DE112005000772B4

DE112005000772B4 - Flüssigchromatographiereagenz und Verfahren zum Auftrennen von Enantiomeren

Info

Publication number: DE112005000772B4
Application number: DE112005000772.3T
Authority: DE
Inventors: Michael Swartz; Uwe Dieter Neue; Peter G. Alden; Armin Falk-Thilo Wolfram Ferse
Original assignee: Waters Technologies Corp
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2005-04-06
Publication date: 2017-12-28
Anticipated expiration: 2025-04-07
Also published as: GB2427374B; WO2005099855A1; US7628920B2; GB0619491D0; JP4887286B2; GB2427374A; DE112005000772T5; US20100065492A1; JP2007532880A; US20080237130A1

Abstract

Flüssigchromatographiereagenz zum Isolieren eines oder mehrerer Analyten, der/die in einer Probe enthalten ist/sind, umfassend eine wässrige Phase zur Aufnahme der Probe und zur Bildung einer Lösung der Analyten, wobei die wässrige Phase eine chirale mobile Phase der Formel:ist, worin R1-R4 alle unterschiedlich sind und wobei die einzelne R-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, Alkanen, Alkenen, Alkylgruppen, Aryl-, Arylalkyl-, Hydroxylgruppen, Halogenatomen, Estern, Ethern, Alkoholen, gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenwasserstoffen, verzweigten und/oder unverzweigten Kohlenwasserstoffen, Aminen, Amidinen, Amiden, Keton, Aceton, Dienen, Carboxyl-, Sulfhydralgruppen, Sulfaten, Sulfonaten, Schwefel, Enolen und Kombinationen davon.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Auftrennung von Enantiomeren. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden einer chiralen mobilen Phase, die die Auftrennung von Enantiomeren bewirkt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Auftrennung von Enantiomeren wird als eine der schwierigeren Aufgaben, mit denen ein Fachmann auf dem Gebiet der analytischen Chemie konfrontiert wird, angesehen. Chirale Auftrennungen sind eine der am herausforderndsten Arten einer Aufreinigung aufgrund der extremen Ähnlichkeit zwischen den zwei Komponenten in einem razemischen Gemisch. Jede Komponente ist ein Spiegelbild der anderen. Diese chiralen Komponenten zeigen identische physikalische Eigenschaften in nicht chiralen Umgebungen. Als ein Ergebnis wurden herkömmliche Auftrenntechnologien wie Gaschromatographie, Flüssigchromatographie und Kapillarelektrophorese modifiziert, um eine chirale Umgebung bereitzustellen.
Unterschiedliche Ansätze zum Bereitstellen einer chiralen Umgebung wurden versucht. Chirale stationäre Phasen wurden entwickelt. Diese sind Chromatographiesäulen mit chiralen funktionellen Gruppen, die mit den Analyten wechselwirken. Additive können zu einer mobilen Phase zugesetzt werden, was eine mobile Phase erzeugt, die eine chirale Selektivität aufweist. Manchmal werden diese chiralen stationären Phasen zusammen mit einer chiralen mobilen Phase mit gemischten Ergebnissen verwendet. Ein Problem mit einem solchen Ansatz ist die Instabilität der Säule. Zusätzlich können käufliche Additive unerschwinglich sein, insbesondere im analytischen Maßstab.
Chirale Auftrennungen wurden unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken erreicht. Über die letzten 30 Jahre haben Forscher gezeigt, dass chirale Auftrennungen unter Verwendung von Gaschromatographie (GC), Flüssigchromatographie (LC), Gelelektrophorese, Papierelektrophorese und Kapillarelektrophorese (CE) möglich sind. Diese Auftrennungen basieren auf der Fähigkeit der Enantiomere der Probe, unterschiedlich mit einer chiralen Phase wechselzuwirken, die Teil des Auftrennsystems ist.
Die chirale Phase kann auf einer Vielzahl von Wegen verkörpert werden. Bei der Chromatographie ist die chirale Phase herkömmlicherweise Teil der stationären Phase oder der Säule. Sowohl bei der GC als auch bei der LC ist eine große Vielzahl von chiralen Säulen erhältlich. Die Adsorption der Enantiomere durch die stationäre Phase ist die Summe von sowohl achiralen als auch chiralen Wechselwirkungen. Die achiralen Wechselwirkungen können ionische, Wasserstoffbindung und hydrophobe Adsorption beinhalten. Die chiralen Wechselwirkungen leiten sich von der räumlichen Beziehung der achiralen Wechselwirkungen ab. Die Energiedifferenz, die durch diese chirale Wechselwirkung beigesteuert wird, ist die Grundlage für die chirale Auftrennung.
Chromatographische Auftrennungen von razemischen Gemischen und Diastereomeren können unter Verwendung einer enantiomeren, chiralen stationären Phase und eines enantiomeren, chiralen Additivs zur mobilen Phase, das eine stereoisomere Beziehung zu der chiralen stationären Phase aber die entgegengesetzte Chiralität aufweist, durchgeführt werden; vgl. US 5,338,454 A . Verfahren zur Enantiomerentrennung an chiralen Stationärphasen durch Flüssigchromatographie in Kapillarsäulen sind in der DE 44 13 121 A1 beschrieben. Die US 2001/0051703 A1 betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die bei chiralen Auftrennungen von enantiomeren Gemischen verwendbar sind, und insbesondere die Verwendung von polymerisierten chiralen Mizellen bei solchen Auftrennungen. Durch Flüssigchromatographie an chiralen Polysaccharid-Phasen mit rein organischen oder mit wässrigen Eluenten unter Verwendung anionischer Modifier kann man quaternäre Tropasäurealkaloid-Enantiomere trennen; vgl. DE 41 40 861 C2 . Die JP 57-176936 A beschreibt chromatographische Auftrennungen von D- und L-Aminosäuren durch Säulenchromatographie mit reverser Phase, wobei ein chirales Reagenz, das N-(p-Toluolsulfonyl)-L-phenylalanin und CuSO₄·5H₂O umfasst, zu der mobilen Phase gegeben wird.
Die Wirksamkeit der gegenwärtigen Generation von chiralen chromatographischen Systemen ist im Allgemeinen gering, folglich muss die Differenz der freien Energie der Wechselwirkung zwischen dem chiralen Modifizierungsmittel und den Enantiomeren relativ groß sein, um eine adäquate Auflösung zu erreichen. Dieses Erfordernis einer großen Energiedifferenz trägt zu der geringen Wirksamkeit von vielen chiralen HPLC-Systemen (5000 bis 10000 Böden) und den schweifbildenden Peaks, die auf vielen chiralen Säulen beobachtet werden, bei. Dieses Erfordernis einer großen Energiedifferenz verhindert auch, dass chirale HPLC-Säulen allgemein verwendet werden. Gegenwärtig sind chirale HPLC-Säulen für kleine Klassen von Verbindungen selektiv, und so wurden mehr als 50 chirale Phasen kommerzialisiert. In dieser Umgebung ist eine Verfahrensentwicklung hochgradig empirisch und sehr langwierig. Es besteht ein Bedarf zur Erzeugung von Systemen, die größere Klassen von Enantiomeren auftrennen oder eine einfachere Verfahrensentwicklung bereitstellen.
Gegenwärtig besteht ein Bedarf zur Entwicklung von kostenwirksamen chiralen mobilen Phasen, die effektiv die Auftrennung von Enantiomeren bewirken können. Optimalerweise umfassen diese mobilen Phasen chirale Lösungsmittel und nicht lediglich Additive.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Auftrennung von Enantiomeren. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden einer chiralen mobilen Phase, die die Auftrennung von Enantiomeren bewirkt.
Erfindungsgemäß wird ein Auftrennsystem, das eine stationäre Phase und eine chirale mobile Phase umfasst, zum Auftrennen von Analyten, die in einem enantiomeren Gemisch enthalten sind, verwendet. In dieser Ausführungsform kann die stationäre Phase eine herkömmliche Chromatographiesäule sein. In dieser Ausführungsform umfasst die chirale mobile Phase ein chirales Lösungsmittel. In einem Aspekt umfasst die chirale mobile Phase auch ein pufferndes Mittel. In einem Aspekt ist das Auftrennsystem ein Flüssigchromatographiesystem. Das erfindungsgemäße Flüssigchromatographiesystem beinhaltet sowohl Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) als auch Hochdruckkapillarflüssigchromatographie (CapLC).
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren, das ein Auftrennsystem und eine chirale mobile Phase umfasst, zum Auftrennen von Analyten, die in einer enantiomeren Probe enthalten sind, verwendet. In dieser Ausführungsform kann das Auftrennsystem ein Flüssigchromatographiesystem sein. Das System beinhaltet sowohl HPLC als auch CapLC. Das Verfahren beinhaltet ein Verwenden einer chiralen mobilen Phase zusammen mit einer stationären Phase. Die stationäre Phase kann eine herkömmliche Chromatographiesäule sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Chromatogramm, das die Auftrennung der Enantiomere(D, L)-Pseudoephedrin und (D, L)-Ephedrin unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zeigt.
GENAUE BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft die Auftrennung von Enantiomeren. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden einer chiralen mobilen Phase, die die Auftrennung von Enantiomeren bewirkt.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Auftrennsystem, das eine stationäre Phase und eine chirale mobile Phase umfasst, zum Auftrennen von Analyten, die in einem enantiomeren Gemisch enthalten sind, verwendet. In dieser Ausführungsform kann die stationäre Phase eine herkömmliche Chromatographiesäule sein. In dieser Ausführungsform umfasst die chirale mobile Phase ein chirales Lösungsmittel. In einem Aspekt umfasst die chirale mobile Phase auch ein Puffermittel. In einem Aspekt ist das Auftrennsystem ein Flüssigchromatographiesystem. Das erfindungsgemäße Flüssigchromatographiesystem beinhaltet sowohl Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), HPLC mit äußerst und sehr hohem Druck (> 5000 psi bis zu und über 50.000 psi) als auch Hochdruckkapillarflüssigchromatographie (CapLC).
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren, das ein Auftrennsystem und eine chirale mobile Phase umfasst, zum Auftrennen von Analyten, die in einer enantiomeren Probe vorliegen, verwendet. In dieser Ausführungsform kann das Auftrennsystem ein Flüssigchromatographiesystem sein. Dieses System beinhaltet sowohl HPLC als auch CapLC. Das Verfahren beinhaltet ein Verwenden einer chiralen mobilen Phase zusammen mit einer stationären Phase. Die stationäre Phase kann eine herkömmliche Chromatographiesäule sein.
Wenn eine Auftrenntechnologie, insbesondere Flüssigchromatographie, zur chiralen Auftrennung verwendet wird, weist die stationäre Phase (oder Säule) eine chirale Selektivität auf. Jedoch ist eine chirale Selektivität nicht das ausschließliche Gebiet der stationären Phase. Mobile Phasen können eine chirale Selektivität durch das Hinzufügen eines Additivs oder Modifizierungsmittels aufweisen. Vergleiche die US-PS 6,090,250 A , Mazzeo et al.
Die Erfindung betrifft eine mobile Phase, die eine chirale Selektivität aufweist. In einem Aspekt umfasst die mobile Phase ein chirales Lösungsmittel. Dies unterscheidet sich signifikanterweise von herkömmlichen chiralen mobilen Phasen, die ihre chirale Selektivität dadurch erhalten, dass ein chirales Additiv daran angefügt wurde. Erfindungsgemäß weist die mobile Phase selbst eine chirale Selektivität auf. Die mobile Phase kann ein oder mehrere puffernde Mittel, die zum Beibehalten des pH-Werts hinzugefügt werden, aufweisen.
Es gibt einige Vorteile einer Verwendung einer chiralen mobilen Phase im Gegensatz zu einer Verwendung von chiralen Additiven. Zum Beispiel stellt eine Verwendung einer chiralen mobilen Phase eine Empfindlichkeit beim Nachweisen der interessierenden Analyten bereit. Das niedrige Rausch-zu-Signal-Verhältnis fördert eine größere Empfindlichkeit für einen Nachweis. Auch ist typischerweise eine niedrigere Viskosität mit einer Verwendung einer chiralen mobilen Phase assoziiert, was folglich schnellere Flussraten, höheren Durchsatz, bessere Wirksamkeit, höhere Peak-Kapazität und Auflösung ermöglicht. Zusätzlich beinhaltet die Verwendung von chiralen mobilen Phasen einen einzigen Auftrennmechanismus, eine geringere Wechselwirkung, im Vergleich zu einer Verwendung von Additiven, was zu einer besseren Auflösung und Peak-Wirksamkeit führt. Auch sind beide Enantiomere für eine Peak-Reihenfolgeumkehrung verfügbar, was nicht immer der Fall ist, wenn chirale Additive verwendet werden.
Die erfindungsgemäße chirale mobile Phase betrifft ein chirales Molekül der allgemeinen Formel:
worin
R₁-R₄ alle unterschiedlich sind, was ein chirales Zentrum bereitstellt, d. h. C* ist ein asymmetrisches Kohlenstoffatom. Die R-Gruppen können eine Kombination einer jeglichen anderen chemischen Gruppe sein, wiederum mit der Beschränkung, dass das C*-Kohlenstoffatom das einzige chirale Zentrum bleibt. Beispiele für R-Gruppen beinhalten in nicht begrenzender Weise Wasserstoffatom, Alkane, Alkene, Alkylgruppen, z. B. C₁-C₂₄ und größer, Aryl-, Arylalkyl-, Hydroxylgruppen, Halogenatome, Ester, Ether, Alkohole, gesättigte und/oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, verzweigte und/oder unverzweigte Kohlenwasserstoffe, Amine, Amidine, Amide, Keton, Aceton, Diene, Carboxyl-, Sulfhydralgruppen, Sulfate, Sulfonate, Schwefelatom, Enole und ähnliche und Kombinationen davon.
Alle chiralen Verbindungen müssen mindestens ein chirales Zentrum aufweisen. Ein chirales Molekül ist ein Molekül, das eine Ebene von polarisiertem Licht dreht. Ein chirales Molekül ist dadurch definiert, dass es nicht mit seinem Spiegelbild überlagert werden kann. Ein wichtiger erfindungsgemäßer Aspekt besteht darin, dass durch Auswählen von „R”- oder „S”-mobilen Phasen man die Elutionsreihenfolge von chiralen Analyten verändern kann. Die „R”- und „S”-Terminologie betrifft in einfacher Weise, ob eine spezifische molekulare Konfiguration Licht nach rechts bzw. links dreht. Vorzugsweise umfasst die chirale mobile Phase etwa 70% bis etwa 100% „R” oder „S”. Mehr bevorzugt umfasst die chirale mobile Phase etwa 85% bis etwa 100% „R” oder „S”. Noch mehr bevorzugt umfasst die chirale mobile Phase etwa 90% bis etwa 100% „R” oder „S”. Am meisten bevorzugt umfasst die chirale mobile Phase etwa 95% bis etwa 100% „R” oder „S”.
Beispiele für chirale mobile Phasen beinhalten in nicht begrenzender Weise 2-Butanol, 2-Butylamin, 3-Amino-1,2-propandiol, 1-Amino-2-propanol, 2-Amino-1-propanol, 1-Dimethylamino-2-propanol, 1,2-Propandiol, Propylencarbonat, 1,2-Diaminopropandihydrochlorid, 1-Methyl-2-pyrrolidon, Methyl-2-pyrrolidon-5-carboxylat, 1,2-Dichlorpropan, 2-Brompropionsäure, 2-Brompropionitril, 2-Chlorpropionsäure, 2-Chlorpropionitril, Epichlorhydrin, 3-Chlor-2-methylpropionitril, 1-Brom-3-chlor-2-methylpropan, Propylenoxid, 1,2-Propandioldiacetat, 1-Methoxy-2-propanol, 1-Methoxy-2-propanolacetat, 1,2-Diaminopropan, 3-Aminopyrrolidin, 4-Chlor-3-hydroxybutyronitril, 1-Chlor-2-propanol, 2-Chlor-1-propanol, Methyl-2,3-dichlorpropionat, 1,2,4-Butantriol, 1,3-Butandiol, 2,3-Butandiol, β-Hydroxy-γ-butyrolacton, 3-Chlor-2-butanon, 4-Chlormethyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan, 1-Chlor-2-methylbutan, Methyl-2-chlorpropionat und 3-Hydroxypyrrolidin und Kombinationen davon.
Zusätzlich zu dem chiralen Mittel kann die erfindungsgemäße chirale mobile Phase auch ein pufferndes Mittel umfassen. Das puffernde Salz trägt nicht zur chiralen Selektivität der mobilen Phase bei, sondern es stellt eine puffernde Kapazität dafür bereit. Folglich weist die erfindungsgemäße chirale mobile Phase nicht nur eine chirale Selektivität auf, sondern kann auch den pH-Wert über seine puffernde Kapazität beibehalten.
Erfindungsgemäß wird die Flexibilität für eine Auswahl, welche Flüssigchromatographiesäule für chirale Auftrennungen verwendet wird, erhöht. Da die mobile Phase selbst eine chirale Selektivität aufweist, geht die Auswahl von Säulen über chirale Säulen hinaus. Folglich kann der Fachmann Säulen verwenden, die normalerweise mit nicht chiralen Auftrennungen assoziiert sind, z. B. eine C₁₈-reverse Phase-Säule.
Ein entstehendes Gebiet einer chromatographischen Auftrennung und Analyse entwickelt sich um die Verwendung von Kapillarsäulen. Solche Säulen weisen typischerweise Durchmesser in dem Bereich von 30–800 Mikrons an innerem Durchmesser auf. Diese Säulen können mit einem partikulären Packungsmaterial gepackt sein oder bei dem kleinsten Durchmesserbereich kann die stationäre Phase durch die Säulenwand selbst oder eine Beschichtung, die auf die Wand aufgetragen wurde, bereitgestellt werden. Flussraten der mobilen Phase für solche partikulär gepackten Kapillarsäulen können typischerweise von etwa einem Nanoliter pro Minute zu 10 oder mehr Mikrolitern pro Minute reichen. Diese Zahlenangaben stellen eine drei- bis sechsfache Verminderung der Flussrate und folglich eine ähnliche Verminderung des Volumens der Auftrennung im Gegensatz zu demjenigen, was gegenwärtig verwendet wird, zum Beispiel die Säulen mit einem inneren Durchmesser von 4 mm, die weit verbreitet käuflich verfügbar sind, dar.
HPLC-Systeme, die um Kapillarsäulen entwickelt werden, weisen eine spezifische Verwendbarkeit auf, wenn die HPLC-Auftrennung mit einem stromabwärts gelegenen Verfahren gekoppelt ist, das nicht leicht große Mengen an HPLC-mobiler Phase toleriert oder falls die Verwendung von ungewöhnlich teuren mobilen Phasen erwünscht ist. Beispiele solcher Verfahren sind: (1) eine chirale Auftrennung von Enantiomeren, (2) Infrarotspektroskopie, bei der für HPLC verwendete organische Lösungsmittel entfernt werden müssen, da sie eine Beeinträchtigung eines Analytennachweises in dem Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums darstellen, (3) Mikrofraktionssammlung, die erfordert, dass der Analyt in ein kleines Volumen auf einem Sammlungssubstrat mit einer minimalen assoziierten Hintergrundskontamination von der HPLC-mobilen Phase abgeschieden wird, (4) Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR), die von einer signifikanten Signalhintergrundsverminderung durch die Verwendung von in gewisser Weise exotischen mobilen Phasen wie Deuterium-substituierten mobilen Phasen in dem Fall von Protonen-NMR profitieren kann, und (5) Massenspektrometrie, die erfordert, dass die Probe in der Gasphase bei Bedingungen eines sehr verminderten Drucks vor einer Massenanalyse verbleibt.
Im Wesentlichen existieren die gleichen Voraussetzungen für Präzision und Exaktheit einer Lösungsmittelzusammensetzung und Flussratenbereitstellung, wie für eine Chromatographie im größeren Maßstab, aber die Mechanismen zum Steuern einer Zufuhr müssen bei etwa einem 1000stel oder weniger des herkömmlichen Volumenmaßstabs funktionieren. Insbesondere führen die Nicht-Idealheiten einer gegebenen Implementierung, die bei einem wesentlich größeren volumetrischen Maßstab abgetan werden könnten, zu unermesslichen großen Störungen eines Systems des Maßstabs einer Kapillar-HPLC.
Ein Interesse entwickelte sich bei der Fähigkeit, HPLC-Auftrennungen unter Verwendung von Packungsmaterialien mit extrem kleinen Durchmesser, d. h. einem Durchmesser von weniger als 3 Mikrons, mit gleichzeitig hohen mobilem Phasendruck, der benötigt wird, um die Flüssigkeit durch ein mit solchen Packungsmaterialien gefülltes Bett zu treiben, durchzuführen. Verbesserte Auftrenncharakteristika von HPLC werden gezeigt, insbesondere kann entweder die absolute Peak-Kapazität der Auftrennung oder der Durchsatz der Auftrennung, wie in pro Zeiteinheit eluierte Peaks ausgedrückt, durch die korrekte Verwendung von kleinen Packungspartikeln und eines hohen Systemdrucks wesentlich verbessert werden. Die Verwendbarkeit von Partikeln mit einem Durchmesser von so wenig wie einem Mikron und Systemdrücken im Bereich von 10.000 bis 100.000 PSIG wurde gezeigt.
Durch Verwenden solcher Säulen mit kleinem Durchmesser (innerer Durchmesser von 30 bis 75 Mikrons) wird das aktuelle Volumen einer Auftrennung außerordentlich klein unter der Annahme, dass die Flussraten der mobilen Phase typischerweise in dem Bereich von 5 bis 200 Nanolitern pro Minute liegen. Eine Gradientenbildung erfordert, dass die einzelnen Komponenten der mobilen Phase bei Mengen so gering wie 0,1% der gesamten Systemflussrate zugeführt werden. Zusätzlich müssen Pumpen, die einen Hochdruckgradienten bilden, die Komponentenflüsse in einer Weise, die reproduzierbar ist, gegen den gesamten Systembetriebsdruck ohne Schwankungen zuführen. Die vorstehend beschriebenen analytischen Bedingungen beinhalten die Fähigkeit, quantitativ Komponentenflussraten so gering wie 10 Picoliter pro Minute gegen Drücke so hoch wie 100.000 PSIG zuzuführen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Auftrennen von Analyten, die in einer Probe enthalten sind. In einem Aspekt umfassen die Analyten der Probe ein oder mehrere enantiomere Moleküle. Die erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten eine wässrige Phase, die aus einer erfindungsgemäßen chiralen mobilen Phase aufgebaut ist. Die wässrige Phase kann auch ein pufferndes Mittel beinhalten, um eine pH-Steuerung für die wässrige Phase bereitzustellen.
Typischerweise wird die Probe mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril gemischt. Dieses Gemisch wird sodann in ein Mittel für eine Auftrennung eingebracht. Das Mittel für eine Auftrennung beinhaltet in nicht begrenzender Weise eine Flüssigchromatographie, eine Kapillarflüssigchromatographie, eine superkritische Flüssigchromatographie, Gaschromatographie und dergleichen.
Das Mittel für eine Auftrennung wird unter Verwendung einer erfindungsgemäßen chiralen mobilen Phase äquilibriert. Da die Analyten in das Auftrennmittel eingebracht werden, werden sie ein Gemisch mit der mobilen Phase bilden, die das Auftrennsystem durchläuft.
Das Mittel für eine Auftrennung beinhaltet typischerweise eine stationäre Phase, vielleicht in der Form einer Chromatographiesäule. Säulen weisen eine innere Kammer auf, die gewöhnlich eine stationäre Phase umfasst, die aus funktionellen chemischen Gruppen aufgebaut ist. Zum Beispiel können diese funktionellen Gruppen eine Alkylgruppe sein, die eine hydrophobe Umgebung bereitstellt, wie in einer C₁₈-Säule. Alle Moleküle weisen ein hydrophobes Profil auf. Typischerweise werden Moleküle mit einem höheren hydrophoben Profil ihrerseits eine höhere Affinität für die hydrophobe Funktionalität der stationären Phase aufweisen. Dies trägt sodann zu der Elutionsreihenfolge von Analyten bei. Jedoch ist, wenn die interessierenden Analyten Enantiomere sind, deren Elutionsprofil auch von der chiralen Selektivität der mobilen Phase abhängig.
Wie die Analyten aus der stationären Phase eluieren, können ein oder mehrere Detektionssysteme verwendet werden, um den eluierten Analyten zu ermitteln. Diese Detektionssysteme beinhalten in nicht begrenzender Weise Massenspektrometrie, Kernmagnetresonanz, Ultraviolett-, Brechungsindex-, Infrarotspektroskopie, Fluoreszenz, Fotodiodenarray, Verdampfungslichtstreuung, Leitfähigkeit und Stickstoff/Schwefel-spezifische Detektoren.
In einem Aspekt kann die Elutionsreihenfolge der Analyten dadurch verändert werden, dass die mobile Phase verändert wird. In einem Aspekt wird die Elutionsreihenfolge von enantiomeren Analyten dadurch verändert, dass die Selektivität der mobilen Phase verändert wird. Zum Beispiel kann eine mobile Phase, die etwa 95% „R” umfasst, verändert werden, um etwa 95% „S” zu umfassen, wodurch die Selektivität der chiralen mobilen Phase verändert wird. Die Fähigkeit zum Verändern der Elutionsreihenfolge durch Verändern der mobilen Phasenzusammensetzung ist wichtig, da es erwünscht ist, dass eine jegliche enantiomere Spurenverunreinigung vor dem oft größeren Peak mit Schweif des entgegengesetzten Enantiomers eluiert, so dass es nachgewiesen und exakter quantifiziert werden kann. Umgekehrt ist es in dem Fall von Peaks mit Front erwünscht, dass das Spurenenantiomer zuletzt eluiert. Dadurch, dass sowohl „R”- als auch „S”-mobile Phasen verfügbar sind, kann die mobile Phase für die gewünschte Elutionsreihenfolge eingestellt werden.
Erfindungsgemäß sind sowohl isokratische als auch Gradientenverfahren eingeschlossen. Bei einem isokratischen Verfahren sind die äquilibrierende und eluierende mobile Phasen gleich und verbleiben konstant über das gesamte Auftrennverfahren. Ein Auftrennverfahren, das ein Gradientenprofil beinhaltet, verwendet zwei oder mehrere mobile Phasen. Zum Beispiel kann eine Probe, die in einem Lösungsmittel wie Methanol enthalten ist, in ein Mittel für eine Auftrennung eingebracht werden und über die Zeit kann eine erfindungsgemäße chirale mobile Phase eingebracht werden und über die Zeit erhöht werden, wodurch das Vorhandensein der chiralen mobilen Phase innerhalb der wässrigen Phase erhöht wird. Es kann auch Kombinationen von isokratischen und Gradientenelutionsprofilen innerhalb eines einzigen Auftrennverfahrens geben. Eine Optimierung des wässrigen Phasenprofils (d. h. isokratisch, Gradient oder eine Kombination davon) kann leicht durch den Fachmann erreicht werden.
BEISPIEL
1 veranschaulicht ein Chromatogramm, das aus der Auftrennung von enantiomeren Molekülen, (d, l)-Pseudoephedrin und (d, l)-Ephedrin, unter Verwendung einer erfindungsgemäßen chiralen mobilen Phase erhalten wurde. Die für diese Auftrennung verwendete Säule war die 3,5 μm, 0,32 mm × 150 mm Xterra RP18-Säule (eine reverse Phase C₁₈-Säule). Die Flussrate wurde auf 5,0 μl/Minute eingestellt. Die Säulentemperatur wurde auf 25°C eingestellt. Das Probenvolumen, das injiziert wurde, betrug 1,0 μl (20 ng). Zwei Lösungsmittel wurden verwendet. Eluent A umfasste 25 mM s-Dodecylcarbonylvalin (s-DDCV) mit 5% THF (pH-Wert von 7,0), und Eluent B war 25 mM s-DDCV mit 5% THF (pH-Wert von 11,0). Ein Gradientenverfahren wurde verwendet, bei dem die Anfangsbedingungen 15% Eluent B waren und über 30 Minuten der Eluent B 85% betrug.
In 1 ist die Auftrennung von zwei enantiomeren Paaren unter Verwendung eines chiralen mobilen Lösungsmittels deutlich erkennbar.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf spezifische Ausführungsformen spezifisch gezeigt und beschrieben wurde, wird vom Fachmann verstanden werden, dass verschiedene Veränderungen hinsichtlich Form und Details darin gemacht werden können, ohne das Wesen und den Umfang der Erfindung, wie durch die angehängten Ansprüche definiert, zu verlassen.

Claims

Flüssigchromatographiereagenz zum Isolieren eines oder mehrerer Analyten, der/die in einer Probe enthalten ist/sind, umfassend eine wässrige Phase zur Aufnahme der Probe und zur Bildung einer Lösung der Analyten, wobei die wässrige Phase eine chirale mobile Phase der Formel:
ist, worin R₁-R₄ alle unterschiedlich sind und wobei die einzelne R-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, Alkanen, Alkenen, Alkylgruppen, Aryl-, Arylalkyl-, Hydroxylgruppen, Halogenatomen, Estern, Ethern, Alkoholen, gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenwasserstoffen, verzweigten und/oder unverzweigten Kohlenwasserstoffen, Aminen, Amidinen, Amiden, Keton, Aceton, Dienen, Carboxyl-, Sulfhydralgruppen, Sulfaten, Sulfonaten, Schwefel, Enolen und Kombinationen davon.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei die Probe zwei oder mehrere enantiomere Analyten aufweist.
Reagenz nach Anspruch 1, das ferner ein pufferndes Mittel umfasst.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei die chirale mobile Phase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Butanol, 2-Butylamin, 3-Amino-1,2-propandiol, 1-Amino-2-propanol, 2-Amino-1-propanol, 1-Dimethylamino-2-propanol, 1,2-Propandiol, Propylencarbonat, 1,2-Diaminopropandihydrochlorid, 1-Methyl-2-pyrrolidon, Methyl-2-pyrrolidon-5-carboxylat, 1,2-Dichlorpropan, 2-Brompropionsäure, 2-Brompropionitril, 2-Chlorpropionsäure, 2-Chlorpropionitril, Epichlorhydrin, 3-Chlor-2-methylpropionitril, 1-Brom-3-chlor-2-methylpropan, Propylenoxid, 1,2-Propandioldiacetat, 1-Methoxy-2-propanol, 1-Methoxy-2-propanolacetat, 1,2-Diaminopropan, 3-Aminopyrrolidin, 4-Chlor-3-hydroxybutyronitril, 1-Chlor-2-propanol, 2-Chlor-1-propanol, Methyl-2,3-dichlorpropionat, 1,2,4-Butantriol, 1,3-Butandiol, 2,3-Butandiol, β-Hydroxy-γ-butyrolacton, 3-Chlor-2-butanon, 4-Chlormethyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan, 1-Chlor-2-methylbutan, Methyl-2-chlorpropionat und 3-Hydroxypyrrolidin.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei die chirale mobile Phase etwa 70% bis etwa 100% von entweder einem „R”- oder „S”-Enantiomer umfasst.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei die chirale mobile Phase etwa 85% bis etwa 100% von entweder einem „R”- oder „S”-Enantiomer umfasst.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei die chirale mobile Phase etwa 90% bis etwa 100% von entweder einem „R”- oder „S”-Enantiomer umfasst.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei die chirale mobile Phase etwa 95% bis etwa 100% von entweder einem „R”- oder „S”-Enantiomer umfasst.
Verfahren zum Auftrennen von Analyten, die in einer Probe enthalten sind, wobei die Probe ein oder mehrere enantiomere Analyten aufweist, umfassend: Bereitstellen eines Reagenzes mit einer chiralen mobilen Phase der Formel:
worin R₁-R₄ alle unterschiedlich sind und wobei die einzelne R-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, Alkanen, Alkenen, Alkylgruppen, Aryl-, Arylalkyl-, Hydroxylgruppen, Halogenatomen, Estern, Ethern, Alkoholen, gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenwasserstoffen, verzweigten und/oder unverzweigten Kohlenwasserstoffen, Aminen, Amidinen, Amiden, Keton, Aceton, Dienen, Carboxyl-, Sulfhydralgruppen, Sulfaten, Sulfonaten, Schwefel, Enolen und Kombinationen davon, Einbringen der Probe in ein Mittel für eine Auftrennung und In-Kontakt-Bringen der Probe mit der chiralen mobilen Phase, was zu einem Gemisch führt.
Verfahren nach Anspruch 9, das ferner den Schritt eines Nachweisens eines oder mehrerer interessierender Analyten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Nachweis unter Verwendung von Massenspektrometrie, Kernmagnetresonanz, Ultraviolett-, Brechungsindex-, Infrarot-Spektroskopie, Fluoreszenz, Fotodiodenarray, Verdampfungslichtstreuung, Leitfähigkeit und Stickstoff/Schwefel-spezifischen Detektoren erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die chirale mobile Phase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Butanol, 2-Butylamin, 3-Amino-1,2-propandiol, 1-Amino-2-propanol, 2-Amino-1-propanol, 1-Dimethylamino-2-propanol, 1,2-Propandiol, Propylencarbonat, 1,2-Diaminopropandihydrochlorid, 1-Methyl-2-pyrrolidon, Methyl-2-pyrrolidon-5-carboxylat, 1,2-Dichlorpropan, 2-Brompropionsäure, 2-Brompropionitril, 2-Chlorpropionsäure, 2-Chlorpropionitril, Epichlorhydrin, 3-Chlor-2-methylpropionitril, 1-Brom-3-chlor-2-methylpropan, Propylenoxid, 1,2-Propandioldiacetat, 1-Methoxy-2-propanol, 1-Methoxy-2-propanolacetat, 1,2-Diaminopropan, 3-Aminopyrrolidin, 4-Chlor-3-hydroxybutyronitril, 1-Chlor-2-propanol, 2-Chlor-1-propanol, Methyl-2,3-dichlorpropionat, 1,2,4-Butantriol, 1,3-Butandiol, 2,3-Butandiol, β-Hydroxy-γ-butyrolacton, 3-Chlor-2-butanon, 4-Chlormethyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan, 1-Chlor-2-methylbutan, Methyl-2-chlorpropionat und 3-Hydroxypyrrolidin.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Analytenelutionsreihenfolge durch Verändern der chiralen mobilen Phase umgedreht wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die wässrige Phase ferner ein pufferndes Mittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mittel für eine Auftrennung ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Flüssigchromatographie und Kapillarflüssigchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei ein isokratisches Elutionsverfahren zur Auftrennung der Analyten verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei ein Gradientenelutionsverfahren zur Auftrennung der Analyten verwendet wird.