DE3329288C2

DE3329288C2 - Chromatographieverfahren und Vorrichtung zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen

Info

Publication number: DE3329288C2
Application number: DE3329288A
Authority: DE
Inventors: Michael Prof Cais; Moshe Dr Shimoni
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 1982-08-15
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2003-08-13
Also published as: SE8304349D0; SE8304349L; IL66551A; IL66551A0; ZA835712B; ES8507354A1; JPS6035257A; BE897508A; NL8302726A; GB2125312A; AU1795583A; IT1194356B; AU568462B2; CH662062A5; SE457606B; IT8322354A1; DE3329288A1; GB8321305D0; CA1214398A; HU196915B

Description

Die Erfindung betrifft ein Chromatographieverfahren zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen, bei dem man einen Kolben, der an seinem Bodenteil mit einem Abdichtelement und der in seinem Inneren mit einem Lösungskanal versehen ist, welcher ein zwischen zwei Sperreinrichtungen gehaltenes Adsorbens enthält in ein Testrohr, in das der Kolben bündig paßt, einsetzt, den Kolben in das Testrohr schiebt und die erhaltene Lösung durch eine am Kopfteil des Kolbens befindliche Ausströmeinrichtung abzieht, sowie eine zur Durchführung dieses Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Mit Chromatographie werden bekanntlich eine Anzahl physikalischer Methoden bezeichnet, die in der Chemie und Biologie zur Trennung und Identifizierung von Gemischen chemischer Verbindungen dienen. Das Prinzip aller dieser Chromatographievarianten liegt darin begründet, ein Gemisch von chemischen Verbindungen einer wiederholten Extraktion mit einer Flüssigkeit oder der Adsorption an einer Feststoffoberfläche zu unterwerfen. Das Gemisch wird physikalisch über eine stationäre Phase (Bett oder Säule) bewegt, bei der es sich entweder um einen Feststoff oder um eine in den Poren eines Feststoffs (der sich in diesem Bett oder dieser Säule befindet) immobilisierte Flüssigkeit handelt. Die Trennung chemischer Verbindungen durch Chromnatographie kann von einer oder mehreren der folgenden physikalisch-chemischen Kräfte Gebrauch machen in Abhängigkeit vom speziellen chromatographischen System:

(a) von Unterschieden in der Adsorption an das poröse Medium, dem sogenannten Sorbens,
(b) von Unterschieden zwischen den relativen Löslichkeiten einer das inerte Medium (die stationäre Phase) überziehenden Flüssigkeit und der als mobile Phase bezeichneten Flüssigkeit, die durch die poröse Säule perkoliert,
(c) von Unterschieden im Ionenaustausch mit dem Sorbens, und
(d) von Unterschieden in der Molekülgröße, wenn die Lösung ein Gel von sehr geringer Teilchengröße durchströmt.

Chromatographie wird auch präparative Chromatographie genannt, wenn sie die zur Isolierung einer Fraktion aus einem Gemisch dient zu deren Weiterverwendung für z. B. Spektroskopie, Identifizierung, Synthese für Forschung oder kommerzielle Zwecke.

Die Originalarbeit über Chromatographie basiert auf Unterschieden in der Adsorption an einem in eine Säule gepackten inerten Material. Die als Verteilungschromatographie bekannte Trennung von Komponenten basiert auf den relativen Löslichkeiten in dem Lösungsmittel, das durch eine Säule geschickt wird. Die bei dieser Chromatographietechnik erhaltene Auflösung hängt vom pH-Wert und der Ionenstärke des Lösungsmittels (der mobilen Phase) und den relativen Löslichkeiten der Bestandteile in den beiden Phasen ab; die verschiedenen Materialien können mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert und die Flüssigkeitsfraktionen können in einer Reihe von Röhrchen gesammelt und anschließend mit Hilfe von chemischen oder physikalischen Methoden analysiert werden. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) und die Papierchromatographie basieren auf Unterschieden zwischen der relativen Adsorption einer Komponente an einem inerten Medium. Bei der TLC besteht die stationäre Phase aus einer dünnen Schicht einer fein verteilten Substanz, die auf ein Blatt oder einen Kunststoffträger oder auf eine Glasplatte aufgebracht ist. Sorbentien, die üblicherweise Verwendung finden und als gebrauchsfertige Platten gehandelt werden, sind z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel (Silicagel®) und Cellulose. Bei der Papierchromatographie kann sich die mobile Phase durch Kapillarkräfte nach oben (sogenannte aufsteigende Chromatographie) oder durch Schwerkraft nach unten (sogenannte absteigende Chromatographie) bewegen.

Die Ionenaustauschchromatographie macht von der Trennung von Molekülen aufgrund ihrer Ionenladung Gebrauch. Das Sorbens oder die stationäre Phase besteht aus einem Polymer mit kovalent gebundenen Ionen. In Kationenaustauscherharzen sind die fest verbundenen Ionen negativ geladen und mit positiven Ionen, die durch elektrostatische Ladungen lose gebunden sind, assoziiert. Die zu trennenden positiv geladenen Substanzen aus einem gemisch werden zuerst an das Sorbens adsorbiert unter Ersatz der in dem Harz vorliegenden Kationen. Die Lösung ist auf einen pH-Wert gepuffert, der die Bindung erleichtert, worauf mit dem gleichen Puffer eluiert wird zur Entfernung der nicht-gebundenen Fraktionen der Lösung. Ein Anionenaustauscher arbeitet in genau der gleichen Weise, außer daß seine kovalent gebundenen Ionen entgegengesetzt geladen sind und dadurch die Anionen aus der Lösung anziehen.

Die auf Unterschieden in der Molekülgröße basierende Trennung erfolgt in der Gelfiltration, die auch als Molekularsiebchromatographie bekannt ist. Diese Methode trennt Moleküle aufgrund ihrer Partikelgröße, wobei allerdings die Form des Moleküls die Filtration bis zu einem gewissen Grad beeinflußt. Die verwendeten Gele liegen in Form von Kügelchen vor, welche ein Netzwerk von Porenöffnungen aufweisen, in denen kleine Moleküle eingeschlossen werden können. Das weitgehende kommerzielle Interesse an Chromatographie im allgemeinen und an der präparativen Flüssigkeitschromatographie im besonderen äußerst sich in der großen Zahl an Publikationen, die verschiedene mikrofeinteilige Säulenpackungen und fertig gepackte Säulen vorschlagen, die zu einer besseren Trennung führen sollen als die auf diesem Gebiet bekannten Adsorbentien.

Aus der DE-OS 31 26 926 ist ein Verfahren der eingangs angesprochenen Art bekannt. Die Trennung von in Lösung befindlicher Verbindungen erfolgt hiermit jedoch in nicht befriedigender Weise.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die angesprochenen Nachteile vermieden werden können.

Erfidnungsgemäß wird dies in dem eingangs angesprochenen Verfahren dadurch erreicht, daß man den Kolben in das Testrohr unter Einführung und Transport eines gewünschten Elutionsmittels durch den Längskanal schiebt, das zuvor durch einen am Boden des Testrohrs angebrachten Mehrwegehahn gedrückt wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich auch gegenüber üblichen Chromatographieverfahren aus, bei denen der Elutionsmittelfluß durch die Schwerkraft bewirkt wird. Es weist eine große Genauigkeit auf und ist sehr schnell. Auch erfordert es weniger Elutionsmittel und ermöglicht den Einsatz eines Adsorbens mit kleinerer Partikelgröße, was eine höhere Empfindlichkeit zur Folge hat.

Durch den Mehrwegehahn können auch verschiedene aufeinanderfolgende Elutionsmittel in das Testrohr eingeführt und weiter durch das Adsorbentienbett zur Erzielung einer gewünschten Fraktionierung geleitet werden. Der Mehrwegehahn ermöglicht das Ansuagen des oder der Elutionsmittel, ferner eignet er sich zur Waschung des Adsorbentienbettes.

Das Abdichtelement gleitet längs den Innenwänden des Testrohrs, wobei es sich in einem guten Kontakt mit diesem Innenwänden befindet und ein bündiges Einpassen des Kolbens in das Testrohr sicherstellt. Das Abdichtelement besteht in der Regel aus Kautschuk oder einem anderen geeigneten Material in Form eines O-Rings mit einer Öffnungsweite, die zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs geeignet ist. Besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung aus Glas, so kann der Schliff der Außenwand des Kolbens in solcher Weise erfolgen, daß er den O-Ring ersetzen kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr flexibel und kann in einer großen Anzahl von Anwendungen mit verschiedenen Ausführungsformen zum Einsatz gelangen, was im Rahmen des Konzepts der vorliegenden Erfindung liegt. Ein Problem, das in jeder Art von Chromatographie existiert, ist das gleichmäßige Aufbringen der Probe auf die Oberfläche des Adsorbensbetts. Wird die Probe direkt durch Schwerkraftfluß aufgebracht, so ist eine gleichmäßige Aufbringung relativ schwierig, da das Bett dazu tendiert, beim Einbringen der Probe aufgewirbelt zu werden. Es ist daher besonders wichtig, die Oberfläche zu schützen, z. B. mit einem Stück Filterpapier. Ein Hersteller von Säulen stattet einige der Säulen mit einer speziellen, Probeapplikator genannten Einrichtung aus, die zum Schutz der Bettoberfläche dient. Bei dieser Einrichtung ist ein dünnes Nylongewebe am Ende eines kurzen Stücks von Perspex-Rohrauskleidung innerhalb des Chromatographierohrs montiert. Eine derartige Einrichtung erhöht selbstverständlich die Ausstattungskosten und hat zusätzlich den Nachteil, daß ihr Vorliegen einen Druck auf den Fluß der Probe ausübt und deren Perkulation durch die Säule verlangsamt. In den meisten Chromatographiesystemen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung gelangt, ist das Problem einer gleichförmigen Aufbringung der Probe stark erleichtert. Bei dem im chromatographischen Bett existierenden dynamischen Fluß wird die Flüssigkeit beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr nach oben gedrückt und es besteht keine Tendenz zur Wirbelbildung aufgrund der Einführung der Probe. Außerdem beschleunigt der in dem System beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr ausgeübte Druck die Fließgeschwindigkeit der Probe. Ein weiterer Weg zur Unterstützung einer gleichmäßigen Aufbringung der Probe besteht darin, oberhalb des Betts ein anderes geeignetes Adsorbens, das von dem im Bett bereits vorliegenden Adsorbens verschieden ist, anzuordnen, das die Aufgabe hat, eine Vorkonzentration der Probe zu bewirken und damit eine enge Bandauflösung zu fördern. Ein typisches Beispiel für ein derartiges geeignetes Adsorbens ist rohes Siliciumdioxid, das sich vom aktiven Siliciumdioxid mit dessen hohen Adsorptionseigenschaften unterscheidet.

Die Partikelgröße und die Teilchengrößenverteilung muß in den meisten üblichen Chromatographieoperationen sorgfältig gesteuert werden. Ein aus kleinen Partikeln bestehendes Bett ergibt in der Regel eine gute Auflösung. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß der zu einer Zonenverbreiterung führende Mechanismus bei der Zunahme der Partikelgröße verstärkt wird. Bei großen Partikeln dauert die Diffusion in die Partikel und aus diesen heraus eine längere Zeit. Das Fließdiagramm in einem Bett aus großen Partikeln ist schlechter und äußert sich in einer stärkeren Wiedervermischung. Andererseits ist der Widerstand gegenüber dem Flüssigkeitsfluß in einem mit großen Partikeln gepackten Bett geringer und die maximl erzielbare Fließrate höher. In üblichen bekannten Chromatographieoperationen muß daher in bezug auf Partikelgröße ein Kompromiß gefunden werden, um unter den erforderlichen Fließbedingungen eine maximale Zonenauflösung zu erzielen. Demgegenüber ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Adsorbens mit kleiner Partikelgröße verwendbar ohne mit den Nachteilen, wie sie bei den bekannten Chromatographiemethoden auftreten, konfrontiert zu sein, da der geringe Druck, der im Innern des Systems ausgeübt wird, den durch die kleine Teilchengröße der Partikel verursachten Widerstand gegenüber der Fließgeschwindigkeit überwindet. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher selbst für kritische Fraktionierungen eingesetzt werden, wo die Verwendung eines feineren Adsorbentienmaterials unumgänglich ist, um die gewünschte Auflösung zu erzielen.

Aus der vorstehend angegebenen DE-OS 31 26 926 ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des dortigen Verfahrens der Massentransfer- und -trennoperationen bekannt.

Wie dort angegeben, besteht diese Vorrichtung aus einem eine Membran aufweisenden Mischerseparator und einem Mischbehälter, in den der Mischerseparator eingeschoben wird. Am Mischerseparator sind Einrichtungen zur Ausbildung einer Lufttasche vorgesehen, um den auf die Membran ausgeübten Druck zu erniedrigen. Während des Betriebs des Mischerseparators wird eine vorbestimmte Menge an Luft in der Lufttasche eingeschlossen, die bei der Kompression als Polster oder Stoßdämpfer wirkt und einen Teil des Drucks aufnimmt, der aus dem Widerstand der Membran gegen die Strömung der Flüssigkeit resultiert. Bei der erfindungsgemäßen Chromatographie ist das Erfordernis nach einer derartigen Lufttasche weniger zwingend als im angegebenen obigen Fall. Für bestimmte Systeme, bei denen relativ hohe Drücke ausgeübt werden, spielt jedoch offensichtlich eine derartige Lufttasche eine wichtige Rolle, da die eingeschlossene Menge an Luft Flüssigkeit, welche im Zwischenraum zwischen den Innnewänden des Testrohres und den Außenwänden des äußersten Endes des Kolbens hochgekrochen ist, in das Testrohr zurückdrückt. Die Menge an Luft, die durch eine derartige Einrichtung am Kolben eingeschlossen wird, hängt von zahlreichen Faktoren ab, z. B. vom Typ der Sperrplatte oder Barriere, den Komponenten des zu trennenden Gemisches und den besonderen Bedingungen, die in dem speziellen Chromatographiesystem auftreten. Ein besonderer Vorteil der Verwendung einer derartigen Lufttasche tritt dann zutage, wenn es erforderlich ist, völlig darauf zu verzichten, das Hochkriechen von Elutionsmittel mit Hilfe eines am Boden des Kolbens angeordneten, als Abdichtelement wirkenden O-Rings zu verhindern.

Das erfindungsgemäßen Verfahren ist auf den verschiedensten Gebieten der Chromatographie mit Erfolg einsetzbar, zum Beispiel bei der Silicagel®-Chromatographie, der Umkehrphasen- Flüssigkeitschromatographie, der Kapillarchromatographie, der Affinitätschromatographie, der Chromato-Fokussierung, der Ausschlußchromatographie (die auch unter dem Namen Gelfiltration bekannt ist) und der Ionenaustauschchromatographie.

Bei der Silicagelchromatographie handelt es sich um eine der üblichsten Chromatographiemethoden. Silicagel® (Kieselgel) ist bei weitem das beste bekannte Adsorbens und dazu im Vergleich mit anderen Adsorptionsmaterialien auch noch relativ billig. Die mit Silicagel® beim erfindungsgemäßen Verfahren erzielbaren Trennergebnisse sind praktisch die gleichen wie bei üblichen Techniken oder sogar noch besser als diese in bezug auf Trenngenauigkeit und Ausbeute an wiedergewonnener Substanz, wobei es sich aber dadurch auszeichnet, daß es einfacher und bequemer ist, weil es schneller arbeitet und weniger Lösungsmittel erfordert. Als besonderer Vorteil kommt auch hinzu, daß die Säulen wiederverwendbar ist. Zusätzlich können auch noch Silicagelpartikel mit kleinerer Teilchengröße und dichtere Packungen Anwendung finden mit den daraus resultierenden Vorteilen eines höheren Trenneffekts.

Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie beruht darauf, daß deren stationäre Phase weniger polar ist als die mobile Phase. Der Hauptnachteil bei Einsatz von Silicagel® beruht darauf, daß nur eine teilweise Wiedergewinnung der durch ein derartiges Bett strömenden Verbindungen gelingt. Im Hinblick auf die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Technik erzielbaren Vorteile kann die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie auch mit Erfolg in der präparativen Chromatographie eingesetzt werden. In jüngster Zeit stieg auch das Interesse an der Kapillarchromatographie, insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von Mikrosäulen für Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Der Grund für diese Entwicklungen liegt in den folgenden Vorteilen dieses Typs von Chromatographie:

(a) Die potentielle Erzielbarkeit einer größeren Trenneffizienz für komplexe Gemische und schwer in Lösung zu bringende gelöste Stoffe.
(b) Eine wesentliche Erniedrigung des Verbrauchs an Elutionsmittel.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für Kapillarchromatographie leichter einsetzbar, wenn in dem zur Anwendung gelangenden Kolben ein enger Kanal vorgesehen wird.

Die Gelfiltration, die auch als Ausschlußchromatographie bekannt ist, gewinnt mehr und mehr Interesse bei der Reinigung von biologischen Substanzen unter Verwendung eines entsprechenden Adsorbens als Trennmedium. Gute Ergebnisse wurden bei der Trennung von markiertem Jod-hCG von markiertem Jod unter Verwendung eines Adsorbens vom Sephadex® G-Typ mit Hilfe der erfindungsgemäßen Chromatographietechnik (vergleiche das unten angegebene Beispiel 3) erhalten. Die Gelfiltration hat sich auch als einfache und rasche Methode zur Entsalzung oder zur Änderung von Puffer erwiesen. Das Gelbett wird zweckmäßigerweise vor der Versuchsdurchführung mit einer Lösung mit der gewünschten Ionenzusammensetzung ins Gleichgewicht gesetzt, z. B. mit destilliertem Wasser im Fall der Entsalzung. Die Elution wird mit der gleichen Flüssigkeit durchgeführt. Im Hinblick auf die dabei auftretenden hohen Fließraten kann die gesamte Operation in kurzer Zeit beendet und das entsalzte Material innerhalb weniger Minuten gesammelt werden. Andere Anwendungsgebiete für mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte Gelfiltration sind die Vorbehandlung vor einer HPLC-Operation und die Konzentrierung verdünnter Proben mit anschließender Trennung.

Die Chromato-Fokussierung findet weite Verbreitung zur Trennung von Proteinen aufgrund ihres isoelektrischen Punktes. Da die Chromato-Fokussierung zu extrem engen Banden an getrenntem Material führt und in der Regel lange enge Säulen erfordert, ist offensichtlich, daß die erfindungsgemäße Chromatographie für diesen Typ von Chromatographie ideal ist, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem engen Kolben ausgestattet wird.

Die erfindungsgemäße Chromatographie erweist sich auch als bequem und zweckmäßig für Ionenaustauschchromatographie, bei der es sich bekanntlich um eine der weitverbreitesten Trenntechniken handelt. Es wurden verschiedene Versuche zur Trennung von Kupfersulfat und Natriumbichromat an Dowex® 50 WX 8 als Adsorbens durchgeführt (vergleiche das unten angegebene Beispiel 2), wobei sich zeigte, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentliche Vorteile in bezug auf Zeitersparnis, Lösungsmittelvolumen und Einfachheit der Durchführung erzielbar sind.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Technik liegt in der wesentlichen Verminderung des Totvolumens. Das Totvolumen wird bekanntlich als das Volumen an Flüssigkeit in den Zwischenräumen zwischen den Körnern des Adsorbens im Chromatographiebett definiert. In den meisten üblichen Chromatographieoperationen stellt das Totvolumen ein Problem dar, das die Erzielung eines genauen Ergebnisses wesentlich beeinflußt. Demgegenüber wird bei der erfindungsgemäßen Chromatographie aufgrund der Möglichkeit einer dichten Packung die Gleichgewichtsverteilung der Substanz zwischen dem Adsorbens und der Flüssigkeit sehr rasch mit sehr geringem Totvolumen eingestellt. Demzufolge ist es auch möglich, scharfe und enge Zonen zu erhalten. Dies ist sehr wichtig bei Fraktionierungen, bei denen der Unterschied im Elutionsvolumen zwischen den Substanzen im allgemeinen klein sind. Insbesondere bei der Gelinformation verschlechtern große Totvolumen die erhaltene Auflösung.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Absorbens in einer Hülse angewandt, die in den Längskanal des Kolbens eingesetzt wird. Auf diese Weise ist die Chromatographievorrichtungen für zahlreiche Verwendungszwecke gebrauchsfertig durch einfachen Ersatz der Hülse durch eine andere, die das geeignete Adsorbens enthält. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch große Einfachheit aus und seine Vielseitigkeit neben den verschiedenen anderen Vorteilen wurde bereits erwähnt. Es gibt zahlreiche Ausführungsformen, die für die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienende Vorrichtung in Frage kommen. Einige dieser Ausführungsformen werden im folgenden anhand der beigefügten Fig. 1 bis 4, welche die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken, veranschaulicht.

Gemäß Fig. 1 ist das Testrohr R mit einem Luer-Verschluß L ausgestattet, an dem ein Dreiweghahn LV angebracht ist. Das gewünschte Elutionsmittel E wird in das Testrohr R gedrückt. Der Kolben C hat einen Längskanal, in dem das Adsorbens P untergebracht und zwischen zwei am Kopf und Boden des Kolbens befindlichen Membranen F₁, F₂ gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F₂ ist ein Stopfen S vorgesehen mit einer Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte Fraktion vom Adsorbensbett gesammelt wird. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich ein O-Ring O, der als Abdichtung dient und so ausgestaltet ist, daß er längs der Innenwände des Testrohrs R gleitet.

Fig. 2 veranschaulicht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen dynamischen Säulenvorrichtung, bei der der Säulenkolben C nach oben bewegt wird in das Testrohr R und der Ausfluß des Elutionsmittels durch einen vertikalen engen Kanal X in direkter Verlängerung des säulenchromatographischen Trägermaterials erfolgt.

Aus Fig. 3 ist eine Ausführungsform ersichtlich, bei der der Kolben C der Säule aus zwei oder mehr Untereinheiten besteht, von denen jede gleiche oder unterschiedliche Adsorbentien P enthält, wobei es möglich ist, das aus jeder Untereinheit austretende Elutionsmittel zu sammeln.

Fig. 4 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform, aus der sich die Vielseitigkeit der erfindungsgemäßen Chromatographie ergibt, deren Anwendungsmöglichkeiten dadurch noch nicht erschöpft sind. Im Fall der dargestellten Ausführungsform wird das austretende Elutionsmittel in eine andere Säule geleitet, welche das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens P enthält.

Die Fig. 5 bis 7 zeigen die grafische Auswertung von Versuchsergebnissen, die bei der Trennung verschiedener Gemische, wie sie in den unten angegebenen Beispielen 4, 5 und 6 beschrieben werden, erhalten wurden.

Fig. 8 stellt ein Diagramm dar, das bei der grafischen Auswertung einer Affinitätschromatographie zur IgG-Isolierung erhalten wurde, wie dies im unten angegebenen Beispiel 9 beschrieben ist.

Im Prinzip kann die erfindungsgemäße Chromatographie auch für einen Einsatz in der Flüssig-Ionenaustauschchromatographie ins Auge gefaßt werden. Flüssige Ionenaustauscher werden als Flüssig-Flüssig-Extraktionssysteme definiert, deren Wirkungsweise, zumindest formell, auf dem Austausch von Ionen an der Grenzfläche zwischen einer wäßrigen Lösung und einem nicht-mischbaren Lösungsmittel mit vernachlässigbarer Verteilung des Extraktanten in die wäßrige Phase besteht. Flüssige Anionenaustauscher finden in der Umkehrphasen-Extraktionschromatographie Anwendung. Bei dieser Technik dient das mit dem flüssigen Anionenaustauscher imprägnierte Trägermaterial (Silicagel®, Cellulosepulver, und dergleichen) als die stationäre Phase und eine wäßrige Lösung einer Säure oder eines ihrer Salze wird als Elutionsmittel (mobile Phase) verwendet. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollte die Membran so gewählt werden, daß sie nur für das Elutionsmittel, nicht jedoch für den flüssigen Ionenaustauscher permeabel ist, der in dem Längskanal des Kolbens verbleiben sollte.

Die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Chromatographie verwendbare erfindungsgemäße Vorrichtung kann aus beliebigem inerten Material hergestellt sein, z. B. aus Glas, Polyethylen oder einem anderen geeigneten Kunststoffmaterial und selbst Metall kommt für einige Spezialzwecke in Frage.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Trennung eines Gemisches aus Ferrocen und Ferrocenaldehyd (a) Packmethode

1,0 g Siliziumdioxid wurde in 5 ml einer entgasten Lösung von Dichlormethan/Hexan 1 : 1 im verschlossenen Testrohr dispergiert zur Herstellung einer Aufschlämmung. Der mit dem Stopfen und der oberen Membran ausgestatteten Kolben wurde in das Testrohr eingesetzt bis ein fester Kontakt zwischen dem O-Ring und dem Testrohr erreicht war.

Die gesamte Einheit wurde umgedreht, so daß sie senkrecht auf dem Stopfen stand und die Luft wurde durch den Auslaß im Testrohr entfernt. Der Testrohrauslaß wurde sodann verschlossen und das Packen erfolgte in der Weise, daß das Testrohr entlang dem feststehenden Kolben nach unten bewegt wurde mit einer Fließrate von 1 ml/min. Sobald das Siliziumdioxidbett vollständig abgesessen war, wurde der Testrohrauslaß geöffnet und das Testrohr vom Kolben entfernt. Die untere Membran wurde installiert und damit war die Säule fertig zur Aufbringung der Probe.

(b) Probenaufbringung

Ein Gemisch von Ferrocen und Ferrocenaldehyd wurde in 0,2 bis 0,4 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde auf die untere Membran der senkrecht stehenden Säule aufgebracht. Die Lösung drang durch die Membran und die Komponenten wurden am Siliziumdioxid adsorbeirt. Diese Prozedur konnte dadurch beschleunigt werden, daß mit Hilfe des geschlossenen Testrohrs etwas Luftdruck ausgeübt wurde.

(c) Elution

Der gepackte Kolben wurde in das 5 ml des gewählten Elutionsmittels enthaltende Testrohr eingesetzt. Luft wurde entfernt wie während des Packens der Säule und die Elution wurde durch Niederdrücken des Kolbens in das gefüllte Testrohr mit einer Fließrate von etwa 1 ml/min bewirkt.

Die mit zwei verschiedenen Gemischen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

1) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (13 mg) und Ferrocenaldehyd (19 mg)

2) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (25,3 mg) und Ferrocenaldehyd (15,6 mg)

Beispiel 2 Trennung von Na₂Cr₂O₇ · 2 H₂O von CuSO₄ · 5 H₂O durch Ionenaustausch

Das Adsorbens bestand aus Dowex® 50 WX8 (200 bis 400 mesh, entsprechend 0,038-0,074 mm lichte Maschenweite). Das Adsorbens wurde zuerst gewaschen und danach etwa 30 Minuten lang in destilliertem Wasser, das mit Salzsäure (2N) angesäuert war, stehengelassen. Die Azidität wurde sodann entfernt durch Waschen mit destilliertem Wasser und das neutrale Adsorbens wurde in den Längskanal des Kolbens eingeführt. Die beiden Membranen, welche das Adsorbensbett hielten, bestanden aus zwei Scheiben aus porösem Polyethylenfilter.

Die in Form einer wäßrigen Lösung vorliegende Probe bestand aus 359,3 mg Na₂Cr₂O₇ · 2 H₂O und 369,7 mg CuSO₄ · 5 H₂O, gelöst in 1 ml Wasser. Die Probe wurde durch das Adsorbens geleitet und die für Analysezwecke entnommene Menge an Probe betrug 100 µl. Die Ionen wurden von der Säule gewaschen und wie folgt getrennt:

- die Anionen durch destilliertes Wasser;
- die Kationen durch eine saure Lösung, bestehend aus 2 N-Salzsäure.

Die Fraktionsanteile wurden in Reagensgläsern gesammelt. Die Beendigung des Waschens wurde nach der Farbe der austretenden Lösung bestimmt. Die Proben wurden ferner quantitativ analysiert, indem die Fraktionsanteile bei 110°C getrocknet und der trockene Rückstand gewogen wurden. Eine Blindprobe für den Rückstand wurde durchgeführt, indem 100 µl der Probe in ein Teströhrchen eingeführt und bei 110°C getrocknet wurden. Der Feststoffrückstand wog 68,5 mg.

Die Ergebnisse, die beim Wiegen der verschiedenen getrockneten Fraktionen erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben. Im Versuch 2 wurde die Säule nach Durchführung des Versuchs 1 bis zur Neutralität gewaschen und neutralisiert.

Tabelle II

Trennung durch Ionenaustausch mit dynamischer Chromatographie

Die Ergebnisse zeigen, daß nach Durchlaufen von acht Fraktionen durch das Adsorbens praktisch die Gesamtmenge der Verbindungen entfernt und getrennt waren.

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen Chromatographie zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt unter Verwendung einer üblichen Chromatographietechnik durch Elutionsmittelfluß mittels Schwerkraft, wobei die gleiche Menge einer 100 µl-Probe und das gleiche Adsorbens eingesetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

Trennung durch Ionenaustausch mit üblicher bekannter Chromatographiesäule

Die Ergebnisse zeigen, daß in diesem Falle zwanzig Fraktionen zur Trennung erforderlich sind gegenüber acht beim erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung von 100 µl β-hCG mit einem Gehalt an 30 bis 35% markiertem Jod (*J₂) mit Hilfe der erfindungsgemäßen Chromatographie unter Verwendung eines Sephadex® G-10-Adsorbens getrennt. Die Elution wurde mit 10 ml Puffer bei einem pH- Wert von etwa 8 durchgeführt. Jede Fraktion bestand aus etwa 0,4 ml. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Trennung von *J₂ enthaltendem β-hCG auf Sephadex® G-10

Die Ergebnisse zeigen, daß die Ausbeute etwa 85% beträgt. Bei Durchführung dieser Trennung mit Hilfe einer üblichen Chromatographietechnik wird weitaus mehr Elutionsmittel gebraucht und die Trennoperation dauert sehr viel länger.

Beispiel 4

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine Lösung eines Farbstoffgemischs bestehend aus 35% Ceres red 7B, 28% Nitro fast blue 2B, 25% Nitro fast violet FBL und 12% Ceres yellow R (alle Angaben in Vol.-%) getrennt. Dieses Farbstoffgemisch wurde von der Firma Merck bezogen (Katalognummer 9354).

Eine Menge von 30 µl des Farbstoffgemisches in Dichlormethan wurde auf eine erfindungsgemäße Säule aufgebracht, die ein Adsorbens auf Siliziumdioxidbasis mit einer Partikelgröße von 15 bis 25 µm (Lichroprep Si-60®) enthielt. Die Säulendimensionen waren wie folgt: Länge 10,6 cm und innerer Durchmesser 10 mm. Die Fließrate betrug 2 ml/min und als Elutionsmittel diente Dichlormethan.

Die Ergebnisse der Trennung sind in Fig. 5 in graphischer Auswertung, gemessen als optische Dichte (O. D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen, wiedergegebenen. Wie aus den Kurven ersichtlich ist, wird eine rasche und saubere Trennung erreicht.

Beispiel 5

Es wurde ein Gemisch von polycyclischen Aromaten bestehend aus 50% Benzol, 30% Naphthalin und 20% Anthracen (Angaben in Vol.-%) in n-Heptan-Lösung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens getrennt.

Die aufgebrachte Probe bestand aus 50 µl und es wurde eine Säule mit den gleichen Ausmaßen wie in Beispiel 4, die das gleiche Adsorbens enthielt, eingesetzt. Die Fließrate betrug 2 ml/min und das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Als Elutionsmittel diente n-Heptan.

Die Ergebnisse der Trennung sind in Fig. 6 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O. D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurden die Komponenten in drei scharfe Peaks getrennt.

Beispiel 6

Es wurde ein Gemisch von Alkylphthalaten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer Säule wie in Beispiel 4 mit dem gleichen Adsorbens getrennt.

Die Alkylphthalate bestanden aus einem Gemisch von Dibutylphthalat, Diethylphthalat und Dimethylphthalat in n-Heptan/ Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Das Elutionsmittel war ein Gemisch aus n-Heptan/Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Die Fließrate betrug 3 ml/min, das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Die Ergebnisse der Trennung sind in Fig. 12 graphisch ausgewertet als optische Dichte (O. D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurde eine klare Trennung erreicht.

Beispiel 7 Reinigung von Anti-hCG

Die Reinigung wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung zweier verschiedener Bezugsquellen dieser Verbindungen durchgeführt, nämlich a) von Serono und b) von Miles, wobei bekannt ist, daß das letztgenannte Produkt weniger konzentriert ist als das erstgenannte.

a) Reinigung von Anti-hCG (Serono)

Eine Phiole von Anti-hCG wurde rekonstituiert mit 1 ml Phosphatpuffer (pH=6,3). Die Lösung wurde auf eine Säule von 10,6 cm Länge und 10 mm innerem Durchmesser aufgebracht, welche 3 g Cellulose (DEAE DE-52®) als Adsorbens enthielt. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer (pH=6,3) eluiert mit einer Fließrate von 2,5 ml/min. In den ersten Fraktionen (4 bis 8) war sofort ein sehr hoher Peak von Proteinen sichtbar. Die Säule wurde an eine Fließzelle und einen Recorder zur sofortigen Bestimmung angeschlossen. Ein Pufferwechsel auf pH=7,1 führte zu einem fast sofortigen Auftreten von Proteinen. Zwei weitere Hauptpeaks von Proteinen wurde eluiert.

Die Bestimmung erfolgte durch Messen der Adsorption bei 280 nm optische Dichte (O. D.) jeder Fraktion. Die immunologische Aktivität in jeder Fraktion zum hCG-Nachweis erfolgte mit Hilfe der RIA-Methode unter Verwendung der folgenden Lösungen: 100 µl ¹²⁵J-hCG; 100 µl Serum frei von hCG und 100 µl jeder Fraktion. Die Inkubation wurde 3 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Trennung erfolgte unter Einsatz eines Polyethylenglykol/Doppelantikörpers (20/1 Vol.-Teile).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

Trennung von Anti-hCG Serono auf DEAE DE-52®

Die Ergebnisse zeigen, daß drei Hauptpeaks erhalten wurden, wobei die immunologische Aktivität extrem hoch blieb im Vergleich zur Proteinkonzentration.

b) Reinigung von Anti-hCG (Miles)

70 µl Antikörper (als Kaninchenserum) wurden auf die DEAE DE-52®-Säule aufgebracht (wie im Versuch (a) beschrieben) und zuerst mit Phosphatpuffer (pH=6,3) eluiert. Wie im Versuch a) wurde ein rasch auftretender Proteinpeak eluiert in den Fraktionen 3 und 4. Durch Erniedrigung der optischen Dichte (O. D.) und Änderung des Puffers auf pH= 7,1 wurden drei weitere Hauptpeaks gesammelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI aufgeführt.

Tabelle VI

Trennung von Anti-hCG Miles auf DEAE DE-52®

Die Ergebnisse zeigen, daß das getrennte Anti-hCG in drei Hauptpeaks gesammelt wurde, die alle immunologische Aktivität zeigten, Absorption bei 280 nm aufwiesen und einen Nachweis durch Protein A* ergaben. Alle Peaks waren scharf voneinander getrennt und wurden gesammelt.

Beispiel 8 Trennung von Humanserum

Die Trennung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte nach einer Prozedur, die identisch ist mit derjenigen, wie in Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Md. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1973, 2. Auflage) beschrieben.

Die Chromatographie basiert auf Ionenaustausch auf einem Celluloseadsorbens und einer Gradientenelution mit Phosphatpuffer (0,02 M) von pH 5,7.

Die verwendete Säule hatte einen inneren Durchmesser von 10 mm und war gepackt mit 3 g DEAE DE-52® und sie wurde gewaschen mit dem Phosphatpuffer (pH=8) mit einer Fließrate von 2,5 ml/min.

Der Gradient wurde mit einem Zweikammersystem erzeugt unter Verwendung von 40 ml Phosphatpuffer pH 8 und 60 ml Phosphatpuffer pH 5,7. 3 ml Humanserum wurden getrennt in Fraktionen von 1,5 ml, von denen jede gesammelt wurde, worauf der darin enthaltene Proteingehalt durch optische Dichte (O. D.) bei 280 nm gemessen wurde.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII aufgeführt.

Tabelle VII

Trennung von Humanserum (O. D. bei 280 nm)

Die Ergebnisse zeigen, daß die Trennung nach dem traditionellen Kurvenbild von getrenntem Humanserum erfolgte mit zwei Hauptpeaks (IgG, Albumine). Die Trennung war in kurzer Zeit beendet.

Beispiel 9

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auf Affinitätschromatographie angewandt zur Isolierung von Kaninchen-IgG unter Verwendung von Sepharose®-4B- Antikörper (Antikörper=Ziegen-Antikaninchen) als Ligand.

Sepharose®-4B-Antikörper:
Der Antikörper wurde an das aus Sepharose®-4B bestehende Adsorbens gekuppelt unter Beachtung der Instruktionen, die von Axel Porath et al. in Nature 214, 1967, gegeben werden.
	50% Bindung:
	1 g Sepharose®-4B
	30 mg Ziegen-Antikaninchen
DCLC-Säule:	Glassäule von 6 mm innerem Durchmesser, gepackt mit Sepharose®-4B-Antikörper
Bestimmung:	direkt von der Säule mit Fließzellen unter Messung der UV-Absorption bei 280 nm
Puffer:	1. Phosphatpuffer/NaCl, pH 7,8
	2. Glycin/HCl (0,1 M), pH 2,5.

Die Verfahrensweise umfaßte folgende Stufen:

1. Kuppeln von Sepharose®-4B an Ziegen-Antikaninchenserum
2. Packen einer erfindungsgemäßen Säule mit Sepharose®-4B-Antikörper 3 ml Gel, von beiden Seiten geschlossen mit einem Filtersystem VYON®, etwa 40 µm.
3. Waschen der gepackten Säule mit 6 ml Puffer 1.
4. Laden der Säule mit 0,5 ml N. R. S. (Normalkaninchenserum).
5. Inkubation bei 37°C 2 h lang.
6. Elution mit Puffer 1 und Sammeln der Fraktion, bis die optische Dichte am Photometer unter 0,1 beträgt.
7. Elution mit Puffer 2 von pH 2,5 und Sammeln der Fraktionen, bis die optische Dichte unter 0,1 beträgt.

Die grafische Auswertung der erhaltenen Ergebnisse dieser Affinitäts-Chromatographie ist in Fig. 8 gezeigt.

Claims

1. Chromatographieverfahren zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen, bei dem man einen Kolben, der an seinem Bodenteil mit einem Abdichtelement und der in seinem Inneren mit einem Längskanal versehen ist, welcher ein zwischen zwei Sperreinrichtungen gehaltenes Adsorbens enthält, in ein Testrohr, in das der Kolben bündig paßt, einsetzt, den Kolben in das Testrohr schiebt und die erhaltene Lösung durch eine am Kopfteil des Kolbens befindliche Ausströmeinrichtung abzieht, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kolben in das Testrohr unter Einführung und Transport eines gewünschten Elutionsmittels durch den Längskanal schiebt, das zuvor durch einen am Boden des Testrohrs angebrachten Mehrwegehahn gedrückt wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei geschlossener Stellung des Hahns die Flüssigkeit unter innerem Druck durch den Kanal führt zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Sperrplatten.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein zusätzliches geeignetes Absorbens, das von dem ersteren verwendeten Adsorbens verschieden ist, einsetzt zur Vorkonzentrierung der eingebrachten Probe.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Feststoffadsorbens in eine Hülse einführt, die im Längskanal des Kolbens untergebracht wird.

5. Vorrichtung zur Durchführung einer Chromatographie zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen, aufweisend

- einen Kolben (C), der an seinem Bodenteil ein Abdichtelement und in seinem Inneren einen Längskanal aufweist, welcher ein zwischen zwei Sperreinrichtungen (F₁, F₂) gehaltenes Adsorbens (P) enthält,
- ein Testrohr (R), in das der Kolben (C) bündig paßt, und
- eine Ausströmeinrichtung (D), die sich am Kopfende des Kolbens (C) befindet, dadurch gekennzeichnet, daß am Boden des Testrohrs (R) ein Mehrwegehahn (LV) angebracht ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausströmöffnung für das Elutionsmittel als vertikaler enger Kanal in direkter Fortsetzung der Säule ausgebildet ist.

7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß am Bodenteil des Kolbens ein Abdichtelement vorliegt, das zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs ausgestattet ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement aus einem inerten Material besteht.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement aus einem Kautschuk-O-Ring besteht, dessen Öffnungsinnenteil am Längskanal befestigt ist.

10. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Säulenkolben in Form von zwei oder mehreren Untereinheiten ausgestaltet ist, von denen jede das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens enthält.

11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausströmöffnung an der oberen Sperrplatten des Kolbens angeschlossen ist.

12. Vorrichtung nach den ansprüchen 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stopfen am Kopfende des Kolbens vorgesehen ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausströmöffnung mit einem Kanal in Verbindung steht, der sich durch den Stopfen erstreckt.

14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein als Säule ausgebildeter Lösungsmittel-Vorratsbehälter mit der Chromatographiesäule verbunden ist.

15. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem inerten Material hergestellt ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Material aus Metall, Glas, Polyethylen oder anderem entsprechenden Kunststoffmaterial besteht.