SE457606B - Foerfarande och anordning foer separering av separerbara komponenter i ett vaetskeprov genom kromotografiteknik - Google Patents

Description

457 606 eller adsorption på en fast yta. Blandningen förskjutes fysikaliskt över en stationär fas (bädd eller kolonn), som antingen kan utgöras av ett fast ämne eller en vätska, som immobiliseras i porerna i ett fast ämne (beläget i bädden eller kolonnen). Separeringen av de kemiska fas, genom filtrering genom den porösa kolonnen. (c) Skillnader i jonbytet med sorbenten. (d) Skillnader i molekylstorleken, när lösningen filtreras genom en gel med mycket liten dimension. vändes vid isolering av en fraktio vändning, t.ex. för spektroskopi, identifiering, ändamål eller kommersiella ändamål.

Det ursprungliga arbetet med kromatografi är baserat på skillna- der i adsorption över ett inert material, som är packat i en kolonn.

Separeringen av komponenterna, även känt är baserad på de relativa lösligheterna i " syntes för forsknings- fasen - och de relativa lösligh beståndsdelarna. De olika mater' . Tunnskikts- är baserade på skillnaden n av en komponent på ett inert medium. 457 606 delat ämne, som påföres ett ark eller ett plastunderlag eller en glas- skiva. Vanligen använda och på marknaden tillgängliga sorbenter, t.ex. i form av ytbehandlade plattor, plåtar, omfattar aluminium, kiselgel och cellulosa. Vid papperskromatografi kan den rörliga fasen förskjutas uppåt medelst kapillärverkan, s.k. stigande kromatografi, eller nedåt medelst gravitationen, s.k. sjunkande kromatografi.

Jonbyteskromatografi innebär separering av molekyler på basis av deras jonladdning. Sorbenten eller den stationära fasen består av poly- merer med kovalent bundna joner. Vid katjonbytarplaster, är de kraftigt bundna jonerna negativt laddade och associerade med positiva joner, som är löst fäst medelst elektrostatiska laddningar. De positivt laddade substanserna, som skall avskiljas från en blandning, adsorberas på sor- benten, varvid de i plasten närvarande katjonerna förskjutes. Lösningen är buffrad vid ett pH-värde, som underlättar bindningen, och utspädes sedan med samma buffring för avlägsnande av icke bindande fraktioner i lösningen. En anjonbytare fungerar på exakt samma sätt men med det undantaget, att dess kovalent bundna joner är motsatt laddade för attrahering av anjonerna från lösningen.

Separeringen, som är baserad på skillnader i molekylstorleken, uppnås genom gelfiltrering och benämnes även molekylsilningskromato- grafi. Vid detta förfarande avskiljes molekylerna i överensstämmelse med sin storlek, även om formen på molekylen påverkar filtreringen i viss grad. Gelerna har formen av små kulor, som innehåller ett nät av öppningar till porer, i vilka små molekyler kan uppfångas. Det vid- sträckta, kommersiella intresset för kromatografi i allmänhet och pre- parativ vätskekromatografi i synnerhet framgår av det stora antalet publikationer, som föreslår olika mikropartikulära kolonnförpackningar och förpackade kolonner, vilka säges ge bättre separering än kända ad- sorbenter, som kommer till användning på detta fält.

Enligt föreliggande uppfinning har man koncentrerat efterforsk- ningen på att utveckla ett nytt begrepp för kromatografin, varvid kända adsorbenter kommer till användning, men separeringen är mycket snabb 457 606 och lättare atf styra. Det nya i samband med kromatografin enligt före- liggande uppfinning är användningen av en dynamisk kolonn bädden med adsorbenten förskjutes i motsats till kommersiell kromato- grafiteknik, vid vilken det adsorbenta materialet är stationärt.

Uppfinningen avser sålunda ett förfarande för en ny kromato- grafiteknik, som i det följande kommer att benämna vätskekromatografi (DCLC), , i vilken s dynamisk kolonn- för separering av en eller flera föreningar i en lösning, och detta förfarande kännetecknas därav, att Ka) man adsorberar nämnda separerbara komponenter i provet på en rör- lig kromatografkolonn, som består av åtminstone en tätpackad ad- sorbentbädd, vilken kolonn har en inloppsände och en utloppsände man anbringar nämnda inloppsände på kolonnen i en behållare, som begränsar ett långsträckt genomlopp för upptagande av kolonnen med formpassning, vilket genomlopp innehåller en för ett utspädningsmedel och (c) man förskjuter kolonnen i nämnda genomlopp genom utspädnings- medlet, varigenom utspädningsmedlet av inre tryck genomloppet, tvingas genom adsorbentbädden för ur stone en av de separerbara komponenterna ur kolon änden.

Det allmänna fall (bl utbestämd mängd av , som utvecklas i lakning av åtmin- nen vid utlopps- , som tycks vara det vanligen uppträdande, är användningen av en solid adsorbentkolonn eller bädd, zon, i vilket fall förfarandet med fördel kan konkurr kromatografiteknik. Förfarandet är mycket exakt och h fördelar i förhållande till vanlig kromatografi: (a) I motsats till gravitationsflöde tografi, som adsorberande era med vanlig ar följande huvud- , som förefinnes vid vanlig kroma- kommer vid den dynamiska kolonnvätskekromatografin ett visst inre tryck att utövas i den adsorberande bädden, vilket med- för ett bättre resultat vid separeringen av beståndsdelarna. (bl Förfarandet är mycket snabbt även som ett resu ltat av det inre tryck, som utövas i systemet.

(C) Förfarandet kräver mindre utspädning än vid vanlig kromatpgrafi. (d) Närvaron av det inre trycket i det dynamiska kromatografisystemet 457 606 gör det möjligt att använda en adsorbent med mindre partikelstor- lek än vid konventionell kromatografi, vilket möjliggör en högre känslighet.

Flervägsventilen är mycket viktig, när flera successiva späd- ningsmedel skall införas i provröret, som ytterligare passerar genom den adsorberande bädden och på så sätt erhåller den önskade fraktionen.

När adsorbentbädden användes i huvudsak för förbehandling av ett prov eller för avlägsnande av en förening, är ventilkraven icke av utslags- givande betydelse och man kan använda ett enkelt provrör, som är till- slutet vid bottnen och fäst vid kolven. I detta fall skall spädnings- medlet införas i provröret före nedpressningen av kolven. Även när någon funktion ej erfordras, synes det givetvis som om provröret med en ventil är fördelaktigare att använda beträffande tvättningen av adsor- benten och införandet av spädningsmedlet medelst dess aspirering genom ventilen.

Tätningselementet glider längs insidan i provröret och samtidigt står det i god kontakt med insidan och möjliggör en snäv passning av kolven in i provröret. Tätningselementet består i allmänhet av gummi eller annat lämpligt material och 0-ringen har en borrningsdiameter och är anordnad att glida längs insidan av provröret. När anordningen be- står av glas, kan ytbehandlingen på utsidan av kolven vara bearbetad så, att denna kan ersätta 0-ringen.

Hela förfarandet är mycket flexibelt och kan tillämpas vid ett stort antal olika utföringsformer och dessa faller alla inom ramen för föreliggande uppfinning. Ett problem, som föreligger vid alla slag av kromatografi, är det jämna påförandet av provet på bäddens yta. När provet påföres direkt medelst gravitationsflöde, kan ett jämnt påföran- de vara relativt svårartat, eftersom bädden har en viss tendens att virvla upp, när provet införes. Av denna orsak är det speciellt vik- tigt, att ytan skyddas, t.ex. med ett stycke rayonfilterpapper. En tillverkare av kolonner (Pharmacia Fine Chemicals AB) förser vissa av kolonnerna med en specialanordning, som kallas provapplikator, vilken tjänar till att skydda bäddytan. Vid denna anordning har en tunn nylon- vävnad monterats vid änden av ett kort stycke perspexslang och 457 606 genomströmning genom kolonnen. I de flesta kro lämpning av föreliggande uppfinning blir probl avsevärt mindre. I det dynamiska flödet , som uppkommer genom den unda kan detta förfarande användas 457 606 även för kritiska fraktioneringsändamål, när användningen av ett mera finmalt material skulle vara nödvändigt för erhållande av den önskade upplösningen.

I den tyska Offenlegungsschriften 3126926.5 beskrives ett nytt förfarande för masstransport och separering genom selektiva barriärer under användning av komponenter liknande dem enligt föreliggande upp- finning. Såsom nämnes däri består anordningen i en blandare-separator, som har ett membran och en blandningsbehållare, i vilken blandaren- -separatorn införes. På blandarseparatorn har anordnats organ för acku- mulering av en luftficka för att minska det tryck, som utövas mot mem- branet. Under arbete av blandaren-separatorn inneslutes en bestämd mängd luft i luftfickan, som vid kompression verkar som en dyna eller stötdämpare för att ta upp en del av det tryck, som erhålles från mem- branmotståndet mot vätskeflödet.

För den dynamiska kolonnvätskekromatografin enligt föreliggande uppfinning kan luftfickkravet anses mindre viktigt än i det tidigare fallet. För vissa system, i vilka relativt höga tryck är involverade, synes emellertid luftfickan spela en viktig roll, eftersom den inne- slutna mängden luft pressar tillbaka in i provröret all vätska, som eventuellt kan ha sipprat upp i utrymmet mellan insidan på provröret och på utsidan på kolvens ände. Den mängd luft, som är innesluten på detta sätt mot kolven, beror på många faktorer och som sådana kan näm- nas slaget av barriär, beståndsdelar i blandningen, som skall separe- ras, och de speciella betingelser, som råder vid det specifika kromato- grafiska systemet. En speciell fördel med att använda en sådan luft- ficka är det fall, när det är nödvändigt att fullständigt undvika ut- spädningsmedel med en 0-ring, belägen vid bottnen i kolven, som tjänar som tätningselement.

Förfarandet enligt uppfinningen kan med framgång tillämpas vid olika slag av kromatografi: kiselgelkromatografi, omvänd fasvätskekro- matografi, kapillär kromatografi, affinitetskromatografi, kromatofoku- sering, storleksuteslutande kromatografi (även känd som gelfiltrering) och jonbytarkromatografi. 457 606 Kiselkromatografi är ett av de vanligaste kromatografiförfaran- Silikagel är den mest kända adsorbenten och är förhållandevis billigt i förhållande till andra material. erhålles med kiselgel vid förfarandet enlig är i huvudsak desamma eller bättre beträffa dena.

Separeringsresultaten, som t föreliggande uppfinning, nde noggrannheten av separe- ålles med konventionell tek- bare och kräver mindre mängd Förfarandet har även den speciella fördelen, att pelaren kan komma till återanvändning. Dessutom kan mindre storlek på kiselgel- partiklarna och en tätare packning användas med de därav erhållna för- delarna med högre separering. ringen och återvinningsgraden än de som erh nik men är lämpligare, eftersom de går snab lösningsmedel.

Omvänd fasvätskekromatografi kännetecknas av det förhållandet, att dess stationära fas är mindre polär än dess rörliga fas. Den huvud- sakliga nackdelen med kiselgel är att man erhåller blott delvis åter- vinning av de föreningar , som passerar genom en sådan bädd. Med tanke l på fördelarna med DCLC e nligt föreliggande uppfinning kan den omvända fasvätskekromatografin även med fördel användas för preparativ kromato- grafi. På senare tid har kapillär kromatografi rönt större intresse, i synnerhet med tanke på utvecklingen av mikrokolonner för vätskekrom grafi med hög noggrannhet. Orsaken till denna utveckling är att se följande fördelar hos detta slag av kromatografi: (a) ato- i Potentiellt erhållande av högre separeringseffektivitet för kom- plexa blandningar och svårlösta ämnen. _ En betydande minskning av förbrukningen av utspädningsmedel.

DCLC-metoden enligt föreliggande uppfinning kan lätt tillämpas för kapillärkromatografi under förutsättning av en smal kanal i den här ovan beskrivna kolven.

Gelfiltrering, (b) även känd som dimensionsuteslutande kromatografi, röner allt större och större intresse för rening av biologiska ämnen under användning av en lämplig adsorbent som separeringsmedel. Goda resultat erhölls vid separering av märkt jod-hCG från märkt jod under användning av Sephadex G- typ (framställd av Pharmacia Fine Chemicals, Sverige) adsorbent under användning av den dynamiska kromatografin 457 606 enligt föreliggande uppfinning (se exempel 3). Gelfiltreringskromato- grafin anses även vara en enkel och snabb metod för avsaltning eller buffertbyte. Gelbädden skall balanseras, före experimentet med lösning med en jonsammansättning som önskas, t.ex. destillerat vatten vid av- saltningen. Samma vätska användes för utspädningen. Med tanke på de stora mängder, som kan förekomma, kan hela förfarandet vara slutfört på en kort tid och med uppsamling av det avsaltade materialet på några få minuter. Andra områden för gelfiltreringskromatografin som kan genom- föras med den dynamiska kromatografin, utgöres av förbehandling före HPLC och koncentrationen av utspädda prover med efterföljande separe- ring.

Kromatofokuseringen användes i stor utsträckning för separering av proteiner enligt deras isolektriska punkter. Eftersom kromatofokuse- ringen ger synnerligen smala band av separerat material och kräver i allmänhet långa smala kolonner, torde det förhålla sig så, att den dynamiska kolonnvätskekromatografin är lämplig för detta slag av kroma- tografi under förutsättning av en smal kolv för den här ovan beskrivna anordningen.

DCLC lämpar sig även för jonbyteskromatografin, som är välkänd som ett av de mest populära separeringsförfarandena. Många försök har genomförts för separering av kopparsulfat och natriumbikromat på Dowex 50 WX 8 som adsorbent (se ex. 2). Där visade det sig, att betydande fördelar i form av tid, lösningsmedelsvolym och lättgenomförbarhet kunde uppnås under användning av DCLC. _ En annan fördel med DCLC enligt föreliggande uppfinning är en avsevärd minskning av den döda volymen. Den döda volymen definieras som bekant som den vätskevolym, som förekommer i mellanrummet mellan kornen hos adsorbenten i bädden. I de flesta konventionella kromatografiför- faranden utgör den döda volymen ett problem, som påverkar erhållandet av ett exakt resultat. Vid DCLC erhålles tack vare den möjliga täta packningen snabbt en Jämviktsfördelning av materialet mellan adsorbent_ och vätska med mycket liten'död volym. Följaktligen är det möjligt att erhålla skarpa och smala zoner. Detta är mycket viktigt vid fraktione- rande experiment, vid vilka skillnaderna i utspädningsvolymen mellan ämnena vanligen är mycket ringa. Framför allt för gelfiltrering skulle 457 606 stora döda volymer försämra det erhållna resultatet.

Enligt ett annat utföringsexempel är adsorbenten anbragt i en som införes i den längsgående kanalen i kolven. På detta sätt kan kromatografianordningen göras klar att användas för många ändamål blott genom utbyte av patronen mot en som bentämne. Fig. 5 på de bifogade ritningarn föringsform. patron, innehåller lämpligt adsor- a åskådliggör denna ut- Förfarandet är mycket enkelt och dess anpassningsbarhet kan nämnas som en av dess många fördelar. D former, som kan tänkas för anordningen unde enligt föreliggande uppfinning. förklaras i det följande med hän et finns många utförings- r tillämpning av förfarandet Vissa av dessa utföringsformer skall visning till de bifogade ritningarna, som upptar fig. 1 - 9, men dessa är att betrakta blott som åskådlig- görande av uppfinningen och denna är på intet sätt begränsad till det i nämnda figurer visade.

Enligt fig. 1 är provröret (R) förs till vilken har anslutits en trevägsventil ningsmedlet (E) pressas in i provröret (R). Kolven har en längsgående kanal, i vilken adsorbenten (P) är belägen och fasthålles där av två membran (F1, F3) vid kolvens övre och nedre del. Ovanför det övre membranet (F2) har anbragts en propp (S) med ett munstycke (D), genom vilket den separerade fraktionen från adsorbentbädden uppsamlas. Vid den nedre delen av kolven har anordnats en 0-ring (0), som tjänar för tätning och som är anordnad att glida längs insidan av provröret (R).

Enligt fig. 2 finns ej någon ventil vid bottnen i provröret (R) och en begränsad mängd av det valda utspädningsmedlet (E) införes från början i provröret (R). Kolven (C) är försedd med en längsgående kanal, i vilken adsorbenten (P) är belägen och hålles av två membran (Fl, FZ). Ovanför det övre membranet (FZ) är anbragt en propp (S). Mun- stycket (D), Qenom vilket den separerade fraktionen från adsorbent- bädden uppsamlas, är anslutet till kolven (C). anordnats en 0-ring (0) som tätningselement. ett med en Luer-fattning (L), (LV). Det önskade utspäd- Vid den nedre delen har Denna anordning kan 457 606 ll användas, när ej någon fraktionering är erforderlig, och förfarandet består blott av en cykel med ett enda utspädningsmedel.

Enligt fig. 3 är provröret (R) exakt detsamma som enligt fig. 2 men utan en ventil vid sin botten. Kolven (C) är försedd med en längs- gående kanal, i vilken adsorbenten (P) är belägen och hålles av två membrane* (F1, F2). Ovanför det övre membranet (F2) har anbragts en propp (S), som har ett munstycke (D), genom vilket den avskilda fraktionen från adsorbentbädden uppsamlas. Vid bottnen i kolven har 0-ringen (0) anordnats som ett tätande element.

I fig. 4 visas den enklaste formen av anordningen likaledes utan ventil vid bottnen i provröret och utan propp vid övre delen av kolven.

En begränsad mängd av det valda utspädningsmedlet (E) införes från bör- Jan i provröret (R). Kolven (C) har en längsgående kanal, i vilken ad- sorbenten (P) är anordnad och fasthålles mellan två barriärmembran eller filter (F1, F2). 0-ringen (0) år belägen vid den övre delen av kolven och tjänar som tätning och är anordnad att glida längs in- sidan av provröret (R)- Till kanalen som är fylld med adsorbent (P), är ansluten ett munstycke (D), genom vilket den avskilda fraktionen upp- samlas.

I fig. 5 åskådliggöres förfarandet, vid vilket patronen (CA), som innehåller den önskade adsorbenten (P), införes i den längsgående kanalen (I) i kolven (C). Utspädningsmedlet kan uppsamlas genom ett munstycke, såsom beskrives med hänvisning till tidigare figurer. 0-ringtätningen 0 är anordnad vid den nedre delen av kolven (C).

Driftsättet är mycket enkelt, vilket skall i det följande beskrivas med hänvisning till fig. 1. Kolven (C) pressas ned i provröret (R), som är fyllt med det valda utspädningsmedlet (E). Detta medför, att utspäd- ningsmedlet pressas genom det nedre membranet (F1), därefter genom adsorbenten (P) i den längsgående kanalen i kolven C och slutligen droppar genom munstycket (D) (se fig. 4). När den är fylld med lämpligt bärmaterial (P), tjänar detta som kromatografkolonn. Återfyllningen av provröret (R) åstadkommes helt enkelt genom frigörande av provrörets utlopp och inpressning av mera utspädningsmedel genom ventilen (LV) (se fig. 1). ' 457 606 12 I fig. 6 visas en utföringsform av den dynamiska kolonnen vilken kolonnkolven (C) förskjutes uppåt och in i provröret (R) spädningsmedlet utströmmar genom en vertikal smal kanal (X direkt fortsättning på kolonnens kromatografiska bärmateri visar en modifiering av den dynamiska kolonnen enligt fig. ken en kolonnlösningsbehållare (Y) är ansl kolonnen. , i och ut- l, som är en al. Fig. 7 6, vid vil- uten med den dynamiska Fig. 8 visar en utföringsform, som åskådliggör kolven (C) hos de dynamiska kolonnerna och som består av två eller flera underenheter, a adsorbenter (P) med möj- , som erhålles från varje vilka var och en innehåller samma eller olik lighet för uppsamling av utspädningsmedel underenhet.

Fig. 9 visar en annan utföringsform, som å ningsbarheten hos DCLC, varigenom dess användbar vidgas. Enligt denna utförings medlet till en annan kolonn (P). skådliggör anpass- het kan ytterligare ut- form ledes det utströmmande utspädnings- , som innehåller samma eller annan adsorbent Fig. 10 - 12 visar med en kurva res olika blandningar, som beskrivas i exem en schematisk kurva för affinitetskrom såsom beskrives i exempel 9. ultaten vid separeringen för plen 4, 5 och 6. Fig. 13 visar atografi enligt IgC-isolering, I princip kan den dynamiska kromatografin användas även i vätskejonbytare. Vätskejonbytare anges som vätske- system, som arbetar åtminstone formellt genom utby skiljeytan mellan en vattenlösning och ett oblandb försumbar fördelning av extraheringsmedlet i vatte bytare användes vid omvänd fasextraktionskromatogr användes bärmaterialet (kiselgel, impregnerat med vätskeanjonbytaren vätskeextraktions- te av joner vid art lösningsmedel med nfasen. Vätskejon- afi. Vid denna teknik cellulosapulver etc.), vilket är , som stationär fas och en vattenlös- ning av en syra eller ett av dess salter användes som u (rörlig fas). Enligt föreliggande uppfinning skall memb att det är permeabelt blott för utspädningsmedlet men e vätskeformiga jonbytaren kanal. tspädningsmedel ranet väljas så, j för den , som skall förbli i kolvens längsgående 457 606 13 Den anordning, som skall användas vid DCLC enligt föreliggande uppfinning, kan vara framställd av något inert material, t.ex. glas, polyetylen eller annan lämplig plast och även metall kan tänkas använ- das för vissa specialändamål.

Uppfinningen skall i det följande åskådliggöras med några exem- pel utan att uppfinningen får anses begränsad till dessa eller de ut- föringsformer, som beskrives. Tvärtom skall med föreliggande uppfinning täckas alla de alternativ, modifikationer och ekvivalenter, som kan anses ligga inom ramen för uppfinningen, såsom denna definieras i de efterföljande kraven.

Exempel 1: Separering av en blandning av Ferocene och Ferocenaldehyd (a) Packningsförfarande 1,0 g kiseldioxid (Merk, kiselgel H, typ 60) dispergerades i S ml av en avgasad lösning av diklormetan/hexan 1:1 i det låsta prov- röret för framställning av en suspension. Kolven, som måste vara försedd med proppen och det övre membranet, nedföres i provröret, tills man erhöll en fast kontakt mellan 0-ringen och provröret.

Hela enheten vändes och ställdes vertikalt på proppen och luft av- lägsnandes genom utloppet i provröret. Provrörets utlopp stänges därefter och packningen åstadkoms genom förskjutning av provröret längs kolven med en flödesgrad på ca 1 ml/min. När kiselbädden hade satt sig fullständigt, frigjordes provrörsutloppet och prov- röret avlägsnades från kolven. Det nedre membranet installerades och pelaren var klar för provtillförsel. (b) Provtillförsel En blandning av ferocen och ferocenaldehyd löstes i 0,2 - 0,4 ml diklormetan och lösningen anbragtes på det nedre membranet i den vertikalt stående kolonnen. Lösningen trängde genom membranet och komponenterna adsorberades på kíseldioxiden. Detta förfarande kan accelereras genom utövande av lufttryck vid användning av till- slutna porer.

(C) Utspädning Den packade kolven infördes i provröret, som innehöll 5 ml av det valda utspädningsmedlet. Luft avlägsnades som under packningen av 457 606 14 kolonnen och utspädningen åstadkoms medelst nedsänkning av kolven i det fyllda provröret med en strömningsmängd på ca 1 ml/min.

TABELL I I) Separeríng av en modellblandning innehålland e ferocen (13 mg) och ferocenaldehyd (19 mg) Fr. Nr. Utspädníngs- Utspädníngs- Restens Karaktär volym medel vikt 0 1 ml Hexan 0 Blank 1 1 ml Hexan 11,4 mg Ferocen 2 1 ml Hexan 0,79 mg Ferocen 3 1 ml Hexan 0,31 mg Ferocen 4 1 ml Diklormetan Spår Blank 1 ml Diklormetan 1,79 mg Aldehyd 6 1 ml Díklormetan 13,36 mg Aldehyd 7 1 ml Diklormetan 4,59 mg Aldehyd s 1 m1 oiklormetan 1,69 mg Alaenya 9 1 ml Diklormetan Spår Blank II) Separering av en modellblandning innehållande ferocen (25,3 mg) och ferocenaldehyd (15,6 mg) Fr.Nr. Utspädnings- Utspädníngs- Restens Karaktär volym medel vikt 0 1 ml Hexan 0,2 mg Ferocen 1 1 ml Hexan 19,0 mg Ferocen 2 1 ml Hexan 1,7 mg Ferocen 3 1 ml Hexan 0,3 mg Ferocen 4 1 ml Hexan 0 Blank 1 ml Díklormetan 0 Blank 6 1 ml Díklormetan 0,2 mg Aldehyd 7 1 ml Diklormetan 11,5 mg Aldehyd 8 1 ml Díklormetan 2,9 mg Aldehyd 9 1 ml Diklormetan' 0,7 mg Aldehyd 1 ml _ Díklormetan 0 Blank 457 606 Exempel 2: Separering av NagCr2O2, 2H2= från Cu S045H20 genom jonutbyte Adsorbenten bestod av DOHEX 50 WX8 (200 - 400 maskstorlek). Adsorbenten tvättades först och lämnades därefter i ca 30 minuter i destillerat vatten, som var surgjort med saltsyra (2N). Surheten avlägsnades där- efter genom tvättning med destillerat vatten och den neutrala adsorben- ten infördes i kolvens kanal. De två membranen, som höll samman adsor- bentbädden, bestod av två skivor av poröst polyetylenfilter. Vatten- lösningsprovet bestod av 359,3 mg Na2Cr207. 2H20 och 369,7 mg CuS04. 5Hg0, som var löst i 1 cm3 vatten. Provet infördes genom adsorbenten och mängden prov, som togs för analys, uppgick till 100 pl.

Jonerna tvättades från pelaren och separerades på följande sätt: - anjoner med destillerat vatten - katjoner med sur lösning, som bestod av 2N saltsyra.

Mängderna uppsamlades i provrör. Slutet av tvättningen bestämdes enligt färgen hos den avgående lösningen. Proven analyserades ytter- ligare kvantítativt genom torkning av de olika delarna vid 11008 och vägning av den torra resten. Ett nollförsök med avseende på resten genomfördes, varvid 100 ml av provet infördes i provrör och torkades vid ll0°C. Den fasta resten vägde 68,5 mg.

Resultaten från de olika torkade fraktionernas vägning framgår av följande tabell 2. I exempel_2 tvättades kolonnen efter exempel 1 till neutral och neutraliserades. 457 606 16 TABELL 2: Separering medelst jonutbyte med dynamisk kromatografi Försök Fraktionens Använt utspäd- Vikten av Total Anmärkning Nr. Nr. níngsmedel torkad vikt fraktion (mg) (m9) I 1 H20 43,0 2 H20 0,2 3 H20 0 43,2 * 4 HCl(2N) 0,5 HCl(2N) 15,2 6 HCl(2N) 27,5 7 HCl(2N) 3,2 8 HCl(2N) 1,3 47,7 * * Fraktion utan färg. . 2 1 H20 44,2 2 H20 1,1 3 H20 0,1 45,3 * 4 HCl(2N) 0,4 HCl(2N) . 2,3 6 HCl(2N) 34,0 7 HCl(2N) 5,7 8 HCl(2N) 0,8 43,2 _ * * Fraktion utan färg.

Av de ovanstående resultaten synes det framgå, att när åtta fraktioner hade fíltrerats genom adsorbenten , i huvudsak alla förenin- gar hade avlägsnats och separerats.

För att påvisa effektiviteten hos DCLC enligt föreliggande upp- finning gjordes ett jämförande prov under användning av vanlig kromatoë grafi med~tyngdkraftsflöde med samma mängd av 100 ml prov och samma adsorbent. Resultaten framgår av följande tabell 3: 457 606 17 TABELL 3: Separeríng medeïst jonutbyte under användning av en van1ig kromatografipelare Fraktionens Använt utspäd- Vikten av Totaï Anmärkning nr ningsmedeï torkad vikt fraktion (mg) (mg) 1 H20 0,8 2 H20 50,3 3 H20 1,3 4 H20 0,5 H20 0,2 6 H20 0,3 7 H20 0,4 8 H20 0,1 9 H20 0,3 H20 0,4 11 H20 - 0,1 12 H20 0,3 Fraktion 13 H20 0,1 54,9 utan färg 14 HCHZN) _ 0,0 HCHZN) 2,3 16 Hems) 23,0 17 HCHZN) 12,7 18 Hc1(2N) 3,3 19 HC1(2N) 1,4 Fraktion HC1(2N) 1,4 44,1 utan färg Exemgeï 3 I detta försök separerades en iösning av I00 01/3 -hGC, som innehöïi -35 % märkt jod (*I2) medeïst DCLC under användning av en Sephadex G-10 adsorbent. Utspädningen genomfördes med 10 m1 buffertmedel vid ett pH-värde på ca 8. Varje fraktion bestod av 0,4 m1.

Resultaten framgår av föïjande tabe11 4: 457 606 18 TABELL 4: Separering av /5 -hCG, som innehöll *I2 på Sephadex G-10, utspädd med en buffert (pH = ca 8) Fraktíon Bïank bestämd c p m Totaï HF 1 29,0 0 2 9348,0 9578,0 3 1946,0 1962,8 4 292,0 267,7 130,0 104,8 6 114,0 04,5 7 108,0 82,0 8 78,0 48,2 12125 cpm 9 79,0 49,6 98,0 67,7 11 134,0 102,9 12 182,0 152,5 13 414,0 309,3 14 485,0 464,4 766,0 _ 757,5 16 854,0 834,7 17 635,0 615,5 18 450,0 424,6 19 504,0 ' 400,4 378,0 348,5 21 284,0 256,8 22 158,0 127,7 23 131,0 99,0 5169 cpm Totalt _ 20534,0 20594,4 17294 457 606 19 Det är uppenbart, att återvinningen blev ca 85 %. När denna separering genomfördes med vanlig kromatografi krävdes mycket mer ut- spädningsmedel och mycket längre tid för separeringen.

Exempel 4 Vid detta försök separerades en lösning av färgämnesblandningar, som bestod av 35 % Ceres röd 7B; 28 % Nitro fast blått 2B; 25 % Nitro fast violett FBL och 12 % Ceres gult R (angivelser i volymprocent) med DCLC-metoden. Denna färgmedelsblandning saluföres av Merck (katalog- nummer 9354).

En mängd av 30 pl av färgämnesblandningen i diklormetan injice- rades i en DCLC, som innehöll LICHROPREP Si-60 (varumärke från Merck, katalognummer 9336), en kiseldioxidbaserad adsorbent med en partikel- storlek på 15 - 25 pm kiseldioxid. Pelardimensionen var följande: längd ,6 cm och innerdiameter 10 mm. Flödesmängden uppgick till 2 ml/min och utspâdningsmedlet utgjordes av diklormetan.

Resultaten från separeringen framgår av fig. 10 i form av kur- vor, optisk densitet (0.D.) vid 254 nm gentemot fraktionerna. Såsom framgår av kurvorna erhöll man en snabb och ren separering.

Exempel 5 Vid detta försök separerades en blandning av polycykliska aromatiska ämnen, som bestod av: 50 % bensen; 30 Z naftalen och 20 % antracen (volymprocent) i n-heptan-lösning enligt DCLC-metoden.

Det injicerade provet bestod av 50 pl under.användning av en kolonn med samma dimensioner som i exempel 4 och innehållande samma adsorbent. Flödesmängden uppgick till 2 ml/min och volymen av varje fraktion uppgick till 1 ml. Utspädningsmedlet utgjordes av n-heptan.

Resultaten från separeringen åskådliggöres i fig. 11 i form av kurvor och optisk densitet (0.D.) vid 254 nm gentemot fraktionerna. Det framgår av dessa kurvor, att komponenterna separerades i tre skarpa toppar.

Exempel 6 Vid detta försök separerades en blandning av alkylftalater med DCLC-metoden under användning av pelaren enligt exempel 4 med sama adsorbent. 457 606 Alkylftalaterna bestod av en blandning av dibutylftalat, dietylftalat och dimetylftalat i n-heptan/etylacetat (90/10 volym- delar). Utspädningsmedlet utgjordes av en blandning av n-heptan/etyl- acetat (90/10 volymdelarl. Strömningsgraden uppgick till 3 ml/min och volymen av varje fraktion uppgick till 1 ml. Resultaten från separerin- gen åskådliggöres i fig. 12 i form av kurvor, optisk densitet (0.D.) vid 254 nm mot fraktionerna. Det framgår av dessa kurvor, att man er- höll en klar separering.

Exempel 7 Rening av anti-hCG Reningen av anti-hCG genomfördes med DCLC- förfarandet under användning av två olika källor för denna förening: a) SERONÛ och b) MILES, varvid den senare är känd för att vara mindre koncentrerad än den förra. a) Rening av anti-hCG (SERONO) En skål med anti-hce fyiiaes maa 1 mi fasfatbuffert (pa = 6,3).

Lösningen anbragtes på en kolonn (10,6 cm lång och 10 mm inre dia- meter) , som innehöll 3 g cellulosa (DEAE DE-52, varumärke som innehas av Hhatman) som adsorbent. Kolonnen utspäddes med fosfatbuffert (pH = 6,3) med en flödesmängd av 2,5 ml/min. Omedelbart kom en kraftig topp med proteiner till synes i den första fraktionen (4 - 8). Kolonnen anslöts till en flödescell och upptecknades för omedelbar avkänning. En förändring av bufferten till pH = 7,1 medförde nästan omedelbart ett uppträdande av proteiner. Två andra kraftiga toppar av proteiner ut- späddes.

Bestämningen genomfördes med en avläsning på adsorbenten vid 280 optisk densitet (0.D.) nm per varje fraktion. Den immunologiska aktivi- teten hos varje fraktion med hCG-bestämning genomfördes medelst RIA-förfarandet under användnin g av följande lösningar: 100 pl 1251 - hce; 100 pl serum fritt från hCG och 100 ul för varje frak- tion. Inkubationen försiggick i tre timmar vid rumstemperatur. ringen genomfördes under användning av polyetylenglykol/dubbel a kropp (20/1 volymdelar).

Separe- nti- 457 606 21 De erhållna resultaten framgår av följande tabell 5.

TABELL 5 Separering av anti-hCG SERONO på DEÅE DE-52 Fraktion 0.0. RIA Fraktion 0.0. RIA nr %bindning nr %bindning 1 0,004 0,1% 16 0,013 19% 2 0,002 0,1% 17 0,039 16,4% 3 0,004 14,1% 18 0,03 5,0% 4 0,006 2,11 19 0,012 3,0% 0,63 22,8% 20 0,019 6,4% 6 0,879 12,3% 21 0,044 10,3% 7 0,097 2,81 22 0,029 4,5% 8 0,01 0,11 23 0,018 4,0% 9 0,008 0,1% 24 0,015 3,0% 0,003 0,1% 25 0,008 2,6% 11 - 0,1% 26 0,002 2,4% 12 0,002 0,1% 27 0,002 0,1% 13 0,002 0,1% 28 0,01 0,1% 14 0,003 0,1% 29 - 0,1% 0,01 0,1% Såsom framgår av resultaten i tabell 5 erhölls tre huvudsakliga toppar och den immunologiska aktiviteten förblev synnerligen hög i för- hållande till proteinkoncentrationen. b) Rening av anti-hCG (MILES) 70 pl av antikroppar (t.ex. kaninserum) påfördes DEAE DE-52 kolonn, såsom i föregående fall, och utspäddes först med fosfatbuffert (pH = 6,3). Liksom i föregående fall erhölls en snabb proteintopp, som utspäddes i fraktionerna 3 och 4: medelst en minskning i den optiska densiteten (0.D.) och förändring av bufferten till pH = 7,1 uppsamlades tre andra_kraftiga toppar.

Resultaten framgår av följande tabell 6. 457 606 TABELL 6 22 §gparering av anti-hCG MILES på DEAE-52 Fraktion 0.0. RIA Protein A* Fr. 0.0. RIA Protein A* nr ibind- %bindning nr %bind- %bindning ning ning 1 0,01 0,1% - 21 0,094 63,6% 7,0% 2 0,102 0,1% - 22 0,042 64,8% 7,2% 3 0,656 64,2% 2,6% 23 0,041 63,41 - 4 0,416 45,62 - 24 0,07 1,0% - 0,091 0,1% - 25 0,518 60,3% 5,9% 6 0,055 0,1% - 26 0,518 67,7% 5,3% 7 0,044 0,1% - 27 0,299 55,5% 4,5% 8 0,022 0,1% - 28 0,161 58,4% 3,7% 9 0,016 0,1% - 29 0,120 . 66,0% 2,5% 0,007 0,1% - 30 0,112 54% 1,82 11 0,005 0,1% - 31 0,091 51,3% 3,9% 12 0,003 0,1% - 32 0,074 59,7% 2,4% 13 0,003 0,1% - 33 0,062 55,7% okänd 14 0,004 0,1% - 34 0,062 60,91 - 0,001 0,1% - 35 0,043 59,5% 1,9% 16 0,004 0,1% - 36 0,034 17 0,011 0,1% -_ 37 0,035 18 0,034 6S,4% 7,2% 38 0,029 19 0,291 55,5% 12,1% 39 0,021 0,247 61,4% 11,6% Det framgår av resuïtaten i tabelï 6, att separerad anti-hCG uppsamlades 1 tre huvudtoppar.

Alïa dessa visade immunoiogisk aktivi- tet, adsorbtion vid 280 m1 och bestämning medeist protein A*. Aila topparna var skarpt avskiïda från varandra och uppsamiades. 457 606 23 Exempel 8 Separering av humant serum En separering av humant serum genomfördes under användning av DCLC-metoden, som var identisk med det förfarande, som beskrives i Handbook of Experimental Imunology (D.M. weir, Md. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1973, andra utgåvan).

Kromatografin var baserad på jonutbyte på en cellulosaadsorbent och en gradientutspädning med fosfatbuffert (0,02 M) med pH 5,7.

Kolonnen hade 10 mm inre diameter och packades med 3 g DEAE DE-52 (varumärke ägt av Nhatman) och tvättades med fosfatbuffert (pH = 8) med en flödesperiod på 2,5 ml/min. Gradienten framställdes med ett tvåkammarsystem under användning av 40 ml fosfatbuffert pH 8 och 60 ml fosfatbuffert pH 5,7. En mängd av 3 ml humant serum separerades; fraktioner om vardera 1,5 ml uppsamlades och proteinhalten däri bestäm- mes med en optisk densitet (0.D.) vid 280 nm.

Resultaten har upptagits i den följande tabellen 7.

TABELL 7 Separering av humant serum (0.D. vid 280 nm) Fraktion 0.D. Fraktion 0.D. Fraktion 0.D. m” m” nr 1 0,0017 13 0,052 2s_ 0,06 2 1,3 14 0,061 26 0,026 3 1,3 15 0,102 27 0,008 4 1,3 16 28 0,004 0,654 17 0,187 20 0,011 6 0,262 18 0,356 30 0,003 7 0,135 19 0,379 31 0,008 8 0,082 20 0,361 32 0,015 9 0,067 21 0,313 33 0,016 0,064 22 0,233 34 0,011 11 0,056 23 0,166 36 0,005 12 0,052 24 0,098 ' 36 0,006 457 606 erhölls vid DCLC, den traditionella bilden av separerat humant serum med två huvudtoppar (IgG, albuminer). Se tid. 24 0 o a, o v Sasom fram år av resultaten 1 tabeli 7 visar den se arering, som 9 P pareringen var slutförd på kort Exempel 9 I detta exempel tillämpades DCLC-metoden för affinitetskromatografi för isolering av kanin IgG under användning som ligand av SEPHAROSE-48 (varumärke, framställd av Pharmacia) - anti -kanin).

SEPHAROSE-48-antíkro DCLC kolonn: Avkänning: Buffert: kropp (antikropp = get-anti- : Antikroppen kopplades till SEPHAROSE-4B (varu- märke, framställd av Pharmacia) adsorbent under användning av instruktioner från Axel Porath m.fl. (Nature 214, 1967) 1 g SEPHAROSE-48 50% bindning mg get-anti-kanin glaskolonn med 6 mm inre diameter, packad med Sepharose-48-antikropp gjordes direkt från pelaren med flödescell. Med UV vid 280 nm adsorption 1. Fosfatbuffert / NaCl, pH 7,8 2. Glycin / HCl (0,1 M), pH 2,5 Förfarandet bestod av följande steg: Koppling av SEPHAROSE-4B till get- Packning av DCLC med SEPHAROSE-4B- från båda sidor med filtersystem V anti-kaninserum antikropp 3 ml gel, tillsluten YON (varumärke) ca 40 pm Tvättning av den packade kolonnen med 6 ml buffert 1 Belastning av kolonnen med 0,5 ml N.R.S. (Normal Rabbit Serum) Inkubering i två timmar vid 37°C Utspädning med buffert 1 och uppsamling av fraktion, tills den optiska densiteten vid fotometern blev lägre än 0,1 Utspädning med buffert 2 med pH 2,5 och uppsamling av fraktionerna, tills den optiska densiteten blev lägre än 0,1 _ En schematisk kurva för affinitetskromato grafin för detta exem- pel visas i fig. 13.

Claims (19)

25 457 606 P A T E N T K R A V

1. Förfarande för separering av separerbara komponenter i ett vätskeprov genom kromatografiteknik, i det följande benämnd dynamisk kolonnvätskekromatografi, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att (a) man adsorberar nämnda separerbara komponenter i provet på en rörlig kromatografkolonn, som består av åtminstone en tätpackad adsorbentbädd, vilken kolonn har en inloppsände och en utloppsände (b) man anbringar nämnda inloppsände på kolonnen i en behållare, som begränsar ett långsträckt genomlopp för upptagande av kolonnen med formpassning, vilket genomlopp innehåller en förutbestämd mängd av ett utspädningsmedel och å (c) man förskjuter kolonnen i nämnda genomlopp genom utspädningsmedlet, varigenom utspädningsmedlet av inre tryck, som utvecklas i genomloppet, tvingas genom adsorbentbädden för urlakning av åtminstone en av de separerbara komponenterna ur kolonnen vid utloppsänden.

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att en extra lämplig adsorbent, som skiljer sig från den adsorbent, vilken användes vid den dynamiskakokxn vätskekromatografin, inkorporeras i ändamål att förkoncentrera det införda provet.

3. Förfarande enligt kravet 1 eller 2, k 8 n n e t e c k n a t d ä r a v, att kolonnen är tillsluten vid sin botten och att utspäd- ningsmedlet införes i kolonnen före rörelsen av adsorbentbädden in i kolonnen. i

4. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e- t e c k n a t d ä r a v, att utspädningsmedlet (E) införas i provröret före kolvens nedpressning i provröret (R).

5. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e- t e c k n a t d 8 r a v, att kromatografitekniken väljes från kisel- gelkromatografi, omvänd fasvätskekromatografi, affinitetskromatografi, kapillärkromatografi, kromatfokusering, gelfiltrering och Jonbyteskroma- tografi. ' 457 606 26

6. Anordning för genomförande av förfarandet enligt kravet 1 för dynamisk kolonnvätskekromatografi för separering av en eller flera föreningar, som förekommer i en lösning, k ä n n e t e c k n a d a v ett provrör (R), av en kolv (C), som snävt passar in i provröret (R), varjämte kolven (C) är försedd med en längsgående kanal innehåller an adsorbent (P) mellan två barriärer (F1, munstycke (D), beläget vid ena änddelen av kolven (C).

7. Anordning enligt kravet 6, k ä n n e t e c k'n a d d ä r a v, att utloppet för utspädningsmedlet sträcker sig genom en vertikal, smal kanal som en direkt fortsättning på kolonnen för den dynamiska vätskekromatografin.

8. Anordning enligt kravet 6 eller 7, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att ett tätande element (0) har anordnats vid bottnen av kolven (C) för att glida längs insidan av provröret (R).

9. Anordning enligt kravet 8, k ä n n e t e c k n a d a v, att tätningselementet (0) är framställt av inert material.

10. Anordning enligt kravet 9, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v , att tätningselementet (0) består av en gummi borrning ansluten till den längsgående kanalen. , som F2) och ett d ä r- -0-ring med en

11. ll. Anordning enligt något av kraven 6 - 10, k ä n n e- t e c k n a d d ä r a v, att kolven (C) i den dynamiska pelaren består av två eller flera underenheter, som var och en innehåller sanma eller olka adsorbenter.

12. Anordning enligt något av kraven 6 - 11, k ä n n e- t e c k n a d d ä r a v, att munstycket (D) är anslutet till kolvens (C) övre barriär.

13. Anordning enligt något av kraven 6 - 12, k ä n n e- t e c k n a d d ä r a v, att en propp (S) är anordnad i den övre delen av kolven.

14. Anordning enligt kravet 13, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att munstycket (D) är anslutet genom en kanal , som sträcker sig genom proppen (S).

15. Anordning enligt något av kraven 6 - 14, k ä n n e- t e c k n a d d ä r a v, att en kolonnlösningsbehållare är ansluten till den dynamiska kolonnen. 457 606 27

16. Anordning enligt något av kraven 6 - 15, k ä n n e- t e c k n a d d ä r a v, att provröret (R) är tiïisiutet vid sin botten.

17. Anordning eniigt kravet 16, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att organen för ackumuiering av gasfickor består av horisonteiïa, vertikala eiir spiraiformiga spår, som är beïägna på kolven.

18. Anordning enïigt kravet 5, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att denfasta adsorbenten är anbragt i en patron (CA=, som är beïägen i koivens ïängsgående kanai.

19. Anordning eniigt kravet 6, k ä n n e t e c k n a d d ä r a v, att den fasta adsorbenten är anbragt i en patron (CA), som är beïägen i koivens iängsgående kanaï.