DE3813123A1 - Chromatographie von polyfunktionellen substanzen - Google Patents

Chromatographie von polyfunktionellen substanzen

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Description

Die Erfindung betrifft die präparative und analytische Chromatographie von Gemischen, die polyfunktionellen Sub­ stanzen enthalten.
Viele polyfunktionelle Naturstoffe oder synthetische Sub­ stanzen werden aus Substanzgemischen durch Chromatographie isoliert oder durch Chromatographie gereinigt. Als beson­ ders leistungsfähig hat sich dabei die HPLC erwiesen. In der HPLC benötigt man jedoch wegen der auftretenden hohen Drücke druckstabile stationäre Phasen. Diese hohe Drucksta­ bilität sowie eine für die Chromatographie wichtige defi­ nierte Porenverteilung besitzt das Kieselgel. Dieses hat aber eine sehr polare Oberfläche, die sich z.B. zur Chroma­ tographie von polyfunktionellen Substanzen nicht eignet. Man muß also in diesen Fällen die Oberfläche des Kieselgels in geeigneter Weise modifizieren. Entsprechendes gilt für die Materialien TiO2 und Al₂O₃.
Bekannt ist die chemische Modifizierung über Silizium-Koh­ lenstoff-Bindungen, Silizium-Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindun­ gen oder ähnliche chemische Bindungen, die dynamische Modi­ fizierung (Zusatz der Modifizierungssubstanz zum Laufmit­ tel) durch Amine und die Modifizierung durch polymere Ami­ ne.
Bei großen polyfunktionellen Molekülen hat man jedoch auch mit den bekannten modifizierten Kieselgelen erhebliche Schwierigkeiten, eine irreversible Adsorption zu vermeiden. Dies kommt unter anderem daher, daß die chemischen Modifi­ zierungen oft nicht vollständig oder nicht stabil sind. Kommt das polyfunktionelle Molekül in Kontakt mit einer unmodifizierten Stelle des Kieselgels, findet eine sehr feste Adsorption statt. Die Adsorption ist um so größer, je mehr polare Gruppen das polyfunktionelle Molekül besitzt.
Bei der Modifizierung durch polymere Amine treten die sel­ ben Schwierigkeiten wie bei den chemisch modifizierten stationären Phasen auf. Hier kommt als weiterer Nachteil noch die Alterung der polymeren Beschichtungssubstanzen sowie der Einfluß der oftmals in die polymeren Ketten eingebauten Startermoleküle auf die chromatographischen Eigenschaften hinzu. Außerdem sind die Molekülgrößen der Polymere sehr breit gestreut, was zu unterschiedlichem Adsorptionsverhalten der Beschichtungsmoleküle führt.
Verwendet man bei der dynamischen Modifizierung kleine Modifizierungsmoleküle, so werden diese leicht von den polyfunktionellen Molekülen verdrängt. Bei großen, besser haftenden Modifizierungsmolekülen kann es vorkommen, daß sie nicht in alle Poren eindringen können, in die die zu chromatographierenden Substanzen gelangen. An diese Stellen findet dann eine stärkere - teilweise irreversible - Ad­ sorption statt. Unter diesen Bedingungen ist es besonders schwierig, Substanzen zu chromatographieren, die sich nur geringfügig - z.B. durch sterische Isomerie - unterschei­ den.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Chromatogra­ phie von polyfunktionellen Substanzen und von stereoisome­ ren Substanzgemischen an Kieselgel auf einfache Weise zu ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von einer der zu chromatographierenden Substanzen oder einer Mischung der zu chromatographierenden Substanzen als Beschichtungssub­ stanz.
Liegt eine polyfunktionelle Substanz vor, die mit geringen Mengen einer ähnlich gebauten anderen Substanz verunreinigt ist, so wird die polare stationäre Phase - z.B. das Kiesel­ gel - mit dieser Substanz modifiziert, indem man eine kon­ zentrierte Lösung dieser Substanz durch die mit der polaren stationären Phase gefüllte Chromatographiesäule fließen läßt. Die Menge der Modifizierungssubstanz sollte minde­ stens etwa 0,01% der Menge der polaren stationären Phase betragen. Durch Spülen mit Laufmittel wird die stationäre Phase anschließend vom Überschuß an Modifizierungssubstanz befreit.
Im einfachsten Fall kann man natürlich das Kieselgel oder eine der anderen stationären Phasen auf die selbe Weise mit einen reinen Komponente modifizieren.
Bei der Synthese von Naturstoffen entstehen in der Regel Gemische der verschiedenen Stereoisomeren. Hat man eine kleine Menge eines Stereoisomeren dieses Naturstoffs vor­ liegen und ist der Naturstoff ausreichend polar, so kann man damit die polare stationäre Phase in der beschriebenen Weise modifizieren. An dieser Schicht der einen reinen stereoisomeren Form kann man nun das synthetische Gemisch chromatographieren.
Die Vorteile der Erfindung liegen in der vollständigen Modifizierung aller von den zu chromatographierenden Sub­ stanzen zu erreichenden Stellen der stationären Phase trotz der maximalen Größe der polyfunktionellen Modifizierungsmo­ leküle. Durch ihre Größe haften diese Moleküle sehr gut an der Oberfläche. Da sie die gleiche oder mindestens eine ähnliche Größe wie die zu chromatographierenden Moleküle haben, erreichen sie außerdem genau alle Hohlräume der stationären Phase, die auch die zu chromatographierenden Moleküle erreichen.
Als Ausführungsbeispiel sei die Chromatographie von Hämo­ globin an mit Hämoglobin modifiziertem Kieselgel genannt. Dazu wurde eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 4,6×250 mm mit Kieselgel gefüllt und das Kieselgel an­ schließend 40 min mit Wasser gespült. Danach wurden 0,04 ml einer Lösung von 0,2 g gefriergetrocknetem Hämoglobin in Phosphatpuffer D6A auf die Säule gegeben, wobei der Phos­ phatpuffer D6A aus einer Lösung von 7,58 g NaH₂PO₄ × H₂O, 1,96 g Na₂HPO₄ und 1,07 g KCN in einem Liter Wasser be­ steht. Die Chromatographietests erfolgten mit Lösungen von Hämoglobin in Phosphatpuffer D6A, während als Laufmittel Wasser verwendet wurde. Es wurde eine Aufspaltung der Hämo­ globinproben in zwei Bestandteile erreicht.

Claims (5)

1. Chromatographie von Gemischen, die eine oder mehrere polyfunktionelle Substanzen enthalten, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als stationäre Phase ein mit einer oder einer Mischung dieser Substanzen beschichtetes polares Material verwendet wird.
2. Chromatographie von Gemischen, die eine oder mehrere polyfunktionelle Substanzen enthalten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als polares Material Kie­ selgel, TiO₂ oder Al₂O₃ verwendet wird.
3. Chromatographie von Gemischen, die eine oder mehrere polyfunktionelle Substanzen enthalten nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschich­ tungssubstanz eine der möglichen stereoisomeren Formen dieser Substanzen darstellt.
4. Chromatographie von Gemischen, die eine oder mehrere polyfunktionelle Substanzen enthalten nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtungssubstanz nicht in dem zu chromatographierenden Gemisch enthal­ ten ist, aber gleiche oder ähnliche chromatographische Eigenschaften und eine gleiche oder ähnliche Molekül­ größe wie die zu chromatographierenden polyfunktionel­ len Substanzen besitzt.
5. Chromatographie von Gemischen, die eine oder mehrere polyfunktionelle Substanzen enthalten nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromatogra­ phietechnik die High Performance Liquid Chromatogra­ phie (HPLC) verwendet wird.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2633246C2 (de) * 1975-07-29 1985-09-05 Institut Merieux, Lyon, Rhône Verwendung eines Materials aus einem porösen mineralischen Oxid zur chromatographischen Reinigung oder Trennung von biologischen Makromolekülen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2633246C2 (de) * 1975-07-29 1985-09-05 Institut Merieux, Lyon, Rhône Verwendung eines Materials aus einem porösen mineralischen Oxid zur chromatographischen Reinigung oder Trennung von biologischen Makromolekülen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H.Engelhardt: Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie, Springer Verl. 1977 S.2-3,217-229, S.86-99 *

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