittels Gelscheiben-Elektrophorese zu iiberpriifen; sobald mittels des Orientierungshilfsmittels Gelscheiben-Elektrophorese irgend eine Kombination von Fraktionierschritten als brauchbar erkannt worden ist, kann diese Kombination von Fraktionierschritten ohne weitere Kontrolle durch Gelscheiben-Elektrophorese, stets die gleiche Proteinquelle vorausgesetzt, routinemässig wiederholt werden.
Unter Ausniitzung dieser Erkenntnis ist das erfindungsge mässe Verfahren zur Herstellung eines neuen wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiinflammatorischen Eigenschaften, welches bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von zwei oder drei Banden langsamer als Albumin jedoch schneller als y-Globulin wandert, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer dieses Protein in Form eines Metallchelats enthaltenden und durch Extrahieren einer natiirlichen Eiweissquelle mit ein zweiwertiges Metallion enthaltendem Wasser oder mit ein zweiwertiges Metallion und einen Puffer enthaltendem Wasser erhaltenen Lösung von wasserlöslichen Proteinen im Zuge einer Anzahl von beliebig aneinandergereihten Fraktionierschritten,
wobei einzelne Fraktionierschritte gleicher Art gegebenenfalls mehrfach durchgeftihrt werden, darunter ein kurzzeitiges Erhitzen einer das erwunschte Protein enthaltenden Lösung auf eine Temperatur bis etwa 75 C zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine, in Form eines 0,1-1,0% Metall aufweisenden Chelats isoliert wild, in welchem zumindest 65 % des Metallgehalts von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist.
Jede unter Verwendung des Orientierungshilfsmittels Gelscheiben-Elektrophorese ermittelte spezielle Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unterscheidet sich zwangs- lea'fig von jedem anderen bekannten Verfahren zum Isolieren von einheitlichen Proteinen aus Proteingemischen trotzdem prinzipiell beim Isolieren von einheitlichen Proteinen aus Proteingemischen keine anderen als an sich bekannte Fraktionierschritte zur Verfiigung stehen, es also prinzipiell nur mög- lich ist, aus Leo'sung von Proteinen einzelne Proteine bzw.
Proteingemische mittels Lösungsmitteln oder anorganischen Salzen oder mittels Pufferlösungen beim isoelektrischen Punkt fraktioniert zu fallen, aus erzeugten Fällungen bzw. auch aus den eingesetzten Ausgangsstoffen einzelne Proteine bzw.
Proteinfraktionen selektiv unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln und/oder anorganischen Salzen enthaltenden wisserigen Lösungen zu extrahieren, Lösungen von Proteinen auf chromatographischem Wege aufzuarbeiten und durch kurzzeitiges Erhitzen von Ldsungen von Proteinen auf bestimmte Temperaturen selektiv Fällungen zu erzeugen. So wird beispielsweise beim auf die Herstellung einer injizierbaren Arginase abzielenden Verfahren remiss der USA-PS Nr.
2 663 668 ebenso wie beim erfindungsgemässen Verfahren eine natiirliche Eiweissquelle, beispielsweise Rinderleber, mit einem zweiwertigen Metallion, u.zw. Mn++ und/oder Co++, enthaltendem Wasser bei einem ebenfalls fur das erfindungs gemässe Verfahren in Frage kommenden pH-Wert von 7,09,5 extrahiert und anschliessend aus der erhaltenen Lösung durch fraktioniertes Fallen mittels Aceton als zweite Fällung eine arginasereiche Fraktion erhalten,
worauf aus einer wässe- rigen Lösung dieser arginasereichen Fraktion zunächst durch Erhitzen auf 60-80"C und dann durch Zusetzen von Salzen des zweiwertigen Bleis noch störende Fremdproteine ausgefällt werden und aus der erhaltenen klaren Lösung mittels Aceton Arginase ausgefällt wird, die sodann noch durch Zusatz von weiteren Cobaltsalzen zusätzlich aktiviert werden kann.
Bei diesem bekannten, eine Weiterentwicklung bereits früher bekannter Verfahren zum Isolieren von Arginase aus natur- lichen Eiweissquellen darstellenden Verfahren wurde offensichtlich die Arginasewirkung der jeweils erhaltenen Proteinfraktionen als Orientierungshilfsmittel dafür herangezogen, ob es sich bei der in Betracht gezogenen Proteinfraktion um eine brauchbare oder unbrauchbare Fraktion handelt, wobei jedoch diese Entscheidung rein routinemässig im Hinblick auf die seit langem bekannte Wirkung der Arginase getroffen werden konnte.
In Kenntnis der Eigenschaft des erfindungsgemiss herstellbaren Protein-Metall-Chelats bei der Gelscheiben Elektrophorese das oben genannte Wanderungsverhalten zu zeigen, kann zwar ebenfalls die Entscheidung fiber die auszu wählende und weiterzuverarbeitende Fraktion rein routine mässig getroffen werden, jedoch war es, um zur vorliegenden Erfindung zu gelangen, eben erst erforderlich zu erkennen,
dass in natiirlichen Eiweissquellen iiberhaupt ein in Form des oben angegebenen Chelats isolierbares Protein vorliegt und trotz des äusserst geringen Gehaltes natiirlicher Eiweissquellen an diesem Protein aus diesen Eiweissquellen in Form des oben angegebenen Metallchelats nach an sich bekannten Methoden zum Fraktionieren von Proteinen isolierbar ist. Durch die USA-Patentschrift Nr. 2 663 668 und auch durch die iibrige bisher bekannte und das Fraktionieren von Eiweisstoffen betreffende Literatur wird weder die Existenz des in einem erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelat enthaltenen Proteins noch die Möglichkeit dieses Protein-Metall Chelat aus naturlichen Eiweissquellen zu gewinnen, nahegelegt.
Die Struktur des erfindungsgemäss in Form eines Metaliche- lats isolierbaren Proteins ist, ebenso wie für die weitaus meisten Proteine, nicht geklärt. Strukturuntersuchungen, welche sich in der Regel iiber mehrere Jahrzehnte erstrecken, sind im Gange. Die fir die Kennzeichnung der Struktur eines Proteins zumindest erforderliche Aminosäurensequenz ist unbekannt.
Im folgenden werden die bisher vorliegenden Ergebnisse der Strukturuntersuchung des erfindungsgemäss isolierbaren Protein-Metall-Chelats angegeben.
Die durchschnittliche Elementaranalyse des Protein-Metall Chelats lautet: 50,02% C, 7,92% H, 25,55% 0, 15,26% N, 0,00% P, < 1% Asche. Der Stickstoffgehalt gemäss dieser Elementaranalyse liegt etwas niedriger als der typischer Proteine, was darauf hindeutet, dass im erfindungsgemäss isolierbaren Protein-Metall-Chelat auch Nicht-Proteine enthalten sind. Diese Tatsache wird durch unter Verwendung eines Jod Schiff-Indikators durchgefflhrte Gelscheiben-Elektrophorese bestätigt. Nach saurer Hydrolyse des Proteins durchgefiihrte Priifungen mit Zuckerreagentien weisen auf die Anwesenheit einer geringen Menge an Kohlehydrat hin, welches wahrscheinlich covalent an das Protein gebunden ist.
Der isoelektrische Punlit des erfindungsgemäss herstellbaren Protein-Metall-Chelats liegt etwa bei einem pH-Wert von 5,5+0,3. Je nachdem, von welcher Seite her man sich an den isoelektrischen Punlit heranbewegt, wird das Protein-Metall Chelat bei pH-Werten von 4,0-6,0 teilweise oder vollständig unlöslich, weshalb Lösungen dieses Chelats pH-Werte von 1,0-4,0 oder 6,0-11,0, vorzugsweise 7,0-8,0 besitzen sollen, um durch Fiillungserscheinungen eine Verringerung der Ausbeute zu vermeiden; ein pH-Wert unterhalb 1,0 bzw. ein pH Wert oberhalb 11,0 soll vermieden werden, da dann die Gefahr einer Denaturierung des Protein-Metall-Chelats besteht.
Das Infrarotspektrum des erfindungsgemlss isolierbaren Metall-Chelats eines Proteins ist, bei pH = 7 bestimmt, typisch fiir Proteine. In der untenstehenden Tabelle sind die Ultraviolettabsorptionsspektren dieses Proteins bei pH = 1,5 in 0,05 n HCI, bei pH = 1,5 in 0,05 n HCI+ 0,10 m KCl bei pH = 7 in Wasser, bei pH = 7 in 0,05 m Phosphatpuffer und bei pH = 13 in 0,15 m KCI, wobei der pH-Wert mit 1 n KOH auf 13 eingestellt wurde, dargestellt.
Ultraviolett-Absorptionsspektren des neuen Protein-Metall helats
Optische Dichte pH1,5 pH7,0 pH7,0 pH13,0 mm y = 0,05 y = 0,15 H2O Puffer KCl-KOH
0,560 mglml 0,434 mg/ml 1,00 mg/ml 0,492 mg/ml 0,492 mg/ml 310 0,066 0,005 0,035 0,00 0,126 300 0,102 0,030 0,090 0,03 0,280 295 0,145 0,066 0,184 0,13 0,353 290 0,236 0,129 0,372 0,18 0,430 285 0,320 0,190 0,510 0,25 0,429 284 0,342 0,204 0,540 0,22 0,430 283 0,355 - 0,560 - 282 0,369 0,219 0,570 0,29 0,438 281 - - 0,580 - 280 0,377 0,244 0,585 0,30 0,430 279 - 0,226 0,590 - 278 0,384 0,227 0,592 0,30 0,420 277 - 0,228 0,590 - 276 0,385 0,226 0,588 0,30 0,411 275 0,385 0,225 0,580 - 0,410 270 0,364 0,206 0,538 0,27 0,422 265 0,330 0,179 0,475 0,23 0,471 260 0,284 0,144 0,400 0,19 0,592 255 0,247 0,117 0,337 0,15 0,845 250 0,226 0,104 0,315
0,13 1,150 245 0,263 0,134 0,402 0,18 -1,45 240 0,432 0,272 0,190 0,37 1,70 230 - - - 1,80
Wie der Tabelle entnommen werden kann, sind die im sauren Milieu und im alkalischen Milieu ermittelten Absorptionsspektren des Protein-Metall-Chelats beträchtlich verschieden von dem bei pH = 7 erhaltenen Absorptionsspektrum.
Bei der Gelscheiben-Elektrophorese auf Polyacrylamid gibt das erfindungsgemls isolierbare Metall-Chelat des Proteins ein typisches Bild mit drei nahe beieinander liegenden Banden sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH Wert von 3,8 (fliessendes Gel) [Diese Arbeitsweise beruht auf den Arbeiten von Ornstein und Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci.
121, 321 und 404 (1964) und von Williams und Reisfeld, Nature 195, 281 (1962)]. Typische Elektrophorogramme des Protein-Metall-Chelats enthilt die untenstehende Tabelle, in welcher simtliche Werte Näherungswerte darstellen.
pH9,4 pH3,8 B Abstand vom Relative Breite Abstand vom Relative in mum Ursprung Intensität in mum Umprung Intensitlt inmml) in % iflmml) in% oberes Band 1,0 11,5 100 1,2 16,5 100 mittleres Band 1,0 14,0 89-93 0,4 20,0 53-56 unteres Band 0,5 18,0 48-52 1,2 22,0 94-96 t) oberer Rand, Gesamtliinge des fliessenden Geles:
56 mm
Es wird angenommen, dass die sich bei der Gelscheiben Elektrophorese zeigenden typischen drei Banden auf eine Aufspaltung einer Bande zuriickzufiihren ist, welche Aufspaltung Pufferwirkungen im elektrischen Feld zugeschrieben werden kann und nicht auf die Anwesenheit dreier verschiedener Proteine im Metall-Chelat hinweist. Ureter Verwendung von Argarose durchgefiihrte Elektrophorogramme können zur angentiherten Bestimmung der Konzentration des erwflnschten Proteins in einem Proteingemisch herangezogen werden. Zu diesem Zwecke kann bei einer Konzentration der Probe von 10-100 mg/ml in 0,05 m [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan]-Glycin-Puffer bei pH 8,45 mit 5 mA und 188 V 30 Minuten gearbeitet werden.
Analytisch besitzt diese Methode gegeniiber der Gelscheiben-Elektrophorese den Vorteil, dass wegen der nahe dem Zentrum der Platte liegenden Probe die wandernden Proteine sowohl kathodisch als auch anodisch sichtbar gemacht werden können.
Das erfindungsgemiiss herstellbare Protein-Metall-Chelat stellt im Hinblick auf das Verhalten bei der Gelscheiben Elektrophorese offensichtlich eine chemisch einheitliche Substanz dar, was auch durch das Verhalten dieses Chelats beim Chromatographieren iiber Ionenaustauschharzen aber auch durch das Verhalten beim Ultrazentrifugieren bestätigt wild, wo das erfindungsgemlss herstellbare Protein-Metall-Chelat in Form eines einheitlichen, scharfen Bandes weiterwandert und der Sedimentationskoeffizient zu etwa 3,32+0,05 Svedberg Einheiten bestimmt wird.
Das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat besitzt in pharmakologischer Hinsicht ein breites Wirkungsspektrum und ist in der Lage, durch Vireninfektionen bewirkte Schädigungen zu lindern und kann in Säugetieren die Folgen von Qberanstrengungen beseitigen bzw. das Immunitätsgleich- gewicht wieder herstellen. Dieses Protein-Metall-Chelat besitzt auch ausgezeichnete antiinflammatorische Wirkung.
Es ist für die Behandlung aller Krankheiten geeignet, an welchen ein inaktiviertes oder aus dem Gleichgewicht geratenes autoimmunes System beteiligt ist und kann allein und zusammen (gleichzeitig oder alternierend) mit für die Behandlung solcher Krankheiten dienenden Medikamenten, beispielsweise Steroiden, wie Cortison, Hydro-cortison, Prednison, Prednisolon, Dexamethason, Fluorcortison, Fluormethalon, Methylprednisolon, Triamoinolon und dessen Acetonid, (3-Methason und deren bekannte Ester und Derivate oder anderen bekannten Stoffen zur Behandlung von Bakterien- und Viren-Infektionen, verwendet werden, wobei diese Medikamente in geringeren Dosen verabreicht werden können und normalerweise vorkommende toxische Wirkungen und sonstige Nebeneffekte verringert werden.
Das erfindungsgemlss herstellbare Protein Metall-Chelat erweist sich auch bei der Behandlung einer grossen Anzahl von Entzündungen geeignet, bei welchen entziindungshemmende Steroide nur beschränkt brauchbar sind, was daraus ersichtlich wird, dass dieses Chelat nach Erzeugung einer durch Antigene induzierten Entzündung nach der Methode von Unger et al., [Arch. Int. Pharmacodynam.
123, 71 (1959)] eine etwa 50%-ige Inhibierung der Entziindung bei Dosen von 0,4 mg/kg bewirkt, wogegen die gleiche Inhibierung erst durch Verabreichung von 25 mg Butazolidin und etwa 15 mg Hydrocortison erreicht werden kann. Sowohl bei der Prüfung als auch bei der Verwendung des erfindungs remiss herstellbaren Protein-Metall-Chelats kann weder eine chronische noch eine akute Toxizität festgestellt werden.
Bei intraperitoneal und/oder intramuskular verabreichten Einzeldosen des Chelats von 60 mg/kg, welche weit iiber der therapeutisch erforderlichen Dosierung liegt, kann in Mäusen, Ratten, Meerschweinchen oder Eseln weder vor der Tötung noch nach augenscheinlicher und mikroskopischer Prüfung der Milz, der Nieren, des Rückenmarks, des Hirns und der Injektionsstellen eine toxische Wirkung festgestellt werden. Die bei Invention körperfremder Proteine auftretende typische Eosinophile bzw. Monocytosis bleibt aus. Bei der Verabreichung von dem Hundertfachen der wirksamen Dosis entsprechenden Dosen an Esel und Meerschweinchen konnten keine chronischen Vergiftungen festgestellt werden.
Das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat ist somit zum grossen Teil frei von den Nachteilen synthetischer Drogen, welche häufig nur sehr spezifisch, stark verzögert und unzureichend wirken.
Das erfindungsgemäss isolierbare Protein-Metall-Chelat wirkt nach Verabreichung stark und rasch. Dies mag darauf zuriick- zufiihren sein, dass es in Anbetracht seiner Chelatstruktur rasch auf die Zellen verteilt wird. Diese Struktur macht dieses Protein-Metall-Chelat hervorragend geeignet zur selektiven Adsorption an und Speicherung in gewissen Zellen, und dies ist unter Umständen ein weiterer Grund für dessen überra- schend hohe Wirkung gegen Viren.
Vorzugsweise hat das erfindungsgemiss erhältliche Protein Metall-Chelat einen Metallgehalt von 0,1-1,0%, wobei zumindest 65% des Metallgehaltes von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist, und ein solches Chelat die gewiinschten pharmakologischen Eigenschaften besitzt.
Dartiber hinaus ist ein ausreichender Metallgehalt des Chelats auch im Hinblick auf dessen Stabilität unbedingt erforderlich.
Die pharmakologisch wirksamsten erfindungsgemlss herstellbaren Protein-Metall-Chelate besitzen einen Metallgehalt von etwa 0,25-0,75 %. Das Ausmass der pharmakologischen Wirkung des Protein-Metall-Chelats scheint zumindest zum Teil von der Anwesenheit eines oder mehrerer physiologisch wesentlicher zweiwertiger Metallionen im Chelat abzuhängen, weshalb in das Chelat vorzugsweise mindestens 75 % insbesondere 85%, der Metalle in Form mindestens eines der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu eingebracht werden.
Bei Herstellung von Protein-Metall-Chelaten höchster Wirksamkeit ist dafür zu sorgen, dass zumindest 40% des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0,65-0,79 , beispielsweise Magnesium, gebildet sind. Solche Metalle können beispielsweise dem Buch von Hall, Chemistry and Physics, 44. Auflage, Seiten 3507-3508 (1962) entnom-.
men werden. In den meisten solchen Chelaten ist eines dieser Metalle auch das vorwiegende Metall, also jenes chelatierende Metall, welches im Protein-Metall-Chelat mit dem höchsten Anteil enthalten ist. Obzwar in den die stirkste Wirkung zeigenden Chelaten der grösste Teil des Metallgehaltes auf physiologisch wesentliche zweiwertige Metalle zurückzuführen ist, enthalten typische Metallchelate auch andere Metalle, welche häufig während der Fraktionierschritte vom Protein, insbesondere dann aus Anlagenteilen aufgenommen werden, wenn in den aufzuarbeitenden Ldsungen die Konzentration der erwiinschten physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen gering ist.
Falls zumindest im letzten Fraktionierschritt in den aufzuarbeitenden Ldsungen eine ausreichend hohe Konzentration an physiologisch wesentlichen zweiwertigen Metallionen aufrecht erhalten wird, gelingt es Protein-Metall Chelate herzustellen, in welchen von den insgesamt vorliegenden chelatisierenden Elementen nur 10% physiologisch unwesentliche Elemente, beispielsweise Al, Si oder B sind.
Da das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ziemlich wärmeempfindlich ist, ist es zweckmässig, mit Ausnahme des kurzzeitigen Erhitzens alle Verfahrensschritte bei einer Temperatur unterhalb SOC durch zuführen. Das zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine vorzunehmende kurzzeitige Erhitzen einer das erwiinschte Protein enthaltenden Lösung erfolgt zweckmässig auf eine Temperatur von mindestens 500C, vorzugsweise auf eine Temperatur von 50-650C bei einer Erhitzungsdauer von 105 min. Hiebei ist zu beachten, dass die Temperatur und die Dauer der Wärmebehandlung einander umgekehrt proportional sind.
Das in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein ist bei Temperaturen oberhalb 75OC nur kurze Zeit beständig. Sofern es nicht möglich ist, wie beispielsweise beim flash-Pasteurisieren, das Erhitzen und das Abkühlen in kiirze- ster Zeit vorzunehmen, soll das Gemisch nicht tiber 750C erhitzt werden. Blosses Erwirmen auf Temperaturen unterhalb 50OC zeitigt wenig zufriedenstellende Ergebnisse, da einige der unerwiinschten wärmelabilen Proteine bei solchen niedrigen Temperaturen noch ziemlich beständig sind.
Das erwiinschte Protein ist bei 55OC 15-30 min und bei 65OC etwa 3-8 min beständig, womit es möglich ist, bei Zerstörung der wärmelabilen Proteine übliche Heiz- und Kiihleinrichtungen zu verwenden.
Da, wie erwähnt, das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein bei einem pH-Wert unter 1,0 bzw. bei einem pH-Wert oberhalb 11,0 instabil ist und in Nähe des isoelektrischen Punktes (pH-Wert = 5,5) nicht so ldslich ist, ist es zweckmässig, bei allen Fraktionisierschritten bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 oder zwischen 6 und 11, vorzugsweise 7-8, zu arbeiten, sofern es nicht bezweckt ist, aus einer Lösung dieses Proteins dieses Protein auszufällen, in welchem Falle der pH-Wert einer dieses Protein enthaltenden Ldsung auf einen Wert zwischen 4 und 6, insbesondere auf etwa 5,5, zu bringen ist.
Da das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein in Form eines Chelats wesentlich stabiler ist, ist es zweckmässig, sämtliche Fraktionierschritte in Anwesenheit eines Ions eines zweiwertigen Metalls mit einem Ioned radius von 0,60-1,0 A durchzuführen. Es ist hiebei zweckmäs- sig, die Konzentration der Lösungen an Ionen zweiwertiger Metalle auf mindestens 1,10-4 m, vorzugsweise 0,005-0,20 m, insbesondere etwa 0,02 m, einzustellen.
Die Ionen zweiwertiger Metalle können hiebei in Form der Sulfate, Chloride oder Acetate der oben angegebenen Metalle, z.B. in Form von Mg (CH3CO0)2, MgS04, MgCk, CaCk oder MnS04, beigestellt werden. Die Anwesenheit von Ionen zweiwertiger Metalle in Lösungen des erfindungsgemäss in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins ist vor allem beim Abtrennen der wirmelabilsten Proteine durch kurzzeitiges Erhitzen einer das erwünschte Protein enthaltenden Ldsung zweckmässig, da, wie erwilhnt, dieses Protein in Form eines Chelats am stabilsten ist und damit während des Erhitzens nur eine geringe Menge des erwiinschten Proteins zerstört wird.
Da der in den einzelnen Fraktionierschritten, beispielsweise selektive Fillungen mittels Salzen oder Lösungsmitteln, erzielbare Trenneffekt stark abhängig ist vom pH-Wert der aufzuarbeitenden Lösungen, ist es zweckmässig, den pH-Wert der aufzuarbeitenden Lösungen durch Zusatz von Puffersubstanzen gegen äussere Einflüsse zu stabilisieren. Zu diesem Zwecke wird am bestend in an Puffersubstanz 0,01- bis 0,20molaren, vorzugsweise mindestens 0,05-molaren, insbesondere 0,1-molaren Lösungen gearbeitet. Als Puffer können hiebei partiell neutralisierte organische oder anorganische Säuren, z.B.
Gemische aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (im folgenden kurz als Tris bezeichnet) einerseits und einer Dicar bonsäure, wie Maleinsiiure oder Bernsteinsäure, Phosphor säure oder einer Aminosäure, z.B. Glycin, anderseits, verwendet werden.
Tm erfindungsgemitssen Verfahren wird zweckmässig die natiirliche Eiweissquelle, beispielsweise tierische Organe bzw.
Gewebe, wie Leber, Niere, Hoden, Pankreas, Placenta, Darmschleimhaut, Thymus, Lunge oder Milz von Kaninchen, Schafen, Rindern, Schweinen oder Menschen, bzw. ein daraus in an sich bekannter Weise durch Behandeln mit organischen Lösungsmitteln, wie Toluol oder Aceton, erhaltenes Trockenpulver mit einer einen pH-Wert von 6-8 aufweisenden und zwei ertige Metallionen mit einem Ionenradius von 0,61,0 , vorzugsweise 0,6-0,8 A, enthaltenden Pufferlösung extrahiert, womit eine Lösung erhalten wird, aus welcher, wie bereits erwähnt, bereits durch Gel-Elektrophorese oder mittels Molekularsieben das erwünschte Protein-Metall-Chelat aufgrund seines Wanderungsverhaltens bei der Gel-Elektrophorese abgetrennt werden kann,
wobei jedoch zwecks Erzielung eines ausreichenden Trenneffektes die Gel-Elektrophorese oder das Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes mehrmals vorzunehmen ist, um schliesslich die einzelnen Fraktionen weit genug auseinanderziehen zu können.
Um jedoch im Rahmen der Gel-Elektrophorese oder im Rahmen des Fraktionierens mittels Molekularsieben nicht zu grosse Substanzmengen aufarbeiten zu miissen, ist es zweck mässig, vor dem Fraktionieren durch Gel-Elektrophorese oder dem Fraktionieren mittels eines Molekularsiebes eine an erwflnschtem Protein angereicherte Fraktion durch fraktioniertes Fillen mittels Salzen, insbesondere Ammonsulfat, und/ oder mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, insbesondere Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Isopropanol und/oder Ethanol,
herzustellen. Naturgemäss ist es im Zuge dieser Fällungen zweckmässig, stets in eine Puffersubstanz und ein Salz eines zweiwertigen Metalls enthaltenden wiisserigen Lösungen zu arbeiten.
Naturgemäss ist aus den hiebei erhaltenen Fraktionen das erwiinschte Protein um so leichter mittels Gel-Elektrophorese oder Molekularsieben abzutrennen, je weitergehender uner wiinschte Begleitstoffe entfernt worden sind, jedoch kann jede der in Frage kommenden Fraktionen im Prinzip durch die Gel Elektrophorese oder mitfels Molekularsieben aufgearbeitet werden.
Eine Mdglichkeit zu einer an erwünschtem Protein angereicherten Fraktion zu kommen, besteht darin, dass die durch Extraktion der Eiweissquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers erhaltene wässerige Lösung zwecks Ausfillens von weniger als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffen zu 40-45 % mit Ammonsulfat gesättigt oder mit etwa 1,5 Vol.-Teilen Aceton oder Ethanol versetzt wind, wobei zwecks Ausfillens allenfalls vorhandener Pigmente vor oder nach dem Fillen der weniger löslichen Stoffe die jweils vorliegende Lösung mit, vorzugsweise 10% ihres Volumens, eines heterocyclischen Amins, z.B.
Pyridin oder Piperidin, oder mit etwa 15% ihres Volumens eines Gemisches aus ethanol und Chloroform (etwa 2:1) versetzt wird. Hiebei kann zwecks Abtrennens der wirmelabilen Proteine die erhaltene Lösung rasch, z.B. unter kriiftigem Rühren, auf 590C erhitzt, etwa 15 min auf dieser Temperatur gehalten und dann rasch, z.B.
mittels einer Kiltemischung, auf etwa 30C abgekühlt werden, wobei vor oder nach dem Abtrennen der wirmelabilen Proteine ein das erwflnschte Protein enthaltender Niederschlag dadurch hergestellt werden kann, dass die erhaltene Lösung entweder zu 58-76% mit Ammonsulfat gesättigt oder mit der zwei- bis vier-fachen Menge der zum Fallen der weniger löslichen Proteine erforderlichen Menge an Lösungs- mittel (vorzugsweise Aceton oder Athanol) versetzt wird. Der das erwiinschte Protein enthaltende Niederschlag wird zwecks Weiterverarbeitung zweckmässig in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelds.
Eine weitere Möglichkeit zu einer an erwunschtem Protein angereicherten Fraktion zu gelangen, besteht darin, dass die durch Extraktion der Eiweissquelle bzw. des hieraus erhaltenen Trockenpulvers erhaltene wiisserige Lösung zwecks Abtrennens von leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein loslichen Stoffen mit dem gleichen Volumen an kaltem Aceton versetzt und der erhaltene Niederschlag in ein zweiwertiges Metallion, vorzugsweise Mn++, enthaltendem Puffer (pH-Wert etwa 7,6) gelöst wird.
Im Anschluss daran kann so vorgegangen werden, dass zwecks Abtrennens der wirmelabilen Proteine die erhaltene Lösung rasch auf 60OC erhitzt, bis etwa 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten und dann rasch auf 50C abgekühlt wird, worauf aus der erhaltenen Lösung eine das erwiinschte Protein enthaltende Fraktion durch Zusetzen von etwa 0,9 Vol-Teilen Ethanol ausgefüllt wird und sodann der erhaltene Niederschlag in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer gelöst wird.
Schliesslich kann die erhaltene Lösung zwecks Abtrennens der leichter als das in Form eines Chelats zu isolierende Protein löslichen Stoffe einer fraktionierten Fillung mit Ammoniumsulfat unterworfen werden, wobei die bei einer 60-75 % der Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats betragenden Konzentration am Ammonsulfat anfallenden Niederschläge in einem ein zweiwertiges Metallion enthaltenden Puffer suspendiert werden und aus der erhaltenen Suspension Unlösliches entfernt wird.
Die so erhaltene Lösung des erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins, insbesondere die von den wirmelabilen Proteinen, den leichter löslichen und den schwerer l5slichen Stoffen befreiten Lösungen, können der Feinreinigung durch Gegenstromextraktion, Gel-Elektrophorese oder Chromatographieren, z.B. Papierchromatographie, Diinnschichtchromatographie oder Chromatographieren in mit Ionenaustauschharzen oder Gelen wie Silikagel oder vernetztes Detran (Molekülsieb) gefiillten Kolonnen, unterworfen werden.
Bei der Feinreinigung geniigt es im allgemeinen, eine Absorptionsbande bei 280 mm zeigenden Fraktionen aufzufangen, da nur solche Fraktionen das erfindungsgemiiss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein enthalten.
Bei dieser Feinreinigung wird das erfindungsgemäss in Form eines Metall-Chelats zu isolierende Protein von allenfalls vorhandenen Resten an Albuminen oder y-Globulinen abgetrennt; insbesondere das weitgehende Abtrennen der Albu mine vom erfindungsgemlss zu isolierenden Protein ist wesentlich, da die Albumine die pharmakologische Wirksamkeit des erfindungsgemliss in Form eines Metall-Chelats zu isolierenden Proteins wesentlich starker beeintrÅachtigen als y-Globuline.
Da voraussetzungsgemäss ein 0,1-1,0% Metalle aufweisendes Chelat zu isolieren ist, in welchem zumindest 65% des Metallgehalts von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu gebildet ist, ist es zweckmässig, zumindest im letzten Fraktionierschritt in Anwesenheit eines zweiwertigen Metallions mit einem Ionenradius von 0,60-0,79 A insbesondere in Anwesenheit von Magnesiumionen zu arbeiten oder erhaltenes Protein-Metall-Chelat erforderlichenfalls zu einem Chelat zu transchelatieren, in welchem zumindest 40% des Metallgehaltes von einem zweiwertigen Metall mit einem Ionenradius von 0,65-0,79 A, insbesondere Magnesium, gebildet sind.
Da die im letaten Fraktionierschritt anfallenden Losungen des erwflnschten Protein-Metall-Chelats noch ziemliche Mengen an Puffersubstanz und Salzen zweiwertiger Metalle gelds enthalten, ist es zweckmässig, aus diesen LÏsungen die Puffersubstanz und die Salze zweiwertiger Metalle durch Dialyse zu entfernen, wobei zweckmlssig zuerst durch Dialyse gegen eine etwa 0,001 molare Lösung eines Salzes eines zweiwertigen Metalls, insbesondere Mg, in entsalztem Wasser die Konzentration der Lösung an Puffersubstanz auf weniger als 10-6 m gebracht wird und dann durch Dialyse gegen entsalztes Wasser die Konzentration der Lösung an dem Salz eines zweiwertigen Metalls auf weniger als 10-7 gebracht wird.
Da das erfindungsgemlss herstellbare Protein-Metall-Chelat im trockenen Zustand und bei tiefer Temperatur gelagert am bestiindigsten ist, ist es das Protein-Metall-Chelat enthaltende Lösungen, insbesondere erhaltene Lösungen des reinen Chelats, gefrierzutrocknen.
Beispiel 1
1 kg frischer, vom Bindegewebe befreiter Ochsenleber wurde in fiinf oder sechs Stiicke zerteilt, anschliessend mit Leitungswasser gespfflt und zerkleinert. Kleinere Mengen der zerkleinerten Ochsenleber (200 g) wurden in einem Schneidmischer mit 200 ml kalter isoosmotischer KCl-Lösung innerhalb 20 sec homogenisiert, worauf unmittelbar anschliessend im Mischer das Homogenisat innerhalb 20 sec bei -10oC mit 200 ml Aceton vermischt wurde. Das mit Aceton behandelte Homogenisat wurde sodann unter Riihren in ein 2,5 l auf - 10oC gekiihlten Acetons enthaltendes 10 l-Becherglas gegossen.
Sobald der letzte Anteil der zerkleinerten Ochsenleber in der angegebenen Weise behandelt worden war, wurde der Inhalt des Becherglases mit kaltem Aceton auf 10 1 aufgefiillt und durchgemischt. Die Temperatur wurde anschliessend einige Minuten auf 4OC gehalten. Die klare iiberstehende Fliissigkeit wurde nun abdekantiert, worauf der Inhalt des Becherglases mit Aceton auf 10 1 aufgefiillt wurde. Nach dem Abgiessen der klaren iiberstehenden Flüssigkeit wurde die Suspension rasch auf einem Buchner-Trichter filtriert, welcher oben abgedeckt ist, um den Zutritt von Luft so weitgehend als möglich auszuschalten.
Noch bevor der am Trichter befindliche Filterkuchen völlig trocken war, wurde mit 2 1 kaltem Aceton gewaschen. Das Waschen wurde solange fortgesetzt, bis die Teilchen vollständig trocken waren. Der Filterriickstand wurde zerkleinert, auf einem Filterpapier ausgebreitet und unter Stickstoff getrocknet. Das erhaltene Pulver wird noch kalt fein gemahlen und bei 4OC im Vakuum gelagert. Die Ausbeute an pulverförmigem Material betrug etwa 52 g.
100 g des in der oben angegebenen Weise hergestellten trockenen Pulvers wurden einem Liter 1,0 m Tris-Maleat Puffer eingerührt, worauf dem erhaltenen Gemisch nach Ablauf einiger Minuten 6,5 g MgS04.7 H20 in Anteilen zugegeben und der pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt wurde.
Anschliessend wurden weitere 600 ml Tris-Maleat-Puffer und weitere 6,5 g MgS04. 7 H20 zugegeben, worauf der pH-Wert erneut auf 7,4 eingestellt wurde. Nun wurden weitere 400 ml Wasser zugesetzt, worauf in einem kalten Raum weitergerührt wurde bis, gerechnet vom Arbeitsbeginn, 6 Stunden verstrichen waren. Die Mischung wurde sodann absitzen gelassen, worauf filtriert und zentrifugiert wurde. Der pH-Wert des Filtrates wurde auf 7,8 eingestellt, worauf das Filtrat in der Kilte stehengelassen wurde, bis die Abscheidung vollstindig war. Die überstehende Fltissigkeit wurde nach dem Abzentrifugieren filtriert. Zwecks Lagerung wurde das Filtrat gefriergetrocknet.
100 g des durch Extraktion des Trockenpulvers erhaltenen Pulvers wurden unter Rflhren in 400 ml kaltem, 0, im Tris Maleat-Mg++ -Puffer bei pH 7,2 suspendiert, worauf in einem kalten Raum bis zum Absetzen des Niederschlages stehengelassen, bei 1-20C zentrifugiert und schliesslich abdekantiert wurde. Zwecks Abtrennung der Pigmente wurde die abdekantierte Fliissigkeit in 5 gleiche Teile geteilt und jeder Teil unter Riihren langsam mit 8 ml gekühltem Pyridin (chemisch rein) versetzt, worauf noch jedem Teil 40 ml 0,1 m Tris-Maleat Mg++-Puffer zugesetzt wurden. Die erhaltenen Gemische,wur- den sodann bei einer Temperatur von 1-2 C während 15 min bei 13 000 U/min zentrifugiert.
Die überstehenden klaren Fliissigkeiten wurden abdekantiert und miteinander vereinigt, wogegen der Niederschlag verworfen wurde.
Die von Pigmenten befreite kalte Lösung von Proteinen in Tris-Maleat-Mg++-Puffer wurde auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und sodann mit Ammonsulfat zu 40-45 % gesättigt, in dem das Ammoniumsulfat unter Riihren in Anteilen in Form einer gesättigten wiisserigen Lösung zugegeben wurde und die Temperatur des Gemisches auf 0-5 C gehalten wurde.
Das erhaltene Gemisch wurde in der Kälte 30 min stehen gelassen, urn den entstandenen Niederschlag vollständig absetzen zu lassen. Der entstandene Niederschlag, welcher die weniger als das erfindungsgemiiss zu isolierende Protein lös- lichen Stoffe enthlilt, wurde bei 12 000 U/min abzentrifugiert und verworfen.
Um aus der erhaltenen Ldsung die wirmelabilen Proteine auszufällen, wurde die Lösung in einen 1 Liter-Rundkolben iibergefiihrt und darin mittels eines auf 6570OC gehaltenen Wasserbades unter kriiftigem Rflhren auf 59OC erhitzt, 5 min auf dieser Temperatur gehalten und unmittelbar anschliessend durch Eintauchen des Rundkolbens in ein Gemisch aus Trokkeneis und Aceton rasch auf eine Temperatur von 2-30C gekühlt. Der hiebei entstandene flockige Niederschlag wurde in der Kälte abzentrifugiert und sodann verworfen.
Die von den wärmelabilen Proteinen befreite Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, dann zu 76% mit Ammonsulfat gesättigt und dann bis zur vollstiindigen Ausfiil- lung 2 Stunden kalt gestellt. Der hiebei entstandene, nahezu weisse Niederschlag wurde im 10-15-fachen seines Gewichts an 0,10 m Tris-Maleat-Mg++-Puffer aufgenommen und l/2 Stunde kalt stehengelassen, worauf ein allenfalls verbliebener Rflckstand abzentrifugiert und verworfen wurde.
Die nunmehr vorliegende L5sung des erfindungsgemäss in Form eines Chelats zu isolierenden Proteins (befreit vom Hauptteil der leichter löslichen und der schwerer lichen Stoffe) wurde nun einer Feinreinigung durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung von quervernetztem Polyacrylamid als Gel unterworfen.
Hiebei wurde ein fit.r Produktionszwecke entwickeltes Geriit verwendet, in welchem ein 32 cm langer, 10 cm breiter und 1 cm starker Block aus einem 5-7 Gew.-% quervernetztes Polyacrylamid enthaltendem Gel in der Elektrophoresekammer untergebracht war, die ihrerseits mit den Seitenfllchen grösster Abmessungen vertikal angeordnet war und im Bereiche dieser Seitenflächen mittels eines laufend umgewiilzten und gekühlten Gemisches aus Athylenglykol und Wasser gekehlt werden konnte, so dass es möglich war, bei einer Spannung von 600-1000 V und mit einer Stromstärke von 200-500 mA zu arbeiten.
Der Gel-Block wurde in der Elektrophorese-Kammer dieses Gerätes durch Polymerisieren eines im Vakuum entgasten und blasenfrei in die Elektrophorese-Kammer eingebrachten Gemisches aus wässerigen Lösun- gen von Acrylamid, N,N'-Methylenbisacrylamid und Hilfsstoffen hergestellt, wobei folgende Lösungen verwendet wurden: a) lnHCI 480 ml
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 363 g
Tetramethyläthylendiamin 4,6 ml
H20 auf 1000 ml b) Acrylamid 280 g
N,N/-Methylenbisacrylamid 7,36 g
H20 auf 1000 ml c) Ammoniumpersulfat 1,00 g
H20 1000 ml
Das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Gemisch bestand aus einem Volumteil eines Gemisches aus 1 Vol-tl der Lösung a), 2 Vol.-tln der Lösung b) und 1 Vol.-tl Wasser einerseits und 1 Vol.-tl der Lösung c) anderseits.
Mit diesem Gemisch wurde die Elektrophorese-Kammer bis 16 mm unterhalb ihres oberen Randes gefflllt, worauf das Gel in der Elektrophorese-Kammer mit einer 0,001%igen wässerigen Ldsung von als Markierungsfarbe dienendem Bromphenolblau vorsichtig überschichtet wurde und nach abgeschlossener Polymerisation der Überschuss an wässeriger Lösung des Bromphenolbiaues sorgfältig entfernt wurde. Nun wurde die in der oben angegebenen Weise hergestellte wässerige Lösung des erfin dungsgemäss zu isolierenden Proteins in 0,10 m Tris-Maleat Mg++-Puffer mit einem zu einem Gel polymerisierbaren Gemisch vermischt und das erhaltene Gemisch auf das in der Elektrophorese-Kammer befindliche Gel aufgebracht und dort unter Lichteinwirkung auspolymerisiert.
Das zu einem Gel polymerisierbare Gemisch wurde unter Verwendung folgender Lösungen hergestellt: d) 1n H3PO4 256 ml
Tris-(hydroxymethyl)- aminomethan 57 g H20 auf 100 ml (pH 6,9) e) Acrylamid 100 g N,N/-Methylenbisacrylamid 25 g H20 auf 1000 ml c) Ammoniumpersulfat 1,00 g
H20 1000 ml
Hiebei wurde 1 Vol.-tl eines aus 1 Vol.-tl der Lösung d), 2 Vol.-tln der Ldsung e) und 1 Vol.-tl Wasser hergestelltes Gemisch mit einem Vol.-tl der Lösung c) vermischt.
Nach dem das in die Elektrophorese-Kammer eingebrachte Proben-Gel auspolymerisiert war, wurde die Elektrophorese-Kammer in den Pufferbehilter eingebracht, welcher mit einer aus 60 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 288 g Glycin und der fiir 20 Liter erforderlichen Menge an Wasser hergestellten und auf einen pH-Wert von 8,45 eingestellten Pufferlösung gefdllt war, und unter Kiihlen die Elektrophorese bei 5 C und einer Stromstiirke von 200 mA durchgefflhrt, bis nach 3 Stunden die Markierungsfarbe das Gel nahezu zur Gänze durchquert hatte.
Zu diesem Zeitpunkt befand sich das erfindungs gemäss zu isolierende Protein-Metall-Chelat in einem Bereich, welcher etwa um 30% des von der Markierungsfarbe zurtick- gelegten Wanderungsweges vom Ursprungspurkt entfernt war.
Das erfindungsgemäss zu isolierende Protein-Metall-Chelat war gut getrennt von den beträchtlich rascher wandernden
Albuminen und ebenfalls gut getrennt von den wesentlich langsamer wandernden y-Globulinen. Nach abgeschlossener Elektrophorese wurde das erwünschte Protein-Metall-Chelat aus dem Gel mittels eines Querstromes an 0,1 m Tris-Maleat Puffer, welcher an Mg++ 0,001 molar war, ausgewaschen, wobei das Fortschreiten des Isolierens durch Bestimmung der UV-Absorption bei 280 mm verfolgt wurde. Die Einheitlichkeit des so erhaltenen Protein-Metall-Chelats wurde durch analytisch durchgefiihrte Gelscheiben-Elektrophorese noch überprüft.
Aus dem erhaltenen Eluat wurde das zu isolierende Protein Metall-Chelat dadurch gewonnen, dass dieses Eluat zunächst erschöpfend gegen 0,001 m Tris-Maleat-Mg++-Puffer und dann gegen entsalztes Wasser dialysiert und dann das erhaltene Dialysat gefriergetrocknet wurde Hiebei wurde ein weisses, flaumiges Pulver in einer Menge erhalten, die etwa 16% des durch Ammoniumsulfat ausgefällten Produktes ausmachte.
Die Ausbeute an Protein-Metall-Chelat betrug, bezogen auf Trockengewicht der eingesetzten Ochsenleber, 0,02 %.
Beispiel 2
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden alle Arbeits grange in einem kalten Raum (2-50C) vorgenommen.
Frische Rinderleber wurde vermahlen und in einen Kunst stoffbehilter eingefullt, worauf kaltes destilliertes Wasser in einer Menge von 2 1 pro kg Leber unter Riihren zugegeben und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches mit 0, in-NaOH auf 7,5-7,6 eingestellt wurde. Dem Gemisch wurde nun so viel an 2m-MnSO4-Lösung zugegeben, dass das Gemisch an Mangan 0,05 molar wurde. Der pH-Wert wurde sodann auf 7,6 eingestellt, worauf so viel frisches kaltes Wasser zugegeben wurde, dass auf 1 kg Leber insgesamt 3 1 Wasser kamen. Nun wurden pro kg Leber 50 ml Toluol zugesetzt, worauf die Mischung iiber Nacht im kühlgehaltenen Raum gerührt wurde.
Am darauffolgenden Morgen wurde die Suspension durch Gaze aus Kunststoffäden filtriert, worauf das Filtrat mit dem 1l/2-fachen Volumen an kaltem Aceton (-10oC) unter gelindem Riihren versetzt wurde. Die Zugabe des Acetons erfolgte iiber ein Glasrohr, welches weit genug unter die Oberfläche des Gemisches ragte. Der entstandene Niederschlag wurde numittelbar darauf durch Abzentrifugieren isoliert und sogleich in etwa 25 Vol.-% an 0,05 m Maleat-Mn++-Puffer, bezogen auf das Volumen des Filtrats vor Zugabe des Acetons, suspendiert. Die Mischung wurde in der Kiilte mehrere Stunden gerdhrt, iiber Gaze aus Kunststoffäden filtriert und durch Zentrifugieren gehilirt.
Die erhaltene nberstehende Fliissigkeit wurde in einem Kessel aus rostfreiem Stahl unter Rühren rasch auf 60OC erhitzt und bis 20 min nach Beginn des Erhitzens auf dieser Temperatur gehalten. Die Mischung wurde sodann so rasch als möglich auf 5 C gekühlt, worauf der entstandene volumindse Niederschlag im kalten Raum durch langsames Absaugen tiber eine grosse Filterfläche abfiltriert wurde.
Die Temperatur des klaren Filtrats wurde auf 2-5oC gebracht, worauf 0,9 Vol.-tle denaturiertes ethanol (-10oC) mittels eines Tropftrichters tiber ein sich bis weit unter die Oberfläche des Gemisches erstreckendes Glasrohr unter starkem Riihren und bei einer Temperatur von höchstens 5 C zugegeben wurden. Nach voll stindiger Zugabe des Alkohols wurde das Gemisch gerade so lange in einem kalten Raum verwahrt, bis sich der Niederschlag zusammengeballt und abgesetzt hatte. Der Niederschlag wurde durch Absaugen mit niedrigem Unterdruck isoliert und unmittelbar anschliessend in kaltem 0,001 m Maleat-Mn++ Puffer von pH 7,0 gelöst. Die Menge an verwendetem Puffer betrug etwa 4 ml/g Niederschlag.
Die Ldsung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die iiberstehende Flüssigkeit abgetrennt und der Niederschlag mit kleinen Mengen kalter Pufferlösung mehrmals extrahiert wurde. Die iiberstehenden Fliissigkeiten werden miteinander vereinigt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver stellte ein Gemisch aus erwflnschtem Protein, Arginase und anderen Enzymen, Albumin und anderen, unwesentlichen Proteinen dar.
Zwecks weiterer Aufarbeitung wurde das so erhaltene Pulver im 12-fachen seines Schiittvolumens an kaltem 0,2 m Tris Puffer gelöst, welcher an Mg++ 0,001 molar war und einen pH-Wert von 7,8 besass. Die so erhaltene Ldsung wurde mit kalter gesättigter Ammonsulfatlösung behandelt, welche ebenfalls an Mg++ 0,001 molar war. Pro 1000 ml Pufferlösung wurden hievon Anteile zu je 375 ml gegeben, wobei die Puf ferlösung jeweils zu 15, 30, 45, 60 und 75% an Ammonsulfat gesättigt wurde. In jedem Falle erfolgte die Zugabe der Ammonsulfatlösung tropfenweise bei 0-5oC und unter Riih- ren.
Es wurde weitere 10 Minuten gerührt, worauf der entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren bei 4500 U/min wäh- rend 30 min bei 0OC abgetrennt wird. Von den 5 erhaltenen Fillungen wurde die erste (A), welche die unerwiinschten Proteine hohen Molekulargewichts enthält, verworfen. Die zweite und die dritte Fillung (B und C) wurden vereinigt und enthalten Arginase und andere Enzyme (welche erwiinschten- falls isoliert werden konnen). Auch die vierte und die fünfte Flung (D und E), welche das mit Albumin und verschiedenen anderen Proteinen niedrigeren und höheren Molekulargewichts verunreinigte erwünschte Protein enthalten, wurden miteinander vereinigt.
Die zuletzt vorliegende iiberstehende Flissigkeit, welche Proteine niedrigen Molekulargewichts und weitere unerwiinschte Verunreinigungen enthilt, wurde verworfen. Die Fillungen D und E wurden in 0,03 m Tris-Mg++ Puffer, welcher an Mg++ 0,001 molar ist und einen pH-Wert von 7,8 besass, in einer Menge gelds, dass eine möglichst genau 10 %ige Lösung erhalten wurde. Die so erhaltene Lösung wurde gegen kalten Puffer dialysiert, bis die Reaktion auf Sulfationen negativ war. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die iiberstehende Flüssig- keit durch ein Milliporo -Filter filtriert wurde.
Das erhaltene Filtrat wurde direkt auf den Kopf einer Chromatographier säule (76 x 456 mm) aufgegeben, welche mit Sephadex C-100 (Pharmacia, Schweden) gefüllt war. Das Sephadex wurde nach den Vorschriften des Herstellers gequollen, auf einen definierten Zustand gebracht und gewaschen. Die so vorbereitete Kolonne wurde mit 0,03 m Tris-(0,001 m Mg++)-Puffer von pH 7,8 ins Gleichgewicht gebracht und auf eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Stunde eingestellt. Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgegeben worden war, wurde sie innerhalb 30-45 min mit den ersten 3 cm des Kunstharzbettes ins Gleichgewicht gebracht, worauf mit dem Fraktionieren begonnen wurde. Es wurden Einzelfraktionen zu je 10 ml aufgefangen. Das Auftreten der Scheitel wird durch Bestimmung der Proteinkonzentration mittels der Absorption bei 280 mm erkannt.
Vor dem Auftreten des erwiinschten Proteins ergaben sich zwei Scheitelwerte, die auf Albumin und andere unerwünschte Proteine ähnlichen oder höheren Molekulargewichts zuriickzufiihren sind. Diese Scheitelwerte zeigenden Fraktionen wurden verworfen. Das erwünschte Protein fand sich in jener Fraktion des gesamten Eluats, welche die cm3 von 130-170 umfassen. Diese Fraktionen wurden zwecks weiterer Aufarbeitung vereinigt. Beim weiteren Eluieren der Kolonne, insbesondere beim Erhöhen der Ionenkonzentration des Puffers, flossen aus der Kolonne restliche Proteine niedrigen Molekulargewichts enthaltende Eluate ab. Die Proteine niedrigen Molekulargewichts wurden aus der Kolonne entfernt, um diese für die nächste Charge zu reinigen.
Die das erwflnschte Protein enthaltenden, miteinander vereinigten Fraktionen werden gegen eine 0,001 molare Lösung von Mg++ in entsalztem Wasser dialysiert, bis sie weniger als 10-7 verringert worden war. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugieren geklärt, worauf die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet wurde.
75 kg frische Rinderleber, wetche 70% Wasser enthilt und 22,5 kg Trockensubstanz lieferte, ergab eine Ausbeute von etwa 200 g (1%) des das Mn++-Chelat enthaltenden Zwischenproduktes. 200 g dieses Zwischenproduktes lieferten 17,5 g (0,08 %) Feststoffe in Form der Fraktionen D und E.
Beim Chromatographieren fiber Sephadex wurden aus den Fraktionen D und E 2,9 g des erwünschten Protein-Metall Chelats erhalten, was, bezogen aufs Trockengewicht der Leber, einer Ausbeute von 0,014% entsprach.
Bei intradermaler Verabreichung oder bei Verabreichung auf anderem Wege an versensibilisierte Meerschweinchen erzeugt das erfindungsgemiiss isolierbare Protein-Metall Chelat keine Antigene. Entsprechende Versuche bei Verwendung von Freund's-Adjuvans in Kaninchen konnte die Bildung von Antikörpern nicht festgestellt werden, womit erwiesen erscheint, dass die antigenetische Wirkung des Protein-Metall Chelats höchstens extrem niedriger Grössenordnung ist, so dass dieses Chelat lange Zeitriiume an Siiugetiere verabreicht werden kann, ohne Störungen erwarten zu miissen.
An Kaninchen wurden innerhalb 29 Tagen auf 6 Einzeldosen verteilt insgesamt 30 mg/kg des Protein-Metall-Chelats zusammen mit Freund's Adjuvans und Alaunfiillung verabreicht. Nach Ablauf der Immunisierungsperiode wurde das Serum-(y-Globulin) der Tiere durch Aussalzen konzentriert und anschliessend gefriergetrocknet. Ouchterlony-Platten und Immun-Elektrophorese unter Verwendung dieser konzentrierten y-Globulin-Fraktion gegen das erfindungsgemiss isolierbare Protein lieferten keinerlei Fillungslinien.
Obzwar gesunde Tiere immunologisch nicht ansprechen, sprechen Schwerkranke, deren autoimmunes System praktisch inaktiv ist oder aus dem Gleichgewicht geraten ist, gelegentlich immunologisch an, wodurch sich allerdings die Verwendung des Protein-Metall-Chelats nicht verbietet. Ganz ha Gegenteil ist darin eine begriissenswerte Erscheinung zu sehen, welche darauf hindeutet, dass sich das autoimmune System des Patienten reaktiviert hat, was eine lebenswichtige Vorstufe vor der völligen Genesung des Patienten darstellt.
Das erfindungsgemäss herstellbare Protein-Metall-Chelat wird in der Regel auf dem Injektionswege, beispielsweise intravends oder subkutan, vorzugsweise jedoch intramuskulir verabreicht. Die an Menschen zu verabreichenden Einzeldosen liegen in der Regel zwischen etwa 0,05-1,0 mg. An Pferde werden in der Regel etwa 0,4-5,Omg intramuskulir verabreicht. Die Dosis ist nicht kritisch. Die Anfangsdosen sind in der Regel grosser zu wählen als die fir die anschliessende Therapie. Bei der Bekimpfung von Viruserkrankungen wird das Protein-Metall-Chelat in der Regel in Einzeldosen von 0,2-4,0 mg intramuskulir verabreicht.
Im Gegensatz zur Behandlung chronischer Krankheiten empfiehlt sich bei der Bekiimpfung von Viruserkrankungen die Verabreichung in schneller aufeinanderfolgenden Dosen, beispielsweise in Form von zwei Injektionen pro Tag während mehrerer Tage. Die Behandlungsdauer und die Häufigkeit der Verabreichung hängen von der Reaktion ab, welche hiiufig einer dramatischen Besserung entspricht. In der Regel betriigt die Behandlungsdauer drei bis acht Tage. Im Falle eines Rückfalles sind erneute Injektionen von gleichem Erfolg.
Orale Verabreichung des Protein-Metall-Chelats ist m5g- lich, sofern es vor einer Zerstörung ha sauren Milieu des Verdauungssystems und dessen Enzymen, beispielsweise in Form beschichteter Tabletten, geschützt ist. Bei diesem Verabreichungsweg sind allerdings wesentlich grössere Dosen erforderlich. Qberraschenderweise ist das Protein-Metall-Chelat auch lokal verabreicht wirksam, weshalb es beispielsweise in Form einer Lösung in physiologischer Kochsalzliisung oder einer Pufferlösung und in Form von Cremen, Salben usw. verabreicht werden und zur Behandlung von Erkrankungen der Cornea und von Conjunctiva, der Atmungswege, der Genitalien, des Harnweges und der Haut verwendet werden kann.
Durch lokale Verabreichung ist es beispielsweise möglich, Akne, Irritationen, Abschiirfungen, Brandwunden, Abszesse, Psoriasis usw. zu behandeln. In diesem Falle wird das Protein Metall-Chelat zweckmässig gemeinsam mit einem Netzzittel und/oder einem Penetrationsmittel verabreicht.
In the course of investigations concerning the composition of protein-containing natural substances, it was found that most of these protein-containing natural substances
Gel slice electrophoresis both at a pH of
9.4 as well as at a pH value of 3.8 in the form of closely spaced bands slower than albumin but more rapidly than γ-globulin migrating protein in very small amounts depending on the season and diet (in animals) and that this protein, chelated with ions of certain bivalent metals, has an excellent anti-inflammatory effect.
The aim of the present invention was to obtain this protein metal chelate in the purest possible form from natural
Isolate protein sources.
The present invention therefore relates to a method for producing protein-metal chelates, which is characterized in that a protein from a natural protein source is brought together with divalent metal ions in an aqueous medium and the protein-metal chelate obtained is isolated from the reaction medium .
Preferred protein-metal chelates to be produced by the process according to the invention are those in which at least 65% by weight of the metal content consists of the metals magnesium, calcium, iron, zinc, cobalt and / or copper, the corresponding protein-magnesium Chelates are especially preferred. These preferred protein metal chelates can be produced either by direct chelation using the corresponding metal ions or by re-chelation of other metal chelates produced as an intermediate product.
Two particularly preferred working processes for the production of these preferred protein-metal chelates by the process according to the invention are carried out as follows:
One of the two preferred working processes for the production of a water-soluble protein-metal chelate, in which this has a metal content of 0.1-1.0% and at least 65% by weight of this metal content from the metals magnesium, calcium, iron, zinc, Cobalt and / or copper and the protein-metal chelate has anti-inflammatory properties and, in gel disk electrophoresis, both at a pH of 9.4 and at a pH of 3.8 in the form of two or three bands migrates slower than albumin but faster than globulin,
is carried out in such a way that a protein from a natural protein source is brought together in an aqueous system with divalent ions of the metals magnesium, calcium, iron, zinc, cobalt and / or copper, with the protein-metal chelate forming and subjecting this to fractionation steps , and briefly heating to a temperature of up to about 75 ° C. in order to separate fluid-labile proteins and finally isolate the desired protein-metal chelate from the reaction medium.
The other preferred working method is that mentioned above, in which a transcheling is carried out while the method is being carried out. In this case it is expedient to work in such a way that a protein from a natural protein source is brought together in an aqueous system with divalent metal ions which, however, are not magnesium, calcium, iron, zinc, cobalt and / or copper ions , the solution containing the protein-metal chelate is subjected to fractionation steps and brief heating to a temperature of up to 75 C for the purpose of separating fluid-labile proteins,
and then the protein-metal chelate is converted into a metal chelate of these metals by reaction with ions of the metals magnesium, calcium, iron, zinc, cobalt and / or copper, this material being isolated, a protein-metal chelate with a metal content of 0.1-1.0%, in which at least 65% of the total metal content of the metals magnesium, calcium, iron, zinc,
Cobalt or copper.
It is particularly advantageous if the protein from a natural protein source is combined with an aqueous system which contains manganese ions and the protein-manganese chelate obtained as an intermediate product by reaction with the appropriate
Converts metal ions into the protein-metal chelate, in which at least 65% of the total metal content is formed by the metals magnesium, calcium, iron, zinc, cobalt or copper.
As already mentioned, a preferred protein-metal chelate produced by the process according to the invention is the corresponding protein-magnesium chelate. This can be obtained, for example, by forming a protein-magnesium chelate by direct reaction with magnesium ions or by carving with magnesium ions, which, if it is produced by carving a protein-manganese chelate obtained as an intermediate product, has a manganese content that makes up less than 10% by weight of the total metal content of the protein-metal chelate.
The protein which is subjected to the method according to the invention and which belongs to the globulins can be prepared using working methods known per se (cf.
Ullmann's Enzyklopadie der Technischen Chemie, 3rd edition, volume 14, pages 409-412) can be isolated from a wide variety of natural protein sources.
When performing the method according to the invention, care should be taken to ensure that the desired protein metal chelate is obtained in as pure a form as possible. It is therefore advisable to select that fraction in the course of each process step and to subject it to further treatment which contains the protein-metal chelate that is found in gel disk electrophoresis both at a pH of 9.4 and at a pH of 3.8 in the form of closely spaced bands (usually 2 or 3 depending on the resolution) migrates more slowly than albumin but faster than y-globulin. This substance should be obtained as the end product in as pure a form as possible.
When carrying out the process according to the invention, the desired protein-metal chelate can be obtained by extracting a natural protein source with a buffer containing divalent metal ions, preferably manganese ions, and subjecting the solution obtained to either gel disk electrophoresis, both at a pH Value of 9.4 as well as at a pH value of 3.8, which isolates material that migrates more slowly than albumin but faster than γ-globulin in the form of bands that are close together, or by chromatography over a molecular sieve,
the desired protein-metal chelate is preserved in such a purity that its anti-inflammatory effects are only present in small quantities. However, it appears advisable to feed a protein fraction over a molecular sieve to gel electrophoresis or chromatography, which in a manner known per se, for example by fractionated filling with salts and / or solvents, frees the main amount of the protein accompanying the protein to be isolated according to the invention in order to keep the amount of substance to be worked up in gel electrophoresis or in chromatography as low as possible and thus to be able to achieve a sharper resolution of the bands (fractions).
However, in order to isolate the protein-metal chelate which migrates at a typical rate relative to other proteins in gel-disk electrophoresis, it is not absolutely necessary to carry out gel electrophoresis or to chromatograph it, but it is also possible, albeit in a less advantageous manner, to other folding steps known per se for the fractionation of proteins are strung together, whereby it is only necessary to look for new combinations of per se known methods or
When looking for new ways the content of the fractions obtained in the gel disk electrophoresis both at a pH value of 9.4 and at a pH value of 3.8 in the form of closely spaced bands slower than albumin, but faster as y to check globulin-migrating protein-metal chelate by gel-disk electrophoresis; as soon as any combination of fractionation steps has been identified as useful by means of the orientation aid gel slice electrophoresis, this combination of fractionation steps can be routinely repeated without further control by gel slice electrophoresis, always assuming the same protein source.
Taking advantage of this knowledge, the process according to the invention for the production of a new water-soluble protein-metal chelate with anti-inflammatory properties, which in gel disk electrophoresis both at a pH of 9.4 and at a pH of 3.8 in the form of two or three bands, it migrates slower than albumin but faster than γ-globulin, characterized in that it consists of a water containing this protein in the form of a metal chelate and by extracting a natural protein source with a divalent metal ion or with a divalent metal ion and a solution of water-soluble proteins obtained from a buffer containing water in the course of a number of arbitrarily strung together fractionation steps,
individual fractionation steps of the same type may be carried out several times, including brief heating of a solution containing the desired protein to a temperature of up to about 75 C for the purpose of separating the most heat-labile proteins, isolated in the form of a 0.1-1.0% metal-containing chelate, in which at least 65% of the metal content is formed by at least one of Mg, Ca, Fe, Zn, Co and Cu.
Each specific embodiment of the method according to the invention determined using the orientation aid gel slice electrophoresis inevitably differs from every other known method for isolating uniform proteins from protein mixtures, nevertheless in principle when isolating uniform proteins from protein mixtures no fractionation steps other than known per se Are available, i.e. it is in principle only possible to extract individual proteins or proteins from the solution of proteins.
To precipitate protein mixtures fractionally at the isoelectric point by means of solvents or inorganic salts or by means of buffer solutions, from precipitates produced or from the raw materials used, individual proteins or
To selectively extract protein fractions using aqueous solutions containing organic solvents and / or inorganic salts, to work up solutions of proteins by chromatography and to produce selective precipitations by briefly heating solutions of proteins to certain temperatures. For example, in the process aimed at the production of an injectable arginase, U.S. patent no.
2,663,668 as well as a natural protein source, for example beef liver, with a divalent metal ion, u.zw. Mn ++ and / or Co ++, containing water at a pH of 7.09.5, which is also suitable for the process according to the invention, and then an arginase-rich fraction is obtained from the solution obtained by fractional precipitation using acetone as a second precipitation,
whereupon troublesome foreign proteins are precipitated from an aqueous solution of this arginase-rich fraction first by heating to 60-80 ° C. and then by adding salts of the divalent lead and arginase is precipitated from the clear solution obtained by means of acetone, which is then added by addition can also be activated by other cobalt salts.
In this known method, a further development of previously known methods for isolating arginase from natural protein sources, the arginase effect of the protein fractions obtained was obviously used as an aid to orientation as to whether the protein fraction in question is a usable or unusable fraction However, this decision could be made purely as a matter of routine with regard to the long-known effect of arginase.
Knowing the property of the protein-metal chelate which can be produced according to the invention to show the above-mentioned migration behavior in gel disk electrophoresis, the decision on the fraction to be selected and further processed can also be made purely routine, but it was in order to apply to the present invention reach, just necessary to recognize
that a protein that can be isolated in the form of the chelate given above is present in natural protein sources and, despite the extremely low content of natural protein sources in this protein, can be isolated from these protein sources in the form of the metal chelate given above by methods known per se for fractionating proteins. US Pat. No. 2,663,668 and the rest of the literature known to date and relating to the fractionation of proteins, neither the existence of the protein contained in a protein-metal chelate that can be prepared according to the invention nor the possibility of this protein-metal chelate from natural To gain protein sources, suggested.
The structure of the protein that can be isolated according to the invention in the form of a metal chelate has not been clarified, as is the case for most proteins. Structural investigations, which as a rule extend over several decades, are in progress. The minimum amino acid sequence required to characterize the structure of a protein is unknown.
The results of the structural investigation of the protein-metal chelate isolable according to the invention are given below.
The average elemental analysis of the protein-metal chelate is: 50.02% C, 7.92% H, 25.55% 0, 15.26% N, 0.00% P, <1% ash. The nitrogen content according to this elemental analysis is somewhat lower than that of typical proteins, which indicates that the protein-metal chelate that can be isolated according to the invention also contains non-proteins. This fact is confirmed by gel disk electrophoresis using an iodine Schiff indicator. Tests with sugar reagents performed after acid hydrolysis of the protein indicate the presence of a small amount of carbohydrate, which is probably covalently bound to the protein.
The isoelectric point of the protein-metal chelate which can be produced according to the invention is approximately at a pH of 5.5 + 0.3. Depending on which side you approach the isoelectric punlite, the protein-metal chelate becomes partially or completely insoluble at pH values of 4.0-6.0, which is why solutions of this chelate have pH values of 1.0- 4.0 or 6.0-11.0, preferably 7.0-8.0 should have in order to avoid a decrease in the yield due to filling phenomena; a pH value below 1.0 or a pH value above 11.0 should be avoided, since there is then the risk of denaturation of the protein-metal chelate.
The infrared spectrum of the metal chelate of a protein that can be isolated according to the invention is, determined at pH = 7, typical for proteins. In the table below are the ultraviolet absorption spectra of this protein at pH = 1.5 in 0.05N HCl, at pH = 1.5 in 0.05N HCl + 0.10m KCl at pH = 7 in water, at pH = 7 in 0.05 M phosphate buffer and at pH = 13 in 0.15 M KCI, the pH value being adjusted to 13 with 1 N KOH.
Ultraviolet absorption spectra of the new protein-metal helate
Optical density pH1.5 pH7.0 pH7.0 pH13.0 mm y = 0.05 y = 0.15 H2O buffer KCl-KOH
0.560 mglml 0.434 mg / ml 1.00 mg / ml 0.492 mg / ml 0.492 mg / ml 310 0.066 0.005 0.035 0.00 0.126 300 0.102 0.030 0.090 0.03 0.280 295 0.145 0.066 0.184 0.13 0.353 290 0.236 0.129 0.372 0, 18 0.430 285 0.320 0.190 0.510 0.25 0.429 284 0.342 0.204 0.540 0.22 0.430 283 0.355 - 0.560 - 282 0.369 0.219 0.570 0.29 0.438 281 - - 0.580 - 280 0.377 0.244 0.585 0.30 0.430 279 - 0.226 0.590 - 278 0.384 0.227 0.592 0.30 0.420 277 - 0.228 0.590 - 276 0.385 0.226 0.588 0.30 0.411 275 0.385 0.225 0.580 - 0.410 270 0.364 0.206 0.538 0.27 0.422 265 0.330 0.179 0.475 0.23 0.471 260 0.284 0.144 0.400 0.19 0.592 255 0.247 0.117 0.337 0.15 0.845 250 0.226 0.104 0.315
0.13 1. 150 245 0.263 0.134 0.402 0.18 -1.45 240 0.432 0.272 0.190 0.37 1.70 230 - - - 1.80
As can be seen from the table, the absorption spectra of the protein-metal chelate determined in the acidic medium and in the alkaline medium are considerably different from the absorption spectrum obtained at pH = 7.
In gel disk electrophoresis on polyacrylamide, the metal chelate of the protein which can be isolated according to the invention gives a typical picture with three closely spaced bands both at a pH of 9.4 and at a pH of 3.8 (flowing gel) [ This approach is based on the work of Ornstein and Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci.
121, 321 and 404 (1964) and by Williams and Reisfeld, Nature 195, 281 (1962)]. Typical electrophorograms of the protein-metal chelate are shown in the table below, in which all values are approximate.
pH9.4 pH3.8 B distance from the relative width distance from the relative in mum origin intensity in mum jump intensity inmml) in% iflmml) in% upper band 1.0 11.5 100 1.2 16.5 100 middle band 1, 0 14.0 89-93 0.4 20.0 53-56 lower band 0.5 18.0 48-52 1.2 22.0 94-96 t) upper edge, total length of the flowing gel:
56 mm
It is assumed that the typical three bands that show up in gel disk electrophoresis are due to a splitting of a band, which splitting can be ascribed to buffer effects in the electric field and does not indicate the presence of three different proteins in the metal chelate. Electrophorograms carried out ureter using argarose can be used to determine the concentration of the desired protein in a protein mixture. For this purpose, at a concentration of the sample of 10-100 mg / ml in 0.05 M [tris (hydroxymethyl) aminomethane] glycine buffer at pH 8.45 with 5 mA and 188 V for 30 minutes.
From an analytical point of view, this method has the advantage over gel-disk electrophoresis that the migrating proteins can be made visible both cathodically and anodically because the sample is located near the center of the plate.
The protein-metal chelate which can be produced according to the invention obviously represents a chemically uniform substance with regard to the behavior in gel disk electrophoresis, which is also confirmed by the behavior of this chelate during chromatography over ion exchange resins but also by the behavior during ultracentrifugation, where that which can be produced according to the invention Protein-metal chelate moves on in the form of a uniform, sharp band and the sedimentation coefficient is determined to be about 3.32 + 0.05 Svedberg units.
The protein-metal chelate that can be produced according to the invention has a broad spectrum of pharmacological activity and is able to alleviate damage caused by viral infections and can eliminate the consequences of overexertion in mammals or restore the immunity balance. This protein-metal chelate also has excellent anti-inflammatory properties.
It is suitable for the treatment of all diseases in which an inactivated or unbalanced autoimmune system is involved and can be used alone and together (simultaneously or alternately) with drugs used for the treatment of such diseases, for example steroids such as cortisone, hydrocortisone , Prednisone, prednisolone, dexamethasone, fluorocortisone, fluoromethalone, methylprednisolone, triamoinolone and its acetonide, (3-methasone and its known esters and derivatives or other known substances for the treatment of bacterial and viral infections, are used, with these drugs in lesser amounts Doses can be administered and normally occurring toxic effects and other side effects are reduced.
The protein metal chelate which can be produced according to the invention also proves to be suitable in the treatment of a large number of inflammations in which anti-inflammatory steroids are only of limited use, which can be seen from the fact that this chelate after generation of an inflammation induced by antigens according to the method of Unger et al., [Arch. Int. Pharmacodynam.
123, 71 (1959)] causes about 50% inhibition of inflammation at doses of 0.4 mg / kg, whereas the same inhibition can only be achieved by administering 25 mg of butazolidine and about 15 mg of hydrocortisone. Both when testing and when using the protein-metal chelate that can be produced remiss according to the invention, neither chronic nor acute toxicity can be determined.
With single doses of the chelate of 60 mg / kg administered intraperitoneally and / or intramuscularly, which is far in excess of the therapeutically required dose, in mice, rats, guinea pigs or donkeys, neither before killing nor after an apparent microscopic examination of the spleen, kidneys, the spinal cord, brain and injection sites are found to be toxic. The typical eosinophils or monocytosis that occur when foreign proteins are invented does not occur. No chronic poisoning was found when doses 100 times the effective dose were administered to donkeys and guinea pigs.
The protein-metal chelate which can be produced according to the invention is therefore largely free from the disadvantages of synthetic drugs, which often have a very specific, strongly delayed and inadequate effect.
The protein-metal chelate which can be isolated according to the invention acts strongly and rapidly after administration. This may be due to the fact that, in view of its chelate structure, it is quickly distributed to the cells. This structure makes this protein-metal chelate ideally suited for selective adsorption on and storage in certain cells, and this may be another reason for its surprisingly high effectiveness against viruses.
The protein metal chelate obtainable according to the invention preferably has a metal content of 0.1-1.0%, at least 65% of the metal content being formed by at least one of the metals Mg, Ca, Fe, Zn, Co and Cu, and such a chelate has the desired pharmacological properties.
In addition, a sufficient metal content of the chelate is absolutely necessary also with regard to its stability.
The most pharmacologically effective protein-metal chelates which can be prepared according to the invention have a metal content of about 0.25-0.75%. The extent of the pharmacological effect of the protein-metal chelate seems to depend at least in part on the presence of one or more physiologically essential divalent metal ions in the chelate, which is why the chelate preferably contains at least 75%, in particular 85%, of the metals in the form of at least one of the metals Mg , Ca, Fe, Zn, Co and Cu can be introduced.
When producing protein-metal chelates of the highest effectiveness, it must be ensured that at least 40% of the metal content is made up of a divalent metal with an ionic radius of 0.65-0.79, for example magnesium. Such metals can be found, for example, in the book by Hall, Chemistry and Physics, 44th edition, pages 3507-3508 (1962).
men will be. In most of such chelates, one of these metals is also the predominant metal, i.e. the chelating metal which is contained in the protein-metal chelate with the highest proportion. Although most of the metal content in the most effective chelates is due to physiologically essential divalent metals, typical metal chelates also contain other metals, which are often absorbed by the protein during the fractionation steps, especially from parts of the plant, when the concentration in the solutions to be processed of the desired physiologically essential divalent metal ions is low.
If, at least in the last fractionation step, a sufficiently high concentration of physiologically essential divalent metal ions is maintained in the solutions to be processed, protein-metal chelates can be produced in which only 10% of the total chelating elements present are physiologically insignificant elements, for example Al, Si or B are.
Since the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate is quite heat-sensitive, it is advisable to carry out all process steps at a temperature below SOC with the exception of brief heating. The brief heating of a solution containing the desired protein, which has to be carried out for the purpose of separating off the most heat-labile proteins, is expediently carried out to a temperature of at least 50 ° C., preferably to a temperature of 50-650 ° C. for a heating period of 105 min. It should be noted here that the temperature and the duration of the heat treatment are inversely proportional to one another.
The protein to be isolated in the form of a metal chelate is only stable for a short time at temperatures above 75 ° C. If it is not possible, for example with flash pasteurization, to heat and cool in a very short time, the mixture should not be heated above 750C. Mere heating to temperatures below 50 ° C. does not give satisfactory results, since some of the undesirable heat-labile proteins are still fairly stable at such low temperatures.
The desired protein is stable at 55 ° C for 15-30 minutes and at 65 ° C for about 3-8 minutes, which means that conventional heating and cooling devices can be used if the heat-labile proteins are destroyed.
Since, as mentioned, the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate is unstable at a pH value below 1.0 or at a pH value above 11.0 and in the vicinity of the isoelectric point (pH value = 5 , 5) is not so poor, it is advisable to work at a pH between 1 and 4 or between 6 and 11, preferably 7-8, in all fractionation steps, unless the aim is to use this protein from a solution To precipitate protein, in which case the pH of a solution containing this protein is to be brought to a value between 4 and 6, in particular to about 5.5.
Since the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate is considerably more stable in the form of a chelate, it is advisable to carry out all fractionation steps in the presence of an ion of a divalent metal with an ioned radius of 0.60-1.0 Å. It is advisable here to set the concentration of the solutions of ions of divalent metals to at least 1.10-4 m, preferably 0.005-0.20 m, in particular about 0.02 m.
The ions of divalent metals can be in the form of the sulphates, chlorides or acetates of the metals indicated above, e.g. in the form of Mg (CH3CO0) 2, MgS04, MgCk, CaCk or MnS04. The presence of ions of divalent metals in solutions of the protein to be isolated according to the invention in the form of a chelate is particularly useful when separating the most fluid-labile proteins by briefly heating a solution containing the desired protein, since, as mentioned, this protein is most stable in the form of a chelate and so only a small amount of the desired protein is destroyed during heating.
Since the separation effect that can be achieved in the individual fractionation steps, for example selective fillings using salts or solvents, is highly dependent on the pH of the solutions to be worked up, it is advisable to stabilize the pH of the solutions to be worked up against external influences by adding buffer substances. For this purpose, it is best to work in a buffer substance of 0.01 to 0.20 molar, preferably at least 0.05 molar, in particular 0.1 molar, solutions. Partially neutralized organic or inorganic acids, e.g.
Mixtures of tris (hydroxymethyl) aminomethane (hereinafter referred to as Tris for short) on the one hand and a dicarboxylic acid, such as maleic acid or succinic acid, phosphoric acid or an amino acid, e.g. Glycine, on the other hand, can be used.
In the method according to the invention, the natural protein source, for example animal organs or
Tissues such as the liver, kidneys, testes, pancreas, placenta, intestinal mucosa, thymus, lungs or spleen of rabbits, sheep, cattle, pigs or humans, or one of them in a manner known per se by treatment with organic solvents such as toluene or acetone , obtained dry powder is extracted with a buffer solution having a pH of 6-8 and two final metal ions with an ionic radius of 0.61.0, preferably 0.6-0.8 A, so that a solution is obtained from which As already mentioned, the desired protein-metal chelate can already be separated by gel electrophoresis or by means of molecular sieves due to its migration behavior during gel electrophoresis,
however, in order to achieve a sufficient separation effect, the gel electrophoresis or the fractionation by means of a molecular sieve must be carried out several times in order to finally be able to pull the individual fractions apart far enough.
However, in order not to have to work up excessively large amounts of substance in the context of gel electrophoresis or fractionation using molecular sieves, it is advisable to use fractionated filling before fractionation by gel electrophoresis or fractionation using a molecular sieve to obtain a fraction enriched in the desired protein by means of salts, in particular ammonium sulfate, and / or with solvents miscible with water, in particular acetone, dioxane, tetrahydrofuran, isopropanol and / or ethanol,
to manufacture. Naturally, in the course of these precipitations it is always advisable to work in aqueous solutions containing a buffer substance and a salt of a divalent metal.
Naturally, the more undesirable accompanying substances have been removed, the easier it is to separate the desired protein from the fractions obtained by means of gel electrophoresis or molecular sieves, but each of the fractions in question can in principle be worked up by gel electrophoresis or with molecular sieves.
One possibility of obtaining a fraction enriched in the desired protein is to use 40-45% of the aqueous solution obtained by extraction of the protein source or the dry powder obtained therefrom for the purpose of filling out less substances than the protein to be isolated in the form of a chelate. saturated with ammonium sulfate or mixed with about 1.5 parts by volume of acetone or ethanol, with the purpose of filling out any pigments that may be present before or after the filling of the less soluble substances, the solution with, preferably 10% of its volume, a heterocyclic amine, e.g.
Pyridine or piperidine, or about 15% of their volume of a mixture of ethanol and chloroform (about 2: 1) is added. For the purpose of separating the fluid-labile proteins, the resulting solution can be quickly, e.g. with vigorous stirring, heated to 590C, kept at this temperature for about 15 minutes and then rapidly, e.g.
by means of a kilt mixture, can be cooled to about 30C, before or after separating the fluid-labile proteins, a precipitate containing the desired protein can be produced by saturating the resulting solution either 58-76% with ammonium sulfate or with two to four -fold the amount of solvent (preferably acetone or ethanol) required to fall the less soluble proteins. The precipitate containing the desired protein is expediently placed in a buffer containing a divalent metal ion for further processing.
Another possibility of obtaining a fraction enriched in the desired protein is to use the same volume of the aqueous solution obtained by extraction of the protein source or the dry powder obtained from it for the purpose of separating off substances that are more readily soluble than the protein to be isolated in the form of a chelate mixed with cold acetone and the resulting precipitate is dissolved in a divalent metal ion, preferably Mn ++, containing buffer (pH about 7.6).
Subsequently, the procedure can be such that, in order to separate the fluid-labile proteins, the solution obtained is quickly heated to 60 ° C, kept at this temperature until about 20 minutes after the start of heating, and then quickly cooled to 50 ° C., whereupon one of the desired solutions is obtained from the solution obtained Protein-containing fraction is filled by adding about 0.9 parts by volume of ethanol and then the precipitate obtained is dissolved in a buffer containing a divalent metal ion.
Finally, the solution obtained can be subjected to a fractionated filling with ammonium sulphate for the purpose of separating off the more readily soluble protein than the protein to be isolated in the form of a chelate, the ammonium sulphate concentration of 60-75% of the saturation concentration of ammonium sulphate in a bivalent precipitate Metal ion-containing buffer are suspended and insolubles are removed from the suspension obtained.
The solution thus obtained of the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate, in particular the solutions freed from the fluid-labile proteins, the more easily soluble and the less soluble substances, can be subjected to fine purification by countercurrent extraction, gel electrophoresis or chromatography, e.g. Paper chromatography, thin layer chromatography or chromatography in columns filled with ion exchange resins or gels such as silica gel or cross-linked Detran (molecular sieve).
In fine purification it is generally sufficient to collect an absorption band at fractions showing 280 mm, since only such fractions contain the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate.
During this fine purification, the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate is separated from any residues of albumins or γ-globulins; In particular, the extensive separation of the albumin from the protein to be isolated according to the invention is essential, since the albumins impair the pharmacological effectiveness of the protein to be isolated according to the invention in the form of a metal chelate much more than γ-globulins.
Since, according to the prerequisite, a chelate containing 0.1-1.0% metals is to be isolated, in which at least 65% of the metal content is formed by at least one of the metals Mg, Ca, Fe, Zn, Co and Cu, it is expedient to at least last fractionation step in the presence of a divalent metal ion with an ionic radius of 0.60-0.79 A, especially in the presence of magnesium ions, or, if necessary, to transchelate the protein-metal chelate obtained to a chelate in which at least 40% of the metal content of a divalent Metal with an ionic radius of 0.65-0.79 A, in particular magnesium, are formed.
Since the solutions of the desired protein-metal chelate obtained in the final fractionation step still contain considerable amounts of buffer substance and salts of divalent metals, it is advisable to remove the buffer substance and the salts of divalent metals from these solutions by dialysis, whereby it is advisable to first remove them by dialysis against an approximately 0.001 molar solution of a salt of a divalent metal, in particular Mg, in demineralized water, the concentration of the solution is brought to less than 10-6 m of buffer substance and then the concentration of the solution is brought to the salt of a divalent metal by dialysis against demineralized water is brought down to less than 10-7.
Since the protein-metal chelate which can be prepared according to the invention is most stable in the dry state and stored at low temperature, solutions containing the protein-metal chelate, in particular solutions obtained from the pure chelate, must be freeze-dried.
example 1
1 kg of fresh ox liver, freed from connective tissue, was divided into five or six pieces, then rinsed with tap water and minced. Smaller amounts of the crushed ox liver (200 g) were homogenized in a cutter mixer with 200 ml of cold iso-osmotic KCl solution within 20 seconds, after which the homogenate was then immediately mixed in the mixer with 200 ml of acetone within 20 seconds at -10 ° C. The homogenate treated with acetone was then poured, with stirring, into a 10-liter beaker containing 2.5 liters of acetone cooled to -10 ° C.
As soon as the last portion of the minced ox liver had been treated in the manner indicated, the contents of the beaker were filled to 10 l with cold acetone and mixed thoroughly. The temperature was then kept at 40 for a few minutes. The clear excess liquid was then decanted off, whereupon the contents of the beaker were made up to 10 l with acetone. After the clear supernatant liquid had been poured off, the suspension was quickly filtered on a Buchner funnel, which is covered at the top, in order to prevent the ingress of air as far as possible.
Before the filter cake on the funnel was completely dry, it was washed with 2 liters of cold acetone. Washing was continued until the particles were completely dry. The filter residue was crushed, spread out on filter paper and dried under nitrogen. The powder obtained is finely ground while cold and stored at 40 in a vacuum. The yield of the powdery material was about 52 g.
100 g of the dry powder prepared in the above-mentioned manner were stirred into a liter of 1.0 M tris-maleate buffer, whereupon 6.5 g of MgS04.7 H2O were added in portions to the resulting mixture after a few minutes and the pH was adjusted with NaOH was set to 7.4.
A further 600 ml of tris-maleate buffer and a further 6.5 g of MgS04 were then added. 7 H2O were added, whereupon the pH was readjusted to 7.4. A further 400 ml of water were then added, and stirring was continued in a cold room until 6 hours had elapsed, calculated from the start of work. The mixture was then allowed to settle, followed by filtration and centrifugation. The pH of the filtrate was adjusted to 7.8, whereupon the filtrate was left to stand in the kilte until the separation was complete. The supernatant liquid was filtered off after centrifugation. The filtrate was freeze-dried for storage.
100 g of the powder obtained by extraction of the dry powder were suspended with stirring in 400 ml of cold, 0, in Tris maleate-Mg ++ buffer at pH 7.2, whereupon left to stand in a cold room until the precipitate had settled and centrifuged at 1-20C and was finally decanted. To separate the pigments, the decanted liquid was divided into 5 equal parts and each part slowly mixed with 8 ml of cooled pyridine (chemically pure) while stirring, after which 40 ml of 0.1 M Tris-Maleate Mg ++ buffer were added to each part. The mixtures obtained were then centrifuged at a temperature of 1-2 ° C. for 15 minutes at 13,000 rpm.
The supernatant clear liquids were decanted off and combined with one another, whereas the precipitate was discarded.
The cold solution of proteins in tris-maleate-Mg ++ buffer, freed from pigment, was adjusted to a pH value of 7.5 and then saturated with ammonium sulfate to 40-45% by stirring the ammonium sulfate in proportions in the form of a saturated aqueous solution was added and the temperature of the mixture was kept at 0-5 ° C.
The resulting mixture was left to stand in the cold for 30 minutes in order to allow the precipitate formed to settle out completely. The resulting precipitate, which contains the less soluble substances than the protein to be isolated according to the invention, was centrifuged off at 12,000 rpm and discarded.
In order to precipitate the fluid-labile proteins from the solution obtained, the solution was transferred to a 1 liter round-bottomed flask and heated to 59 ° C by means of a water bath kept at 6570 ° C with vigorous stirring, kept at this temperature for 5 minutes and immediately afterwards by immersing the round-bottomed flask in a Mixture of dry ice and acetone quickly cooled to a temperature of 2-30C. The resulting flocculent precipitate was centrifuged off in the cold and then discarded.
The solution, freed from the heat-labile proteins, was adjusted to a pH of 6.0, then saturated to 76% with ammonium sulfate and then placed in the cold for 2 hours until it was completely filled. The resulting almost white precipitate was taken up in 10-15 times its weight in 0.10 m Tris-Maleate-Mg ++ buffer and left to stand for 1/2 hour, whereupon any remaining residue was centrifuged off and discarded.
The solution of the protein to be isolated according to the invention in the form of a chelate (freed from the main part of the more easily soluble and the more difficult substances) was now subjected to fine purification by gel electrophoresis using cross-linked polyacrylamide as a gel.
For this purpose a device developed for production purposes was used, in which a 32 cm long, 10 cm wide and 1 cm thick block of a gel containing 5-7% by weight of cross-linked polyacrylamide was placed in the electrophoresis chamber largest dimensions was arranged vertically and in the area of these side surfaces could be grooved by means of a continuously circulated and cooled mixture of ethylene glycol and water, so that it was possible to work with a voltage of 600-1000 V and a current of 200-500 mA .
The gel block was produced in the electrophoresis chamber of this device by polymerizing a mixture of aqueous solutions of acrylamide, N, N'-methylenebisacrylamide and auxiliaries, which had been degassed in vacuo and introduced into the electrophoresis chamber without bubbles, using the following solutions : a) InHCI 480 ml
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 363 g
Tetramethylethylenediamine 4.6 ml
H20 to 1000 ml b) Acrylamide 280 g
N, N / -ethylene bisacrylamide 7.36 g
H20 to 1000 ml c) ammonium persulphate 1.00 g
H20 1000 ml
The mixture introduced into the electrophoresis chamber consisted of a volume part of a mixture of 1 part by volume of solution a), 2 parts by volume of solution b) and 1 part by volume of water on the one hand and 1 part by volume of solution c ) on the other hand.
With this mixture, the electrophoresis chamber was filled up to 16 mm below its upper edge, whereupon the gel in the electrophoresis chamber was carefully covered with a 0.001% aqueous solution of bromophenol blue serving as marking color and, after the polymerization was complete, the excess aqueous solution of the Bromphenolbiaues has been carefully removed. The aqueous solution of the protein to be isolated according to the invention in 0.10 M Tris-Maleate Mg ++ buffer, prepared in the manner indicated above, was then mixed with a mixture polymerizable to form a gel, and the mixture obtained was applied to the gel in the electrophoresis chamber and polymerized there under the action of light.
The mixture polymerizable to form a gel was prepared using the following solutions: d) 1n H3PO4 256 ml
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 57 g H20 to 100 ml (pH 6.9) e) Acrylamide 100 g N, N / -Methylene bisacrylamide 25 g H20 to 1000 ml c) Ammonium persulfate 1.00 g
H20 1000 ml
1 part by volume of a mixture prepared from 1 part by volume of solution d), 2 parts by volume of solution e) and 1 part by volume of water was mixed with one part by volume of solution c).
After the sample gel placed in the electrophoresis chamber had polymerized, the electrophoresis chamber was placed in the buffer container, which was filled with 60 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane, 288 g of glycine and the amount required for 20 liters Water was prepared and the buffer solution adjusted to pH 8.45, and the electrophoresis was carried out with cooling at 5 C and a current of 200 mA until after 3 hours the marking color had almost completely crossed the gel.
At this point in time, the protein-metal chelate to be isolated according to the invention was in an area which was about 30% of the hiking trail covered by the marking color from the point of origin.
The protein-metal chelate to be isolated according to the invention was well separated from the considerably more rapidly migrating
Albumins and also well separated from the much more slowly migrating y-globulins. After the electrophoresis was completed, the desired protein-metal chelate was washed out of the gel by means of a cross-flow of 0.1 M Tris-maleate buffer, which was Mg ++ 0.001 molar, the progress of the isolation being determined by the UV absorption at 280 mm was pursued. The uniformity of the protein-metal chelate obtained in this way was further checked by analytically carried out gel disk electrophoresis.
The protein metal chelate to be isolated was obtained from the eluate obtained by first dialyzing this eluate exhaustively against 0.001 M Tris-Maleate-Mg ++ buffer and then against deionized water and then freeze-drying the dialysate obtained. This turned into a white, fluffy powder obtained in an amount equal to approximately 16% of the ammonium sulfate precipitated product.
The yield of protein-metal chelate, based on the dry weight of the ox liver used, was 0.02%.
Example 2
Unless otherwise stated, all work steps were carried out in a cold room (2-50C).
Fresh beef liver was ground and poured into a plastic filter, whereupon cold distilled water in an amount of 2 liters per kg of liver was added with stirring and the pH of the mixture obtained was adjusted to 7.5-7.6 with 0.5 in NaOH has been. So much 2m-MnSO4 solution was then added to the mixture that the manganese mixture became 0.05 molar. The pH was then adjusted to 7.6, whereupon enough fresh cold water was added that there was a total of 3 liters of water for 1 kg of liver. 50 ml of toluene were then added per kg of liver, after which the mixture was stirred overnight in a cool room.
The next morning, the suspension was filtered through gauze made of plastic threads, and the filtrate was then admixed with 1½ times the volume of cold acetone (-10 ° C.) with gentle stirring. The acetone was added through a glass tube which protruded far enough below the surface of the mixture. The resulting precipitate was immediately isolated by centrifugation and immediately suspended in about 25% by volume of 0.05 M maleate-Mn ++ buffer, based on the volume of the filtrate before the acetone was added. The mixture was stirred in the cold for several hours, filtered through gauze made of synthetic threads, and healed by centrifugation.
The resulting supernatant liquid was rapidly heated to 60 ° C in a stainless steel kettle with stirring and held at this temperature for up to 20 minutes after the start of heating. The mixture was then cooled to 5 ° C. as quickly as possible, whereupon the resulting volumetric precipitate was filtered off in the cold room by slow suction over a large filter surface.
The temperature of the clear filtrate was brought to 2-5 ° C, whereupon 0.9 parts by volume of denatured ethanol (-10 ° C) by means of a dropping funnel over a glass tube extending well below the surface of the mixture with vigorous stirring and at a temperature of at most 5 C were added. After all the alcohol had been added, the mixture was kept in a cold room until the precipitate had aggregated and settled. The precipitate was isolated by suction with a low vacuum and immediately afterwards dissolved in cold 0.001 M maleate-Mn ++ buffer of pH 7.0. The amount of buffer used was about 4 ml / g of precipitate.
The solution was clarified by centrifugation, the supernatant liquid was then separated off and the precipitate was extracted several times with small amounts of cold buffer solution. The excess liquids are combined with one another and freeze-dried. The powder obtained was a mixture of the desired protein, arginase and other enzymes, albumin and other, insignificant proteins.
For the purpose of further work-up, the powder thus obtained was dissolved in 12 times its bulk volume in cold 0.2 M Tris buffer, which was 0.001 molar in Mg ++ and had a pH of 7.8. The solution thus obtained was treated with cold, saturated ammonium sulfate solution, which was also 0.001 molar in Mg ++. 375 ml portions of this were given per 1000 ml of buffer solution, the buffer solution being saturated to 15, 30, 45, 60 and 75% of ammonium sulfate. In each case, the ammonium sulphate solution was added dropwise at 0-5 ° C and with stirring.
The mixture was stirred for a further 10 minutes, after which the precipitate formed was separated off by centrifugation at 4500 rpm for 30 minutes at 0OC. Of the 5 fillings obtained, the first (A), which contains the undesired high molecular weight proteins, was discarded. The second and third fillings (B and C) have been combined and contain arginase and other enzymes (which can be isolated if desired). The fourth and fifth liquids (D and E), which contain the desired protein contaminated with albumin and various other lower and higher molecular weight proteins, were also combined.
The last remaining liquid, which contains low molecular weight proteins and other undesirable impurities, was discarded. The fillings D and E were in 0.03 M Tris-Mg ++ buffer, which is 0.001 molar in Mg ++ and had a pH of 7.8, in an amount that a 10% solution as exactly as possible was obtained. The solution thus obtained was dialyzed against cold buffer until the reaction to sulfate ions was negative. The dialyzed solution was clarified by centrifugation, after which the supernatant liquid was filtered through a Milliporo filter.
The filtrate obtained was applied directly to the top of a chromatography column (76 × 456 mm) which was filled with Sephadex C-100 (Pharmacia, Sweden). The Sephadex was swollen, brought to a defined state and washed according to the manufacturer's instructions. The column thus prepared was equilibrated with 0.03 M Tris (0.001 M Mg ++) buffer of pH 7.8 and adjusted to a flow rate of about 20 ml per hour. After the sample was applied to the column, it was equilibrated with the first 3 cm of the resin bed within 30-45 minutes, whereupon fractionation was started. Individual fractions of 10 ml each were collected. The occurrence of the vertices is recognized by determining the protein concentration by means of the absorption at 280 mm.
Before the desired protein appeared, there were two peaks that can be attributed to albumin and other undesirable proteins of similar or higher molecular weight. Those fractions showing peaks were discarded. The desired protein was found in that fraction of the total eluate which comprises the cm3 from 130-170. These fractions were combined for further work-up. When the column was further eluted, in particular when the ion concentration of the buffer was increased, eluates containing residual proteins of low molecular weight flowed out of the column. The low molecular weight proteins were removed from the column in order to purify it for the next batch.
The pooled fractions containing the desired protein are dialyzed against a 0.001 molar solution of Mg ++ in deionized water until it has been reduced to less than 10-7. The resulting solution was clarified by centrifugation, and the supernatant was freeze-dried.
75 kg of fresh beef liver, which contained 70% water and provided 22.5 kg of dry matter, gave a yield of about 200 g (1%) of the intermediate product containing the Mn ++ chelate. 200 g of this intermediate yielded 17.5 g (0.08%) solids in the form of fractions D and E.
When chromatographed on Sephadex, 2.9 g of the desired protein-metal chelate were obtained from fractions D and E, which, based on the dry weight of the liver, corresponded to a yield of 0.014%.
When administered intradermally or by other means to sensitized guinea pigs, the protein-metal chelate which can be isolated according to the invention does not generate any antigens. Corresponding tests when using Freund's adjuvant in rabbits could not determine the formation of antibodies, which seems to prove that the antigenetic effect of the protein-metal chelate is at most extremely low, so that this chelate can be administered to mammals for a long time, without having to expect disturbances.
A total of 30 mg / kg of the protein-metal chelate together with Freund's adjuvant and alum filling were administered to rabbits in 6 individual doses within 29 days. At the end of the immunization period, the serum (γ-globulin) of the animals was concentrated by salting out and then freeze-dried. Ouchterlony plates and immunoelectrophoresis using this concentrated γ-globulin fraction against the protein which can be isolated according to the invention did not yield any filling lines.
Although healthy animals do not respond immunologically, the seriously ill, whose autoimmune system is practically inactive or out of balance, occasionally respond immunologically, which, however, does not prohibit the use of the protein-metal chelate. On the contrary, it is a welcome phenomenon, which indicates that the patient's autoimmune system has reactivated, which is a vital preliminary stage before the patient's full recovery.
The protein-metal chelate that can be produced according to the invention is generally administered by injection, for example intravends or subcutaneously, but preferably intramuscularly. The single doses to be administered to humans are usually between about 0.05-1.0 mg. As a rule, about 0.4-5.0 omg is administered intramuscularly to horses. The dose is not critical. As a rule, the initial doses should be chosen to be higher than those for the subsequent therapy. When combatting viral diseases, the protein-metal chelate is usually administered intramuscularly in single doses of 0.2-4.0 mg.
In contrast to the treatment of chronic diseases, when vaccinating viral diseases, it is advisable to administer them in doses in quick succession, for example in the form of two injections per day for several days. The duration of treatment and the frequency of administration depend on the response, which often corresponds to a dramatic improvement. As a rule, the duration of treatment is three to eight days. In the event of a relapse, repeated injections are equally effective.
Oral administration of the protein-metal chelate is possible as long as it is protected against destruction by the acidic environment of the digestive system and its enzymes, for example in the form of coated tablets. With this route of administration, however, much larger doses are required. Surprisingly, the protein-metal chelate is also effective when administered locally, which is why it is administered, for example, in the form of a solution in physiological saline or a buffer solution and in the form of creams, ointments, etc. and for the treatment of diseases of the cornea and conjunctiva, the respiratory tract , genitals, urinary tract and skin can be used.
For example, by local administration it is possible to treat acne, irritation, abrasions, burns, abscesses, psoriasis, etc. In this case, the protein metal chelate is expediently administered together with a wetting agent and / or a penetration agent.