DE2633246C2 - Verwendung eines Materials aus einem porösen mineralischen Oxid zur chromatographischen Reinigung oder Trennung von biologischen Makromolekülen - Google Patents
Verwendung eines Materials aus einem porösen mineralischen Oxid zur chromatographischen Reinigung oder Trennung von biologischen MakromolekülenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Materials, bestehend aus einem porösen mineralischen Oxid,
dessen Oberfläche direkt mit einem aminierten Polysaccharidpolymeren überzogen ist, zur chromatographischen
Reinigung oder Trennung von biologischen Makromolekülen.
Aus der GB-PS 10 25 960 ist ein teilchenförmiges Titandioxid bekannt, das mit einem aminierten Polysaccharid
überzogen ist, wobei die Teilchen 0,15 bis 035 nm groß sind und die Menge des Überzugsmaterials, das ein
Molekulargewicht von insbesondere wenigstens 10 000 hat und z. B. aminierte Cellulose und amirierte Stärke ist,
liegt in Mengen von 1 bis 5 Gew.-% vor.
Dieses Material ist für Pigmentierungszwecke, insbesondere von Papier aus Cellulosefasern geeignet, wo es
den Pigmentgehalt erhöht und damit der Verfärbungsneigung insbesondere im Ultraviolettlichtbereich entgegenwirkt
Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich solche Materialien für die chromatographische Reinigung
oder Trennung von biologischen Molekülen besonders wegen ihrer günstigen mechanischen Festigkeit in
Verbindung mit einer großen chemischen Aktivität eignen, die eine reversible Oberflächenfixierung biologischer
Makromoleküle erlauben. Insbesondere sind diese Materialien für die präparative Trennung solcher Makromoleküle
auch im technischen Maßstab geeignet, was für die meisten, für diesen Zweck bekannten Absorptionsmittel
nicht der Fall ist
Der poröse mineralische Träger kann aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid oder einem Titanoxid
oder deren synthetischen oder natürlichen Derivaten, wie Gläsern, Silikaten, Kaolin etc. bestehen.
Das aminierte Polysaccharidpolymere ist auf dem porösen mineralischen Träger durch eine Bindung fixiert,
wobei dieser Adhäsionsmechanismus nicht einheitlich auf einer Adhäsion elektrostatischer Natur zu beruhen
scheint, denn poröse Träger, wie Aluminiumoxid mit nicht-negativer Oberfläche können zugleich mit aminierten
Polysaccharidpolymeren überzogen werden und zu Materialien von ausgezeichneten Eigenschaften führen.
Daraus ergibt sich, daß der Überzug des aminierten Polysaccharidpolymeren auf dem Träger praktisch
irreversibel fixiert ist Dennoch ist es unter bestimmten Bedingungen, die weiter unten näher erläutert werden,
möglich, nach einer gewissen Gebrauchsdauer das poröse mineralische Trägermaterial zu regenerieren und es
danach von neuem für eine neue Imprägnierung mittels eines aminierten Polysaccharidpolymeren zu verwen-
Der poröse mineralische Träger muß eine genau definierte Porosität aufweisen. Die innere Oberfläche des
Trägers muß 100 m2/g oder weniger betragen und soll sich nach Möglichkeit auf etwa 5 bis 80 m2/g belaufen.
Der mittlere Porendurchmesser soll 25 nm oder mehr betragen und nach Möglichkeit zwischen 50 und 1000 nm
liegen, wobei die genaueren Bereiche je nach dem beabsichtigten Anwendungszweck ausgewählt werden. Bei
größeren Oberflächen oder geringeren Porendurchmessern wird die innere Oberfläche des Trägers für das
aminierte Polysaccharidpolymere und später für die zu trennenden Makromoleküle unzugänglich. Insbesondere
besteht der poröse mineralische Träger aus Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid und am besten aus einem
porösen Siliciumdioxid-Träger anionischen Charakters, der z. B. nach den Verfahrensweisen erhalten wird, die in
den FR-PS 14 73 239,14 73 240, 14 75 929 und 14 82 867 beschrieben sind. Man verwendet z. B. handelsübliche
poröse Siliciumdioxid-Träger mit Oberflächen von 50 bzw. 25 und 10m2/g entsprechend Porendurchmessern
von 60 bzw. 125 bzw. 300 nm.
Das aminierte Polysaccharidpolymere, das dazu dient, um die innere Oberfläche des porösen mineralischen
Trägers zu imprägnieren und zu überziehen, soll einen ausgesprochen kationischen Charakter aufweisen und
gute hydrophile Eigenschaften besitzen. Es soll ein Molekulargewicht von mindestens 104 Dalton, nach Möglichkeit
zwischen 105 und 106 Dalton, aufweisen. Es kann eine beliebige Konstitution aufweisen und kann insbesondere
ein aminiertes Derivat des Dextrans, der Stärke, der Cellulose, der Agarose oder eines natürlichen oder
synthetischen Polymeren aller bekannten Ösen sein mit der Maßgabe, daß es keine anionischen Gruppierungen,
wie Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen, schon gar nicht in einer solchen Menge enthält, daß das Polymerisat
ins Gewicht fallende negative elektrische Ladungen aufweist, die dazu führen, daß der Träger neben seiner
Brauchbarkeit als Trägermaterial auch als Anionenaustauscher wirken könnte.
Die Amin-Funktionen des Polysaccharidpolymeren können primärer, sekundärer oder tertiärer oder gegebenenfalls
sogar quaternärer Natur sein. Bevorzugt kommen indessen sekundäre, tertiäre und quaternäre Amin-Funktionen
in Frage.
Vorzugsweise entspricht das aminierte Polysaccharidpolymere der nachstehenden Formel
„. __
„. __
R-(CH2J11-N
R1
in der R einen Dextran-, Stärke-, Cellulose- oder Agarose-Rest bedeutet π eine ganze Zahl im Wert von 1 bis 10,
vorzugsweise 2 bis 5, ist, Ri und R2, die gleich oder verschieden sein können, Reste der Formeln — CF3,
-CH2-CH3, -CH2OH, -CH2-CH2OH oder -CH2-CHOH-CH3 darstellen, wobei diese Verbindung
mittels eines klassischen Quaternisierungsmittels, wie einem Alkyl- oder Hydroxylalkylhalogenid, insbesondere
-jodid oder -bromid, oder Dimethylsulfat, quaternisiert sein kann.
Zu den Verbindungen dieses Typs gehören insbesondere Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-Detran) vom
Molekulargewicht 500 000 und quaternisiertes Diäthylaminoäthyldextran (QAE-Dextran), ferner Diäthylaminoäthylstärke
und handelsübliche kationische Stärke.
Gemäß einer anderen bevorzugt in Frage kommenden Ausführungsform der Erfindung kann das aminierte
Polysaccharidpolymere mit einem Vernetzungsmittel vernetzt werden, wie dem 1,4-Butandiol-digIycidyläther
oder Epichlorhydrin, Epibromhydrin, einem Diepoxid derj^ormel
r7
CH2-CH-R2-N-R3-CH—CH2
L0J L0J
in der Ri einen Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen niedermolekularen Alkylrest mit 1
bis 4 Kohlenstoffatomen, bedeutet und R2 und R3 für eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise einen niedermolekularen Alkvlenrest stehen, wie im Diepoxid dir Formel
CH3
(CH2),
CH2-CH-CH2-N-^H2-CH—CH2
CH2-CH-CH2-N-^H2-CH—CH2
Lo-1 Lo-J
Die Herstellung kann nach zwei verschiedenen Methoden erfolgen, nämlich der Imprägnierung in der Säule
und der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank.
Gemäß der ersten Arbeitsmethode gibt man das trockene, homogene poröse mineralische Oxid in eine
Chromatographiesäule, wäscht und homogenisiert, um alle Luftblasen auszutreiben, indem man eine Säurelösung,
ζ. B. 0,1-η Salzsäure, durchlaufen läßt Man läßt dann eine Pufferlösung vom pH 3 bis 12 (z. B. den Puffer
TRIS, 0,05molar, pH 7) durchlaufen bis zur Gleichgewichtseinstellung bzw. Equilibrierung.
Man führt danach das aminierte Polysaccharidpolymere in einer kalten oder warmen Lösung in dem Puffer
oder in Wasser, das auf das gleiche pH eingestellt ist, ein. Der Überschuß des aminierten Polysaccharidpolymeren
wird dann durch Eluierung mit dem Puffer und danach mit der Lösung eines Salzes, z. B. Trinatriumcitrat
eliminiert; die Prüfung darauf, ob das End-Eluat von dem aminierten Polysaccharidpolymeren frei ist, kann mit
Hilfe der Elektrophorese in Celluloseacetat und Anfärbung der Flecken mit Ponceaurot oder noch durch Fällung
in Gegenwart einer Polyacrylsäure erfolgen.
Das so erhaltene Material ermöglicht es, ungefähr 20 bis 50 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial in
reversibler Weise zu fixieren. Μ
Das Material ist durch eine große Stabilität in einem weitin pH-Bereich (ungefähr 3 bis 12) ausgezeichnet
Nach der zweiten Methode wird das poröse mineralische Oxid, nachdem es gewogen worden ist, kalt oder
warm mit einer wäßrigen Lösung des aminierten Polysaccharidpolymeren bei einem pH, das ohne Unterschied
zwischen 3 und 12 liegen kann, imprägniert. Man trocknet dann im Dampftrockenschrank zwischen 50 und
120° C, vorzugsweise bei 80° C, bis Gewichtskonstanz erreicht ist
Das so erhaltene Pulver wird dann homogenisiert und gesiebt, wenn sich dies als nötig erweist, um etwaige
Aggiomerate zu entfernen. Das so durch Imprägnierung im Trockenschrank erhaltene Material kann nach einer
vorangehenden Wäsche mit einer Pufferlösung oder einer 0,05molaren Citratlösung vom pH 4 oder einer
0,05molaren Lösung vom pH 6,8 verwendet werden, das nach dieser Methode erhaltene Material vermag
ungefähr 40 bis 200 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial in reversibler Weise zu fixieren.
Wie man feststellen kann, erhöht diese Methode der Imprägnierung im Trockenschrank beträchtlich die
Kapazität der Fixierung von Proteinen. ,·.»■· u ■ w . · 1
Die Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank macht es zugleich möglich, ein Material zu
gewinnen, dessen Auskleidung mit dem aminierten Polysaccharidpolymeren praktisch irreversibel fixiert ist.
Dieses Material kann in der Tat mit 0,1-n Salzsäure, mit Sodalösung oder mit 0,1-n Ammoniak gewaschen
werden ohne daß das Anionen-Austauschvermögen beeinträchtigt wird, während bei dem nach der Methode
der Imprägnierung in der Säule erhaltenen Material durch solche Waschen das ursprüngliche poröse mineralische
Oxid regeneriert wird. Will man das poröse mineralische Oxid aus den Materialien regenerieren, die nach
der Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank erhalten worden sind, so muß man das Material
unter weit schärferen Bedingungen, z. B. mit rauchender Salpetersäure, behandeln.
Hieraus folgt also, daß es bei Anwendung der Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank
möglich ist, das Material für eine Vielzahl von Operationen zu verwenden, ohne hierdurch seine ausgezeichneten
Eigenschaften als Anionenaustauscher zu beeinträchtigen.
Es ist auch möglich, nach der Imprägnierung gemäß einer der oben beschriebenen Methoden und nach einer
Trocknung im Dampftrockenschrank zwischen ungefähr 50 und 80° C zwecks Gewinnung eines homogenen
Pulvers das erhaltene Produkt dann mit einer Lösung eines Vernetzungsmittels in einem flüchtigen Lösungsmittel,
wie Äthyläther, zu behandeln, wobei man als Vernetzungsmittel beispielsweise irgendeines der oben erwähn-
!0 ten Vernetzungsmittel verwenden kann.
In diesem Fall wird das zu behandelnde Produkt bis zur völligen Verdampfung des Lösungsmittels gerührt, um
so eine gleichmäßige Imprägnierung sicherzustellen.
Man hält das Ganze dann ungefähr 15 Stunden lang auf einer Temperatur von 40 bis 120° C, vorzugsweise auf
etwa 80° C Nach dem etwaigen Sieben wird das Trägermaterial dann trocken auf eine Säule gegeben, erst mit
Sodalösung und mit einer Natriumchloridlösung gewaschen und schließlich mit dem gewünschten Chromatographiepuffer
equilibriert
Durch eine solche Vernetzung erhält man so ein Material, das ausgezeichnete Eigenschaften aufweist und das
in übücher Weise mit Sodalösung oder 0,1 -n Ammoniak oder 0,1 -n Salzsäure gewaschen werden kann, ohne daß
hierdurch die Trennqualitäten bzw. die Kapazität zur reversiblen Fixierung der Proteine verändert wird.
Die Kapazität des so erhaltenen Materials beträgt etwa 40 bis ?.00 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial. Für die Oberflächen des anfänglichen porösen Trägers, die sich auf ungefähr 10 bis 80 m2/; belaufen, ist diese Kapazität nahezu konstant
Die Kapazität des so erhaltenen Materials beträgt etwa 40 bis ?.00 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial. Für die Oberflächen des anfänglichen porösen Trägers, die sich auf ungefähr 10 bis 80 m2/; belaufen, ist diese Kapazität nahezu konstant
Sowohl die Materialien, die nach dem verfahren der Imprägnierung in der Säule erhalten wurden, als auch die
Materialien, die nach der Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank gewonnen wurden, können
mit konzentrierter Salpetersäure gewaschen werden, um das poröse mineralische Oxid, das als Träger dient, zu
regenerieren.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung werden die kationischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen
Materials entweder zur selektiven Fixierung der biologischen Makromoleküle, die man zu isolieren oder zu
reinigen wünscht, oder zur selektiven Zurückhaltung von Verunreinigungen oder anderen nicht erwünschten
Proteinen, benutzt
Die selektive Fixierung von Proteinen ist leicht zu bewerkstelligen durch Regulierung des ph und der Molarität
nach den an sich bekannten Methoden des Betriebes von Ionenaustauschern.
Hierbei läßt man über das Material, das Gegenstand der Erfindung ist, eine Lösung laufen, welche die
biologischen Makromoleküle, die man zu isolieren oder zu reinigen wünscht, enthält. Hierbei wird das ph und die
Molarität so einreguliert, daß das genannte Material entweder die biologischen Makromoleküle, die man zu
reinigen oder zu isolieren wünscht, oder die nicht erwünschten Verunreinigungen selektiv fixiert
In dem Fail, in dem das Material die Makromoleküle, die man zu reinigen oder zu isolieren wünscht, fixiert,
werden diese dann anschließend mit einer Lösung von geeignetem pn und zweckentsprechender Molarität
eluiert
Wenn das Material die Verunreinigungen fixiert gewinnt man direkt die biologischen Makromoleküle in
Lösung. Man eluiert dann mit einer Lösung von geeignetem ph und geeigneter Molarität, um die Verunreinigungen
zu eliminieren und so das Material für eine neue Operation zu regenerieren.
Einige erfindungsgemäß mögliche Anwendungen sind:
(a) die Reinigung von ^Globulinen aus menschlichem oder tierischem Blutplasma oder -serum:
(b) die Eliminierung von Hämoglobin im Verfahren der Albumin-Reinigung aus Planzentarblut und die Konzentration
der anderen Proteine;
(c) die Konzentration einer verdünnten Lösung von Proteinen in einem alkoholischen Medium und die Eliminierung
des Alkohols;
(d) die Konzentration und Reinigung von Albumin in einer Natriumcaprylatlösung;
(e) die Konzentration und Reinigung von Gangliosiden aus wäßrigen Extrakten von Tierhirnen.
Das erfindungsgemäße Material findet aucli Anwendung zur Reinigung von Antikörpern oder Antigenen. In
diesem Fall immobilisiert man auf dem Material Antigene eier Antikörper, und man nutzt das so modifizierte
Material zur Reinigung und Konzentration der entsprechenden Antikörper und Antigene aus.
Auf diese Weise ist es möglich zu immobilisieren:
menschliche oder tierische Λ-,β- und ^-Globuline und Albumin;
menschliche oder tierische Λ-,β- und ^-Globuline und Albumin;
alle Bakterien- und Virus-Antigene, vorausgesetzt daß sie negative elektrische Ladungen bei ph 6,8 aufweisen;
dies ist der Fall bei den meisten bekannten Proteinen, Polysacchariden und Nucleinsäuren.
Desgleichen kann man hier — ohne damit eine Einschränkung zu verbinden — weiter anführen die Bakterientoxine,
das Tetanus-Anatoxin, das mit dem Hepatitisvirus B verbundene Antigen HBj, das Grippevirus, das
Tollwutvirus, das Herpesvirus, das Masernvirus, das Rötelnvirus, die Adenovieren, die Papovaviren, die Arboviren,
die Rhinoviren, die Picornaviren, die Enteroviren, die Poxviren, die Mycoviren, die Paranyxoviren, die
Reoviren, die Coronaviren oder deren Abbauprodukte und desgleichen deren verschiedene Antigene.
Ebenso wie die erfindungsgemäßen verwendeten Materialien die Antigene oder Antikörper immobilisieren
können, können diese genauso die verschiedenen Enzyme immobilisieren, was zu folgenden Materialien mit
enzymatischer Aktivität führt: Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin, Lactio-deshydrogenase, L-Aminoacylase,
Invertase, Glucose-isomerase, Amyloglycosidasc.Glucose-oxydase, Katalase, Lipase und Urease.
Nach einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung können diese immobilisierten makromolekularen Substanzen
es in irreversibler Form sein, wenn man nachträglich eine Vernetzung mit einem Vernetzungsmittel der
oben angeführten Art vornimmt.
Diese Vernetzung wird im allgemeinen bei Zimmertemperatur durchgeführt.
Schließlich können die Materialien weiter dazu verwendet werden, um Moleküle von geringem Molekulargewicht
zu immobilisieren, wie gewisse Aminosäuren oder bestimmte Liganden, die Aminfunktionen besitzen;
Alkohole oder Thiole, in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie Glutaraldehyd oder Diepoxyverbindungen,
wie sie oben angeführt sind.
Auf diese Weise ist es möglich, z. B. Lysin zu immobilisieren, und das erhaltene Material kann verwendet
werden zur Reinigung oder Eliminierung von Plasminogenen oder Plasmin, also von Blutproteinen, die eine
starke Affinität zum Lysin besitzen.
Desgleichen ist es möglich, verschiedene Steroide zu immobilisieren und die so modifizierten Materialien dann
zum Reinigen ihrer Tfansport-Proteine zu verwenden. Schließlich ist es auch möglich, verschiedene Zellrezeptoren
zu immobilisieren, z. B. Ganglioside, die vorher deacetyliert worden sind, um die reaktionsfähigsten Aminfunktionen
wieder freizulegen, und diese Materialien dann zur Eliminierung, Neutralisation oder Reinigung ihrer
Liganden zu verwenden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
10 g S1O2 mit 300 nm Porengröße werden in eine Chromatographiesäule gegeben, indem man das trockene
und homogene Pulver direkt eingießt, was die Montage der Säule erleichtert Dann werden 100 ml einer 0,1 η
Salzsäurelösung in-die Säule eingespeist, und zwar mit Hilfe einer mechanischen Förderpumpe mit einer
Durchsatzgeschwindigkeit von 500 ml/Std, um die Säule zu waschen und zu imprägnieren und alle Luftblasen zu
vertreiben (wobei es vorteilhaft ist, die Eluierung in aufsteigendem Sinn vorzunehmen). Dann wird ein Puffer
vom pn 3 bis 12 (z. B. TRIS-Puffer, 0,05mo!ar, Ph 7) auf die Kolonne bis zur Gleichgewichtseinstellung aufgegeben,
was durch Messen des Ph und des spezifischen Widerstandes am Ablauf aus der Säule überwacht wird. Dann
werden ungefähr 150 ml einer l°/oigen DEAE Dextran-Lösung (oder 30 ml einer 5%igen Lösung) in einem
Puffer der vorerwähnten Art oder in Wasser, das auf dieses pH eingesf -IUt ist, mit einer Durchsatzzgeschwindigkeit
von 100 ml/Std. aufgegeben. Hiernach wird der Überschuß an nicht auf der Säule fixiertem DEAE Dextran
eluiert, und zwar mit dem vorerwähnten Puffer, dann mit 0,05molarem Citrat vom ph 4 und mit 0,05molarem
Citrat vom ρκ 8 mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1000 ml/Std. Schließlich wird die Säule in dem gewünschten
Chromatographiepuffer equilibriert Die Abwesenheit von DEAE Dextran in dem End-Eluat kann
durch Elektrophorese in Celluloseacetat und Anfärben des Flecks mit Ponceaurot oder durch Fällung in
Gegenwart von Polyacrylsäure überprüft werden. Das so imprägnierte Trägermaterial ist in einem weiten
Ph-Bereich (ungefähr 3 bis 12) stabil und verhält sich wie ein Anionenaustauscher-, es ist besonders zur Reinigung
oder Konzentrierung von Proteinen geeignet In einem adäquaten Puffersystem vermag es 20 bis 50 mg Proteine
pro Gramm imprägniertes Tf ägerrnaicria! in reversibler Weise zu Fixieren.
Das DEAE Dextran kann durch das QAE Dextran ersetzt werden.
10 g S1O2 der Porengröße 125 nm werden abgewogen und mit 20 ml einer wäßrigen Lösung eines aminierten
Polysaccharids (z. B. DEAE Dextran oder DEAE-Stärke) von einer Konzentration von 1 bis 10%, vorzugsweise
5 bis 8%, und bei einem pH imprägniert, das — ohne Unterschied — zwischen 3 und 12 liegen kann. Das Ganze
wird dann im Dampf trockenschrank bei 50 bis 1200C, vorzugsweise bei 8O0C, die erforderliche Zeit lang (z. B. 15
Stunden) getrocknet, um Gewichtskonstanz (durch Austreiben des Wassers) zu erzielen. Das erhaltene Pulver
wird homogenisiert und erforderlichenfalls gesiebt, um eventuell vorhandene Agglomerate zu entfernen, und
dann in die Säule gegeben.
Nach Füllung der Säule und vorangehenden Waschen mit den Pufferlösungen 0,1-n Salzsäure oder Citrat,
0,05molar, pH4, oder Citrat 0,05molar, ph6,8 oder 0,1-n NaOH wird die Säule in dem Puffer, welcher dem
gewünschten Chromatographie^Tyffc^gusijst, equilibriert Die Kapazität für die Fixierung von Proteinen ir*
diesmal höher, liegt in der Grö3enordnuiigv§rft8*is 200 mg/g unter den Chromatographiebedingungen.
Zu 10 g S1O2 vom Porendurchmesser 60 nm, die nach einer der beiden vorerwähnten Methoden durch eine
aminierte Polysaccharidpolymeren-LösLing vom ph8 bis 13, vorzugsweise HA imprägniert und danach im
Dampftrockenschrank zwecks Gewinnung eines homogenen Pulvers getrocknet wurden, werden 20 ml einer
0,02 bis 2%igen, vorzugsweise 0,15%igen Lösung von 1,4-Butandiol-diglycidyläther in Äthyläther zugesetzt Das
Ganze wird standig bei einer Temperatur von 400C gerührt, bis der Äthyläther vollständig verdampft ist und
man eine gleichmäßige Imprägnierung durch diese Diepoxyverbindung, die als Vernetzungsmittel wirkt, erzielt
hat
Das Ganze wird dann ungefähr 15 Stunden lang auf einer Temperatur von 40 bis 1200C, vorzugsweise auf
etwa 8O0C, gehalten. Nach einem eventuellen Sieben am Schluß wird das Trägermaterial dann trocken in eine
Säule gegeben, mit t Lher 0,1 -n Scdalcsusg und dann mit 1 Liter molarer NaCl-Lösung gewaschen und
schließlich mit dem für die Chromatographie gewünschten Puffer equilibriert
Die Fixierungskapazität für Proteine liegt zwischen 40 und 200 mg pro Gramm Trägermaterial unter den
Chromatographiebedingungen. Für die Oberflächen des porösen Ausgangsträgers von 10 bis 80m2/g bleibt
diese Kapazität nahezu konstant.
Direkte Reinigung von ^-Globulinen aus menschlichem oder tierischem Serum oder
Plasma — Schema eines Zyklus über 50 g Trägermaterial, das nach den obigen
Beispielen 1,2 oder 3 hergestellt worden ist
- Equilibrierung der Säule auf z. B. pH 6,8 (zwischen 6,3 und 8) (PCVPuffer, 0,01 bis 0,02molar oder TRlS-HCl-Puffer,
0,05molar oder NaCl 1 bis ? g/l) mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml/cm2/Std.
— Einführung von 50 ml Plasma oder Serum, das vorher gegen den Chromatographiepuffer dialysiert und
dann filtriert worden ist, um jede Möglichkeit einer Anhäufung auszuschließen. (Mittlere Durchsatzgeschwindigkeit
50 bis 100 ml/cm2/Std.). Für ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Trägermaterial muß die
Serum- oder Plasmamenge pro Zyklus auf 25 ml zurückgeführt werden.
— Waschen der Säule mit dem Chromatographiepuffer.
— Sammlung des Peak-Ablaufs, der aus ^-Globulinen besteht, die sich bei der Immunoelektrophorese als rein
erweisen, in einer Ausbeute von 50 bis 100% je nach dem verwendeten Puffer. Die Ausbeute ist besser bei
Ph-Werten, die niedriger als Dh 6.8 sind oder bei denen die lonenkräfte am stärksten sind, aber es besteht
dabei die Gefahr, daß die Reinheit weniger gut ist. Ein solches ^-Globulin-Präparat ist frei von pyrogenen f
Substanzen und von Antigenen, die mit dem Hepatitisvirus B vergesellschaftet sind (Ag HB,), die gegebe- f
nenfalls in den rohen Ausgangsstoffen vorhanden sind. *:
— Eluierung der auf der Säule zurückgehaltenen anderen Proteine mittels irgendeines Puffers vom ph 4 oder I
mittels des Chromatographiepuffers, der mit 10 bis 60 g/l NaCl versetzt worden ist, oder schließlich mittels ϊ
eines Citratpuffers, 0,05molar, ph 4 bis 8. Die Dauer dieses Zyklus beträgt etwa 2 Stunden, und unmittelbar ,;
anschließend kann dann ein neuer Zyklus durchgeführt werden, und zwar so leicht, daß mit Hilfe eines recht |
einfachen Automatismus etwa 10 Zyklen am gleichen Tag durchgeführt werden können bei einem Behänd- |
lungs-Durchsatz von nahezu 101 Serum oder Plasma pro kg poröses mineralisches Oxid und pro Tag.
Eliminierung des Hämoglobins beim Verfahren der Reinigung von Albumin aus
Plazentarblut und Konzentration der anderen Proteine
Plazentarblut und Konzentration der anderen Proteine
Die Fraktionierung des Plazentarbluts mittels Alkohol nach der Methode von Cohn verläuft über eine Stufe
der Fällung der Block-Globuline bei ph 6,8 und 20 bis 25% Äthanol. Unter diesen Bedingungen bleiben das
Albumin, bestimmte ^1. und «2-Globuline und das Hämoglobin im wesentlichen in Lösung in der überstehenden
Flüssigkeit. Diese wird durch Zentrifugieren in der Kälte gesammelt, mit dem gleichen Volumen destillierten
Wassers verdünnt (um die Alkoholkonzentration zu verringern), auf ein ph von 6 bis 7 eingestellt und durch
Filtrieren über eine Celluloseester-Membran geklärt.
Schema eines Reinigungszyklus über 50 g Trägermaterial
(Es sind 100 g Trägermaterial erforderlich, wenn es sich um das gemäß Beispiel 1
hergestellte Material handelt)
— Equilibrierung der Säule im PO4-Puffer, 0,01 molar, oder TRIS-HCl, 0,05molar, ρκ 6 bis 7 (vorzugsweise 6,5),
mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml/cm2/Std.
— Einführung von 1000 ml der zu reinigenden, vorerwähnten Lösung mit einer mittleren Durchsatzgeschwindigkeit
von 100 ml/cm2/Std.
— Waschen der Säule mit dem Chromatographiepuffer mit gleicher Durchsatzgeschwindigkeit Das gereinigte
Hämoglobin tritt aus der Säule mit einem zu vernachlässigenden Verdünnungsfaktor aus, da die anderen
Proteine, darunter das Albumin, auf der Säule fixiert bleiben.
— Eluierung der auf der Säule fixierten Proteine unter Bedingungen, die den in Beispiel 4 angegebenen
entsprechen, wobei der Peak die konzentrierten Proteine enthält und praktisch frei von Hämoglobin ist
— Die Zyklusdauer beträgt ungefähr 4 Stunden, und unmittelbar anschließend kann dann ein neuer Zyklus
durchgeführt werden.
Konzentration einer verdünnien Lösung von Proteinen in alkoholischem Medium und
Eliminierung des Alkohols
Die Fraktionierung von Proteinen nach der Methode von Cohn ist unvermeidbar begleitet von verschiedenen
Stufen der Wiederauflösung von Alkohol-Fällungen. Aus diesem Grunde ist es empfehlenswert, die Fällung
stark zu verdünnen, um den Gehalt an Restalkohol, der verblieben ist, herabzusetzen. Es ergibt sich so die
Notwendigkeit, einerseits den Alkohol zu eliminieren und andererseits die vorhandenen Proteine zu konzentrieren.
Dies wird in der Regel durch Konzentration im Vakuum, Gefriertrocknung oder Dialyse bewerkstelligt, und
da diese beiden letztgenannten Stufen sehr beschwerlich bzw. lästig sind oder die Quelle für den Eintritt von
Pyrogencn darstellen, wird hier das folgende Verfahren vorgeschlagen, das außergewöhnlich bequem, schnell
und wirtschaftlich durchführbar ist.
Als Beispiel dient eine Albuminlösung von 2%, die 10% Alkohol enthält.
Als Beispiel dient eine Albuminlösung von 2%, die 10% Alkohol enthält.
Schema eines Reinigungs- und Konzentrierungs-Zyklus auf 1 kg Trägermaterial
(hergestellt gemäß Beispiel 2 oder 3; im Falle des Beispiels 1 ist es angezeigt,
(hergestellt gemäß Beispiel 2 oder 3; im Falle des Beispiels 1 ist es angezeigt,
Si die Trägermenge, die erforderlich ist, zu verdoppeln);
I seine Dauer beträgt rund 4 Stunden
1 (1) Equilibrierung des Trägers im Phosphatpuffer, 0,01 molar, pH 7 — Durchsatzgeschwindigkeit 200 ml/
jj cm2/Std.
ff (2) Einspeisung der alkoholischen Albuminlösung, deren p» auf den Wert 7 durch Zugabe von HCl oder NaOH
ι — je nach dem Ausgangs-pH — eingestellt worden ist.
K Mittlere Durchsatzgeschwindigkeit 100 ml/cm2/Std.
;; Auf diese Weise ist es möglich, 200 g Albumin auf dieser Säule zu fixieren (etwa 10 1 Lösung/Zyklus), und
|3 falls das Albumin auf der Säule schlecht fixiert wird, genügt es, die Ausgangslösung stärker mit destilliertem
^ Wasser zu verdünnen, um so die lonenstärke des Mediums herabzusetzen.
!) (3) Waschen mit destilliertem Wasser; Durchsatzgeschwindigkeit 200 ml/cm2/Std. und Prüfung, ob das Albu-
{:; min nicht austritt, sondern im Gegenteil der Alkohol den Ablauf beendet.
'§ (4) Eluierung des Albumins in einer der folgenden Pufferlösungen: NaCl, 0,1 molar oder Citratpuffer, 0,05molar,
■ i Ph 6,8. Man erhält in der Regel End-Konzentrationen an Albumin von ungefähr 10 bis 20%, die Eliminie-
I rung des Alkohols ist vollständig erfolgt und die Ausbeute der Operation beträgt nahezu 100%. Dieses
£ Verfahren ist auf jedes Protein anwendbar, dessen isoelektrischer Punkt unter 6,5 liegt. Für Proteine, deren
y isoelektrischer Punkt höher liegt, würde die Methode unter der Voraussetzung anwendbar sein, daß man
ϊ< das Ph des Chromatographiepuffers erhöht Schließlich ist auch offensichtlich, daß jede in diesen Proteinlö-
^ sungen vorhandene Verunreinigung auf diese Weise eliminiert werden kann, vorausgesetzt daß sie elek-
'i trisch neutral ist (Kohlenhydrate und Polysaccharide) oder in gleicher Weise wie der Träger (Kationen)
I positiv geladen ist In dem Fall, in dem die Verunreinigungen negativ geladen sind, kann es auf dem Träger
i zu einer Konkurrenz mit den negativen Proteinen, die man zu fixieren wünscht, kommen. In diesem Fall ist
■~ es dann, wenn die Affinität der Verunreinigung zum Träger schwächer als die des Proteins ist und wenn die
i Lösung hinreichend mit Wasser verdünnt werden kann, um eine lonenstärke zu erhalten, die mit der
I Fixierung des Proteins auf dem Träger vereinbar ist, dennoch möglich, sogar die Anionen zu eliminieren.
S Das nachstehende Beispiel erläutert eine solche Trennung.
I Beispiel7
I Konzentrierung und Reinigung von Albumin in einer Lösung von Natriumcapryiat
I Außergewöhnlich interessante Fraktioniermethoden verwenden das Natriumcapryiat zur Koaguiierung aller
t Proteine mit der alleinigen Ausnahme des Albumins, das also in Lösung in Gegenwart des Caprylats bleibt. Als
I Beispiel wird von einer Lösung ausgegangen, die 15 g/l Albumin und 3 g/l Caprylat enthält
I Schema eines Zyklus auf 1 kg Trägermaterial
I (hergestellt gemäß den Beispielen 2 oder 3; im Fall des Beispiels 1 muß
I man die erforderliche Trägermenge verdoppeln)
I (1) Equilibrierung des Trägers im Phosphatpuffer, 0,01 molar, ph6. — Durchsatzgeschwindigkeit 200 ml/
cm2/Std.
! (2) Einführung der Albumin- und Caprylatlösung, die selbst auf ph 6 eingestellt ist (im Fall zu stark erhöhter
lonenkräfte wird mit Wasser verdünnt). Die mittlere Durchsatzgeschwindigkeit beträgt ίϋΟ ml/cm2/Std.
Es können ungefähr 81 Lösung auf die Säule aufgegeben werden. Es ist leicht, die Fixierung festzustellen
und den kontinuierlichen Austritt des Natriumcaprylats zu beobachten (starker Geruch nach Ziege).
(3) Waschen der Säule mit dem Chromatographiepuffer, bis nichts mehr aus der Säule austritt
(4) Eluierung des Albumins nach der gleichen Methode wie in den vorangehenden Anwendungsbeispielen.
Man erhält eine Lösung von 10 bis 20% Albumin, die — auf 20% gebracht — zum Schluß weniger als 2$ g/l
Natriumcapryiat enthält Die Gesamtdauer des Zyklus beträgt ungefähr 4 Stunden.
Es ist offensichtlich, daß diese Methode verallgemeinert werden kann zur Reinigung und Konzentrierung von
zahlreichen biologischen Molekülen, die bei bestimmten pH-Werten negativ geladen sind (Nucleinsäuren, Proteine,
anionische Polysaccharide, anionische Glykolipoide). Um zu veranschaulichen, daß diese Verallgemeinerung
praktisch möglich ist und daß eine solche Säule demgemäß die Passage von Flüssigkeiten mit sehr verschiedenen
Polaritäten zuläßt, wird das folgende Anwendungsbeispiel angeführt
Beispiel 8
Konzentrierung und Reinigung von Gangliosiden aus wäßrigen Extrakten von Tierhirnen
Konzentrierung und Reinigung von Gangliosiden aus wäßrigen Extrakten von Tierhirnen
Die Ganglioside stellen Glykolipoide dar, an denen die Biochemiker derzeit die extrem wichtige physiologische
oder pathologische Rolle studieren, die sie auf der Ebene der Zellmembranen, und zwar als Rezeptor und
Z.KJ
Effektor, spielen. Sie enthalten mehr oder weniger Sialinsäure und sind aufgrund des Gehalts hieran negativ
geladen oberhalb eines Ph von ungefähr 3.
Aus ungefähr 1 kg Kalbshirn kann man einen wäßrigen Extrakt von etwa 7 1 erhalten (und zwar nach einem
Verfahren, das in einer Arbeit von L SVENNERHOLM »Gangliosides, isolation« in »Methods in carbohydrate
chemistry«, Band 6, Herausgeber R. L Whister und J. N. Bemiller, Acad: Press New York 1972, beschrieben ist).
Dieser wäßrige Extrakt wird direkt auf eine Säule aufgegeben, die 50 g eines Trägermaterials enthält, das
gemäß Beispiel 3 hergestellt und vorher in einem TRIS-HCI-Puffer, 0,05molar, pH 6,8, equilibriert worden ist. Die
Durchsatzgeschwindigkeit beträgt 200 ml/cm2/Std. Unter diesen Bedingungen werden alle Ganglioside auf der
Säule festgehalten. Eine vorangehende Wäsche mit den folgenden Lösungen in der angegebenen Reihenfolge:
TRIS-HCI-Puffer, 0,05molar, pH 6,8
0,1 -n NaOH
H2O
Chloroform-Methanol-Wasser im Volumenverhältnis von 30 :60 :25
ermöglicht die Eliminierung der zahlreichen Verunreinigungen.
Die Eluierung der Ganglioside in konzentrierter Form und in gereinigter Form wird dann mit dem Gern: ich
aus Chloroform, Methanol und 0,1-n HCl im Volumenverhältnis von 30 :60 :25 mit der gleichen Durchsatzgeschwindigkeit
durchgeführt ■
Gleich nach der Eiution wird der gesammelte renk uuicii Zusatz von 0,1-n NaOK neutralisiert, eingedampft I
und zur Analyse wieder in einem geeigneten Chromatographiesystem aufgenommen. Die Ausbeute beträgt
100%. kiS ist bemerkenswert festzustellen, daß die Säule ohne jede nachteilige Folge von einem organischen
Lösungsmittel und dann von einer wäßrigen Lösung und auch umgekehrt durchlaufen werden kann. Dies kann
gegebenenfalls für bestimmte Reinigungsoperationen oder zur Aufrechterhaltung von sterilen Bedingungen in
der Säule technisch ausgenutzt werden.
Verwendung des erfindungsgemäßen Materials als Träger für das Tetanus-Anatoxin
zwecks Reinigung und Konzentrierung von Antitetanus-Antikörpern
zwecks Reinigung und Konzentrierung von Antitetanus-Antikörpern
Die in den vorangehenden Anwendungsbeispielen offenbarte erhöhte Kapazität der Fixierung von Proteinen
kann mit Vorteil dazu ausgenutzt werden, um das Tetanus-Anatoxin auf einer Säule des porösen mineralischen
Trägermaterials zu immobilisieren. Beispielsweise werden 10 g Spherosil XOC 005 (spezifische Oberfläche
10m2/g) mit DEAE Dextran gemäß Beispiel 1 imprägniert und mit einem Phosphatpuffer, 0,01 molar, Ph 6,8,
equilibriert Daneben werden 25 ml Tetanus-Anatoxin (mit einem biologischen Titer von rund 1500Lf oder
Ausflockungseinheiten mit dem gleichen Puffer auf 250 ml verdünnt und kontinuierlich auf die Säule aufgegeben.
Zu Beginn der Passage erfolgt die Fixierung des Tetanus-A.natosins quantitativ und es ist keine Spur davon
am Säulenausgang mittels der geeigneten immunologischen Methoden nachweisbar bis zu ungefähhr 200 ml
Eluat Die letzten 50 ml werden trotz allem eingespeist, um sicher zu sein. Daß ι lan einen gleichmäßigen und
vollständigen Oberzug mit dem Tetanus-Anatoxin erzielt hat Danach wird die Säule mit dem Chromatographiepuffer
gespült Es ist dann möglich, das Tetanus-Anatoxin definitiv zu immobilisieren, indem man es derart
vernetzt, daß es in einem ziemlich großen pH-Bereich (ph 2 bis 12) nicht mehr eluiert werden kann.
Die Vernetzung erfolgt durch ein 2stündiges ständiges Zirkulierenlassen von 100 ml einer 0,5%igep Lösung
von Glutaraldehyd in einem Phosphatpuffer, 0,01 molar, pH 6,8, mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von ungefähr^
ml/cm2/Std. bei Raumtemperatur.
Danach wird die Säule mit den folgenden Puffern nacheinander gespült:
Phosphat, 0,01 molar, ph 6,8
GlykokoU, O^molar, pH 8,2
GlykokoU, O^molar, pH 8,2
GlykokolL O^molar, pH 7,2 (mit und ohne NaCl, 60 g/l)
Citrat 0,05molar, pH 2,8
Schluß-Rücklauf und Konservierung in GlykokoU, 0,2molar, pH 7,2.
Die Säule ist dann zum Gebrauch fertig und mit ihr können zahlreiche identische Reinigungszyklen durchgeführt
werden. Es sind so mehrere Dutzend von aufeinanderfolgenden Zyklen mit der gleichen Säule durchgeführt
worden, wobei alle Eigenschaften derselben beibehalten worden sind.
Schema eines Reinigungszyklus für eine solche Säule von 10 g
Es werden 1,51 einer Lösung von ^-Glubolinen oder Seren oder Plasmen, die auf die folgenden Konzentrationen
GlykokoU 15 g/l
NaCl
NaCl
Ph 72
eingestellt ist und einen Antitetanus-Antikörper-Titer von ungefähr 5 internationalen Einheiten (U.I.) pro ml
aufweist, auf die Säule mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 40 mI/cm2/Std bei der Labortemperatur aufgegeben.
Mindestens 5% der Antitetanus-Antikörper sind am Säulenausgang mittels der zweckentsprechenden
immunologischen Methoden erst dann nachweisbar, wenn alle anderen Proteine die Säule durchlaufen haben.
Die Säule wird sodann mit dem Glykokollpuffer, 0,2molar, pn 7,2, mit einem NaCI-Gehalt von 60 g/l gespült,
danach mit dem gleichen Puffer ohne NaCI-Gehalt gespült, bis das Säulen-Eluat Ultraviolettlicht von 280 nm
nicht mehr signifikant absorbiert Jeder Puffer wird ungefähr 15 Minuten mit einer Durchsatzgeschwindigkeit
von 200 ml/cm2/Std. angewendet
Die Eluierung der auf der Anatoxin-Säule fixierten Antitetanus-Antikörper wird dann vermittels Aufgabe
eines Trinatriumcitrat-Citronensäure-Puffers, 0,05molar, Ph2,8, bei 20° C mit einer Durchsatzgeschwindigkeit
»on 40 ml/cm2/Std. durchgeführt
Das Eluat der Säule wird in einer gekühlten Vorlage gesammelt und durch ständigen Zusatz von normaler
Sodalösung, der von einem pH-Meßgerät gesteuert wird, sofort auf pn 7 neutralisiert Sowie der Elutions-Peak
eluiert ist (Ablesung der Absorption bei 280 nm), wird die Säule in dem anfänglich benutzten GlykokoUpuffer
erneut equilibriert, und es kann unmittelbar danach ein neuer Zyklus durchgeführt werden. Die Lösung der
gereinigten Antitetanus-Antikörper kann mittels klassischer Methoden (Ultrafiltration, Fällung mit Polyäthylenglykol.
Alkohol oder Ammonsulfat) konzentriert werden. Die mittlere Aktivität der Lösungen der so gereinigten
Antitetanus-Antikörper beträgt 30 bis 100 internationale Einheiten pro mg Protein. Die Ausbeute an Antitetanus-Antikörpern
schwankt zwischen 20 und 100%.
Bei genauer Befolgung der Arbeitsvorschrift des Beispiels 9 ist es möglich, verschiedene Antigene oder
Antikörper, wie sie in der vorangehenden Beschreibung aufgezählt sind, zu immobilisieren.
Für bestimmte Antigene, deren iscelektrischer Punkt über p« 6 liegt, ist es empfehlenswert die Stufe der
Fixierung auf der Säule in einem Phosphatpuffer, 0,01 molar, ph 8, anstatt in einem solchen vom p« 6,8 durchzuführen.
Es kann sogar empfehlenswert sein, die Phoiphationen durch Chlorionen zu ersetzen, indem man eine
Natriumchloridlösung, 0,01 - bis 0,05molar, beim gleichen Ph von 8 verwendet Eine weitere Lösung des Problems
würde darin bestehen, erfindungsgemäße, stark ionisierte, quaternäre Austauscher bei ph 8 zu verwenden. Dies
ist vornehmlich der Fall bei Proteinen mit einer Antikörper-Aktivität vom Typ βλ, y\ oder yi, wie sie in den
gängigen Tierarten (Ziege, Schaf, Kaninchen, Pferd, Meerschweinchen etc.) oder beim Menschen vorkommen.
Zu 10 g SiOs vom Porendurchmesser 125 nm, die mit DEAE Dextran nach der Arbeitsvorschrift eines der
Beispiele 1 bis 2 oder 3 imprägniert worden sind, gibt man 30 ml einer 0,l%igen Lösung von Butandiol-diglycidylather,
verdampft dann das Lösungsmittel innerhalb von 30 Minuten bei 8O0C und setzt schließlich eine
Lösung von Lysin in Wasser vom ph 11,5 zu (30 ml; l%ig). Das Ganze wird dann 15 Stunden auf 80°C gehalten.
Das erhaltene Material wird in eine Säule gegeben und mit einem Citratpuffer, 0,05molar, ph 6,8, gewaschen.
Anhand einer Gegenüberstellung mit Vergleichsträgern (die nicht mit einem Kupplungsmittel behandelt worden
sind) kann leicht gezeigt werden, daß ein hoher Prozentsatz Lysin definitiv an das DEAE Dextran-imprägnierte
Trägermaterial gekuppelt worden ist (zu einer solchen Feststellung werden die Farbreaktionen mit Ninhydrin
herangezogen).
Mit Hilfe einer solchen Säule, die aus dem mit Lysin überzogenen Material gebildet wurde, ist es möglich,
unter ausgezeichneten Bedingungen die Reinigung oder Isolierung des Piasminogens oder Plasmins praktisch
durchzuführen, d. h. von Blutproteinen, die eine große Affinität zum Lysin aufweisen.
Claims (3)
1. Verwendung eines Materials, bestehend aus einem porösen mineralischen Oxid, dessen Oberfläche
direkt mit einem aminierten Polysaccharidpolymeren überzogen ist, zur chromatographischen Reinigung
oder Trennung von biologischen Makromolekülen.
2. Verwendung des Materials nach Anspruch 1, wobei das Oxid eine-innere Oberfläche von 100 m2/g oder
weniger und einen Pctrendurchmesser von 25 nm oder mehr aufweist und wobei das aminierte Polysaccharidpolymere
wasserlöslich ist und ein Molekulargewicht von 105 bis 106 Dalton aufweist
3. Verwendung des Materials nach Anspruch 1 oder 2 zur Reinigung von ^-Globulinen aus menschlichen
ίο oder tierischen Seren oder Plasmen.
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DE2633246C2 true DE2633246C2 (de) | 1985-09-05 |
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