IT8322354A1 - Nuovo procedimento di cromatografia - Google Patents

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Description

D E S C R I Z I O N E
annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: ' PROCEDIMENTO DI CROMATOGRAFIA"
R I A S S U N T O
La presente invenzione riguarda u-n nuovo tipo di tecnica di cromatografia, indicata come cromatografia a colonna dinamica, per la separazione di uno o pi? composti presenti in una soluzione, che ? caratterizzata dell'esistenza di un letto assorbente solido in movimento. Secondo l'invenzione, il sistema cromatografico comprende uno stantuffo avente nella sua estremit? un elemento di tenuta e un canale longitudinale contenente l'assorbente fra due barriere e un tubo di prova avente nel suo fondo una valvola a pi? vie. Spingendo lo stantuffo nel tubo di prova, l'eluente desiderato che era prima forzato attraverso detta valvola entra sotto pressione intrinseca del sistema chiuso attraverso il canale che muove i composti assorbiti per essere separato fra dette barriere, la soluzione ottenuta uscendo attraverso un ugello posizionato ad una delle parti estreme dello stantuffo. La cromatografia liquida a colonna dinamica ? applicabile a: cromatografia al gel di silice, cromatografia liquida a fase invertita, cromatografia ad affinit?, cromatografia capillare, cromato-focalizzazione, cromatografia a scambio ionico e filtrazione di gel. Nella cromatografia liquida a colonna dinamica, la distribuzione di equilibrio dei composti fra l'assorbente e il liquido ? stabilita molto rapidamente, risultando in zone strette e ben definite delle frazioni separate.
D E S C R I Z I O N E
La presente invenzione riguarda un nuovo procedimento di cromatografia qui di seguito indicato come cromatografia liquida a colonna dinamica (D C L C) per separare due o pi? componenti. Pi? in particolare l'invenzione riguarda un nuovo procedimento per la separazione di due o pi? composti presenti in soluzione usando un sistema cromatografico a letto mobile.
Come noto cromatografia ? un termine che descrive un numero di procedimenti fisici usati in chimica e biologia per separare ed identificare miscele di composti chimici. Il principio dietro a tutte le varianti di cromatografia consiste nella ripetuta sottoposizione di una miscela di composti chimici ad estrazione da parte di liquido o assorbimento su una superficie solida.
La miscela viene mossa fisicamente su una fase stazio^ naria (letto o colonna), che pu? essere o un solido o un liquido immobilizzato nei pori di un solido (posizionato in detto letto o colonna).
La separazione di composti chimici per cromatografia pu? far uso di una o pi? delle seguenti forze fisicochimiche, in funzione del particolare sistema cromatografico :
(a) Differenze nell'assorbimento al mezzo poroso, cosiddetto assorbente.
(b) Differenze fra le.solubilit? relative di un rivestimento liquido del mezzo inerte (fase stazionaria) e il liquido, chiamato fase mobile, filtrante attraverso la colonna porosa.
(c) Differenze nello scambio ionico con l'assorbente. (d) Differenze in dimensione molecolare quando la soluzione filtra attraverso un gel di dimensione molto, piccola.
La cromatografia ? anche chiamata cromatografia preparativa quando viene usata per isolare una frazione da una miscela per ulteriori usi quali spettroscopia, identificazione , sintesi per ricerca o scopi commerciali.
Il lavoro originale sulla cromatografia si basa sulle differenze nell'assorbimento su un materiale inerte impacchettato in una colonna. La separazione dei componenti, nota anche come cromatografia partitiva, si basa sulle solubilit? relative nel solvente che passa sulla colonna.
La risoluzione ottenuta in questa cromatografia dipende dal pH e dalla resistenza ionica del solvente -fase mobile - e dalle solubilit? relative dei costituenti nelle due fasi; i vari materiali possono essere eluiti con un solvente opportuno e le frazioni liquide raccolte in una serie di tubi e successivamente analizzate con procedimenti chimici o fisici.
La cromatografia su carta e la cromatografia a strato sottile (TLC) si basano sulle differenze fra l'assorbimento relativo di un componente su un mezzo inerte. In TLC, la fase stazionaria consiste di uno strato sottile di una sostanza finemente divisa applicato al fondo in plastica o ad un foglio o ad una piastra in vetro. Gli assorbenti comunemente usati e commercialmente disponibili come piastre finite comprendono l'allumina, il gel di silice e la cellulosa. Nella cromatografia a carta, la fase mobile pu? muoversi verso l?alto per azione capillare, cosiddetta cromatograf ia ascendente, o verso il basso per gravit?, cosiddetta cromatografia discendente.
La cromatografia a scambio ionico comporta la separazione di molecole sulla base della loro carica ionica. La fase stazionaria o assorbente consiste di polimeri con ione di legami covalenti.
Nelle resine di scambio cationico, gli ioni strettamente legati sono caricati negativamente e sono associati con ioni positivi che sono attaccati mollemente da cariche elettrostatiche.
Le sostanze positivamente caricate che devono essere separate da una miscela vengono prima assorbite all'assorbente, spostando i cationi presenti nella resina.
La soluzione viene tamponata ad un pH che faciliter? il legame e quindi eluita con lo stesso tampone per togliere le frazioni non leganti della soluzione.
Uno scambiatore anionico funziona esattamente nello stesso modo tranne che i suoi ioni legati covalentemente vengono caricati in opposizione per attrarre gli anioni dalla soluzione.
La separazione basata sulle differenze in dimensioni molecolari si incontra nella filtrazione di gel pure nota come cromatografia a vaglio molecolare. Qu?sto procedimento separa le molecole secondo la loro dimensione, sebbene la forma della molecola influenzi la filtrazione in un certo grado.
I gel sono nella forma di granuli contenenti una rete di aperture di pori in cui possono essere intrappolate piccole molecole.
II vasto interesse commerciale in cromatografia in generale e nella cromatografia liquida preparativa in particolare ? manifestato dal gran numero di pubblicazioni che suggeriscono vari imballaggi di colonna microparticellare e colonne preparate sostenendo di ottenere una separazione migliore degli assorbenti noti usati in questo campo.
Gli inventori della presente invenzione hanno concentrato la loro ricerca nello sviluppo di un nuovo concetto per cromatografia in cui vengono utilizzati assorbenti noti, ma la separazione ? molto veloce e condotta molto facilmente.
Il nuovo concetto della cromatografia secondo la presente invenzione ? di utilizzare una colonna dinamica .
in cui il letto con l'assorbente si muove in contrasto con la tecnica cromatografica convenzionale dove il materiale assorbente ? stazionario.
Pertanto l'invenzione consiste in un procedimento per un nuovo tipo di tecnica di cromatografia qui di seguito indicata come cromatografia liquida a colonna dinamica (DCLC) per la separazione di uno o pi? composti presenti in una soluzione caretterizzato dall'esistenza di un letto assorbente solido in movimento, che comprende uno stantuffo avente al suo fondo un elemento di tenuta e un canale longitudinale contenente un assorbente tenuto fra due barriere, un tubo di prova avente nel suo fondo una valvola a pi? vie, dejt to stantuffo inserendosi con precisione nel tubo di prova, per cui premendo lo stantuffo nel tubo di prova, l'eluente desiderato che ? stato prima forzato attraverso detta valvola entra attraverso il canale muovendo i composti assorbiti che devono essere separati fra dette barriere, la soluzione ottenuta uscendo attraverso un u-gello posizionato ad una delle parti estreme dello stantuffo.
Il caso generale che sembra si incontri pi? frequentemente ? l'uso di una colonna assorbente.solida o letto, come zona assorbente,' nel qual caso il procedimento competer? con le tecniche cromatografiche convenzionali nel modo pi? favorevole.
Il procedimento ? molto accurato e presenta i seguenti vantaggi principali rispetto alla cromatografia convenzionale :
(a) In contrasto Con il flusso gravitazionale che esiste nella cromatografia convenzionale, nella cromatografia liquida a colonna dinamica una certa pressione vien? intrinsecamente esercitata nel letto assorbente, il che imprime una migliore risoluzione nella separazione dei costituenti.
(b) Il procedimento ? molto rapido, anche come risultato della pressione intrinseca esercitata nel sistema.
(c) Il procedimento richiede meno eluente che nella Cromatografia convenzionale.
(d) La presenza di pressione intrinseca nel sistema di cromatografia dinamico consente di utilizzare un assorbente con dimensione particellare pi? piccola che nella cromatografia convenzionale, il che consente una sensibilit? pi? elevata.
La valvola a vie multiple ? molto importante quando parecchi eluenti consecutivi devono essere introdotti nel tubo di prova, essendo ulteriormente fatti passare attraverso il letto assorbente ottenendo cos? il frazionamento desiderato.
Quando il letto,assorbente viene utilizzato principalmente per il pretrattamento di un campione o per la rimozione di un composto, il requisito valvolare non ? assoluto e pu? essere utilizzato un semplice tubo di prova chiuso sul fondo, inserito nello stantuffo. In questo caso l'eluente dovrebbe essere introdotto nel tubo di prova prima di spingere verso il basso lo stantuffo .
Naturalmente anche quando non ? richiesto frazionamento, sembra che ? pi? vantaggioso che venga utilizzato il tubo di prova con una valvola, il che comporta il lavaggio dell'assorbente e l'introduzione dell'eluente con sua aspirazione attraverso la valvola. L'elemento di tenuta scorre lungo le pareti interne del tubo di prova, contemporaneamente rimanendo in buon contatto con dette pareti interne permettendo un inserimento con precisione dello stantuffo nel tubo di prova.
L'elemento di tenuta consister? generalmente di un O-ring in gomma o altro materiale idoneo avente un orifizio e atto a scorrere lungo le pareti interne del tubo di prova. Quando il dispositivo ? fatto di vetro, pu? essere prodotta sulla parete esterna dello stantuffo la lucidatura in modo che sostituisce l'O-ring.
L'intero procedimento ? molto flessibile e pu? trovare un gran numero di applicazioni con varie forme di realizzazione, e tutte saranno comprese nel concetto della presente invenzione.
Un problema che esiste in tutti i tipi di cromatografia ? una uniforme applicazione del campione alla superficie del letto. Quando il campione viene applicato direttamente per flusso gravitazionale, una applicazione uniforme pu? essere relativamente difficile, poich? il letto ha la tendenza a ruotare rapidamente quando viene introdotto il campione. Per questa ragione ? particolarmente importante avere la superficie protetta ad esempio da un pezzo di carta di filtro in rayon.
Un fabbricante di colonne (Pharmacia Fine Chemicals AB) dota alcune delle colonne di un dispositivo speciale chiamato applicatone di campione, che serve a proteggere l? superficie di letto. In questo dispositivo, un tessuto in nylon sottile viene montato all'estremit? di un breve pezzo di tubo in perspex che-si inserisce all'interno del tubo cromatografico.
Naturalmente tale dispositivo aumenta i costi dell'apparecchiatura oltre allo svantaggio che la sua presenza causa pressione al flusso del campione rallentando la filtrazione attraverso la colonna.
Nella maggior parte dei sistemi di cromatografia che utilizzano la presente invenzione, il problema di una applicazione uniforme ? molto alleviato.
Nel flusso dinamico che esiste nel letto cromatografico, poich?,il liquido viene forzato verso l'alto spingendo lo stantuffo nel tubo di prova, non esister? alcuna tendenza di rotazione rapida a causa dell'introduzione di campione.
Inoltre, la pressione esercitata nel sistema spingendo lo stantuffo nel tubo di prova accelerer? il flusso del campione.
Un altro tentativo per favorire una applicazione uniforme del campione ? di incorporare sopra il letto un altro assorbente idoneo diverso dall'assorbente gi? presente nel letto, avente il ruolo di preconcentrare il campione e pertanto favorire l'ottenimento di una stretta banda di risoluzione.
Un esempio tipico di tale assorbente idoneo ? la silice grezza che differisce dalla silice attiva con le sue elevate propriet? assorbenti.
La dimensione particellare e la distribuzione della dimensione particellare devono essere attentamente controllate nella maggior'parte delle operazioni di cromatografia convenzionale. Come noto, un letto consistente di piccole particelle dar? generalmente una buona r i sol uz ione .
La ragione ? che i meccanismi che danno luogo all'allargamento della zona vengono amplificati quando la dimensione particellare viene aumentata. Con grandi particelle, la diffusione entro'e fuori le particelle richiede pi? tempo.
La forma di flusso in un letto di particelle grandi ? inferiore dando luogo a maggiore rimanenza.
D'altro canto, la resistenza al flusso in un letto dotato di particelle grandi ? inferiore e ? pi? elevata la velocit? di flusso massima che pu? essere ottenuta. Pertanto nelle operazioni di cromatografia convenzionale viene raggiunto un compromesso rispetto alla dimensione particeIlare, dando una risoluzione di zona massima nelle condizioni di flusso richieste.
Nel nuovo procedimento DCLC secondo la presente invenzione, pu? essere utilizzata una dimensione particellare piccola di assorbente senza incorrere nello svantaggio incontrato nei procedimenti noti, la piccola pressione intrinsecamente esercitata nel sistema supera la resistenza al flusso offerta dalla piccola dimensione particellare delle particelle.
Pertanto questo procedimento pu? essere utilizzato anche a scopi di frazionamento critico quando ? indispensabile l'uso di un materiale di grado pi? fine onde ottenere la risoluzione desiderata.
In una delle domande di brevetto precedenti dello stesso richiedente (Domanda di brevetto tedesca 3126926.5) ? stato illustrato un nuovo procedimento di trasporto di massa e separazione attraverso barriere selettive usando un dispositivo avente componenti similari come nella presente invenzione. Come ivi menzionato, il dispositivo consiste in un miscelatore-separatore che possiede una membrana e un serbatoio di miscelazione in cui viene spinto detto miscelatore-separatore.
Sul miscelatore-separatore sono mezzi per l'accumulo di una sacca d'aria per diminuire la pressione esercitata sulla membrana. Durante il funzionamento del miscelatore-separatore, una determinata quantit? d'aria viene bloccata nella sacca d'aria, che a compressione agisce come un assorbente d?urto o ammortizzatore per raccogliere parte della pressione risultante dalla resistenza di membrana al flusso di liquido.
Per la cromatografia liquida a colonna dinamica secondo la presente invenzione, il requisito di sacca d'aria pu? essere considerato meno imperativo che nel caso precedente. Tuttavia per certi sistemi in cui saranno inglobate pressioni relativamente elevate, la sacca d'aria sembra avere un ruolo importante, la quantit? bloccata d'aria forzando indietro nel tubo di prova tutto il liquido che pu? essere filtrato nello spazio fra le pareti interne del tubo di prova e le pareti esterne dell'estremit? terminale dello stantuffo. La quantit? d'aria bloccata da detti mezzi sullo stantuffo dipender? da molti fattori quali il tipo di barriera, i costituenti delle miscele da separare e le condizioni particolari esercitate nello specifico sistema cromatografico.
Un vantaggio particolare per utilizzare tale sacca d'aria ? il caso in cui viene richiesto di evitare completamente l'eluente con un O-ring posizionato nel fondo dello stantuffo avente il ruolo di elemento di tenuta. Il procedimento secondo la presente invenzione pu? essere utilizzato con successo nelle varie aree di cromatografia: cromatografia a gel di silice, cromatografia liquida a fase invertita, cromatografia capillare, cromatografia ad affinit?, cromato-focalizzazione, cromatografia con esclusione dimensionale (pure nota sotto il nome di filtrazione di gel) e cromatografia a scambio ionico.
La cromatografia a gel di silice ? uno dei procedimenti cromatografici pi? comuni. Il gel di silice ? in effetti uno degli assorbenti meglio noti relativamente poco costosi in confronto con altri materiali.
I risultati della separazione ottenuti con gel di silice nel procedimento secondo la presente invenzione sono sostanzialmente gli stessi o migliori per quanto concerne la precisione di separazione e i rendim?nti di recupero rispetto a quelli ottenuti nelle tecniche convenzionali, ma ? pi? conveniente essendo pi? veloce e richiedendo anche meno solvente. Ha anche un vantaggio particolare che la colonna pu? essere ri-utilizzata. Inoltre possono essere utilizzate particelle di gel di silice di dimensione minore e un imballaggio pi? denso con risultanti vantaggi di separazione pi? elevata .
La cromatografia liquida a fase invertita ? caratterizzata dal fatto che la sua fase stazionaria ? meno polare della fase mobile. Il principale inconveniente con il gel di silice ? che solo un recupero parziale dei composti che passano attraverso tale letto pu? essere ottenuto. Alla luce dei vantaggi del DCLC secondo la presente invenzione, la cromatografia liquida a fase invertita pu? anche essere con successo utilizzata nella cromatografia di preparazione. Recentemente, la cromatografia capillare ha riscontrato maggiore interesse in particolare alla luce degli sviluppi nelle microcolonne per la cromatografia liquida ad alta prestazione. La ragione per questi sviluppi consiste nei seguenti vantaggi di questo tipo di cromatografia:
(a) Ottenimento potenziale di rendimenti di separazione maggiori per miscele complesse e soluti difficili a sciogliersi.
(b) Diminuzione sostanziale nel consumo di eluente.
Il procedimento DCLC secondo la presente invenzione pu? facilmente essere applicato alla cromatografia capillare prevedendo uno stretto canale nello stantuffo precedentemente descritto.
La filtrazione di gel, pure nota come cromatografia .con esclusione a dimensione sta incontrando sempre maggiore interesse nella purificazione delle sostanze biologiche che usano un assorbente adeguato "come mezzo di separazione. Sono stati ottenuti buoni risultati nella separazione della lodina identificata -hCG dalla.Iodina identificata usando un assorbente del tipo Sephadex G (prodotto dalla Pharmacia Fine Chemicals, Svezia) usando la cromatografia dinamica secondo la presente invenzione (vedi Esempio 3). La cromatografia con filtrazione a gel ? pure considerata come un procedimento semplice e rapido per desalificazione o cambiamento di tampone. Il letto di gel dovrebbe essere equilibrato prima dell'esperimento con una soluzione con la composizione ionica che si desidera, ad esempio acqua distillata nel caso di desalificazione.
L'eluizione viene realizzata .con lo stesso liquido.
Alla luce delle elevate velocit? che possono essere in gioco, l'intera operazione pu? essere completata in un breve periodo di tempo raccogliendo il materiale desalificato in pochi minuti. Altre aree per la cromatografia a filtrazione di gel consigliate con la cromatografia dinamica saranno il pre-trattamento prima dell'HPLC e la concentrazione di campioni diluiti seguita da separazione.
La cromato-focalizzazione viene largamente usata per separare proteine secondo i loro punti isoelettrici. Dal momento che la cromato-focalizzazione produce bande estremamente strette di materiale separato, e richiede colonne strette generalmente lunghe, ne risulta che la cromatografia liquida a colonna dinamica ? ideale per questo tipo di cromatografia, prevedendo uno stretto stantuffo per il dispositivo prima descritto.
La DCLC ? pure conveniente per la.cromatografia a scambio ionico, ben nota come una delle tecniche di separazione pi? popolari.
Sono stati realizzati parecchi esperimenti per separare solfato di rame e bicromato di sodio sul Dowex 50 WX 8 come assorbente.(Vedi Esempio 2). E' stato trovato che possono essere ottenuti usando la DCLC vantaggi sostanziali in termini di tempo, volume di solvente e convenienza.
Un altro vantaggio della DCLC secondo la presente invenzione, ? una diminuzione sostanziale del volume morto. Come noto viene definito come volume morto il volume di liquido nello spazio di interstizio fra i grani dell'assorbente nel letto . Nella maggior parte delle operazioni di cromatografia convenzionale, il volume morto costituisce un problema che influenza la determinazione di un risultato preciso. Nella DCLC, poich? ? possibile un impacchettamento denso, la distribuzione di equilibrio della sostanza fra l'assorbente e il liquido viene stabilita molto rapidamente con volume morto molto basso. Pertanto sar? possibile ottenere zone strette e ben definite. Questo ? molto importante negli esperimenti di frazionamento in cui le differenze in volume di eluizione fra- le sostanze sono generalmente piccole. In particolare per la-filtrazione a gel grandi volumi morti sfalseranno la risoluzione ottenuta.
Secondo un'altra forma di realizzazione, l?assorbente ? presente in una cartuccia che ? inserita nel canale longitudinale dello stantuffo. In questa maniera, il dispositivo di cromatografia sar? pronto per l'uso per molti scopi solo sostituendo la cartuccia con una contenente l?assorbente idoneo. La figura 5 unita a questa descrizione illustra questa forma di realizza zione. Il procedimento ? molto .semplice e la sua versatilit? potrebbe essere menzionata fra i suoi vari vantaggi. Vi sono molte forme di realizzazione che possono essere consigliate per il dispositivo che utilizza il procedimento secondo la presente invenzione. Alcune di queste forme di realizzazione sono presentate qui di seguito nelle allegate figure da.1 a 9, essendo chiaro che queste vengono date solo per una migliore comprensione dell'invenzione senza che sia qui limitata.
In figura 1, il tubo di prova (R) ? dotato di un blocco Luer (L) a cui ? unita una valvola a tre vie (LV). L'eluente desiderato (E) viene forzato nel tubo diprova (R). Lo stantuffo (C) ha un canale longitudinale in cui ? posizionato l'assorbente (P) che viene tenuto dalle due membrane (F , F ) nella sommit? e nel fondo dello stantuffo. Sopra la membrana superiore (F ) vi ? un tappo (S) dotato di un ugello (D) attraverso cui viene raccolta la frazione separata dal letto assorbente. Nella parte inferiore dello stantuffo vi ? un O-ring (O), che ha il ruolo di chiusura a tenuta, essendo atto a scorrere lungo le pareti interne del tubo di prova (R).
In figura 2, non esiste alcuna valvola nel fondo del tubo di prova (R), una quantit? limitata dell'eluente scelto (E) essendo introdotta dall'inizio nel tubo di prova (R). Lo stantuffo (C) possiede il canale longitudinale in'cui ? posizionato l'assorbente (P) tenuto dalle due membrane (F1 , F ). opra la membrana superiore (F1 ) vi ? un tappo (S). L'ugello (D) attraverso cui viene raccolta la frazione separata dal letto assorbente, ? collegato allo stantuffo (C).
Nella parte inferiore vi ? l'O-ring (0) come elemento di tenuta. Questo dispositivo potrebbe essere utilizzato quando non viene richiesto alcun frazionamento, l'operazione consistendo di un solo ciclo con un singolo elu?nte.
In figura 3, il tubo di prova (R) ? esattamente come in figura 2, senza una valvola nel suo fondo. Lo stantuffo (C) possiede il canale longitudinale in cui ? posizionato l'assorbente (P) tenuto dalle due membrane (F1 , F ). Sopra la membrana superiore (F2) ? previsto un tappo (S) con un ugello (D) attraverso cui viene raccolta la frazione separata dal letto assorbente. Nel fondo dello stantuffo vi ? l'O-ring (0) come?elemento di tenuta.
In figura 4, ? illustrata la forma pi? semplice del dispositivo pure senza una valvola nel fondo del tubo di prova e il tappo alla sommit?.dello stantuffo. Una quantit? limitata del1'eluente scelto (E) viene introdotta dall'inizio nel tubo di prova (R). Lo stantuffo (C) ha un canale longitudinale in cui l'assorbente (P) ? presente tenuto tra le due barriere - membrane o filtri - (F1 , F ). L'O-ring (O) ? posizionato nella parte inferiore dello stantuffo ed ha il ruolo di chiudere a tenuta ed ? atto a scorrere lungo le pareti interne del tubo di prova (R). Collegato al canale con l'assorbente (P) ? un ugello (D) attraverso cui viene raccolta la frazione separata.
In figura 5,viene illustrato il procedimento in cui una cartuccia (CA) contenente l'assorbente desiderato (P) ? introdotta nel canale longitudinale (I) dello stantuffo (C). La raccolta dell'eluente pu? essere fatta attraverso un ugello come descritto nelle figure precedenti. La tenuta ad O-ring (0) ? presente nella parte inferiore dello stantuffo (C). Il tipo di operazione ? molto semplice come sar? descritto qui di seguito re-" lativamente alla figura 1. Lo stantuffo (C) viene spinto verso il basso nel tubo di prova (R) che ? riempito con l'eluente scelto (E). Questo far? s? che l'eluente venga forzato attraverso la membrana inferiore (F1 ) quindi attraverso l'assorbente (P) presente nel canale longitudinale dello stantuffo (C) e infine fatto cadere attraverso l'ugello (D) (in figura 4). Quando riempito con un materiale di supporto (P) idoneo agir? come una colonna di cromatografia. Il ri-riempimento del tubo di prova (R) viene effettuato semplicemente sbloccando l'uscita del tubo di prova e forzando pi? eluente attraverso la valvola (LV) (in figura 1).
In figura 6, ? illustrata una forma di realizzazione della colonna dinamica in cui lo stantuffo di colonna (C) si muove verso l'alto nel tubo di prova (R) e l'uscita d??l'eluente ? attraverso uno stretto canale verticale (X) in diretta continuazione del materiale di supporto cromatografico di colonna. La figura 7 ? una modifica della colonna dinamica di figura 6, in cui un serbatoio di solvente di colonna ? collegato (Y) alla colonna dinamica.
La figura 8 illustra una forma di realizzazione che mostra lo stantuffo (C) delle colonne dinamiche consistente di due o pi? sottounit?, ciascuna contenente lo stesso o diversi assorbenti (P) con la possibilit? di raccogliere l'eluente risultante da ciascuna sottounit?.
La figura 9 illustra un'altra forma di realizzazione che mostra la versatilit? della DCLC per cui l'utilit? pu? essere ulteriormente allargata; secondo questa forma di realizzazione, l'eluente uscente viene convogliato ad un'altra colonna che contiene lo stesso o diverso assorbente (P).
Le figure da 10 a 12 rappresentano in forma grafica i risultati della separazione per varie miscele come descritto negli Esempi 4, 5 e 6. La figura 13 rappresenta un grafico schematico per la cromatografia ad affinit? dell?isolamento IgG come descritto nell'Esempio 9.
In linea di,principio si pu? supporre che la cromatografia dinamica venga utilizzata anche negli scambia-?tori ionici liquidi. Vengono definiti come scambiatori ionici liquidi sistemi di estrazione liquido-liquido che funzionano, almeno formalmente, per interscambio di ioni nel1'interfaccia fra una soluzione acquosa e un solvente immiscibile con trascurabile distribuzione dell'estraente rispetto alla fase acquosa. Scambiatori anionici liquidi vengono usati nella cromatografia ad estrazione a fase invertita.
In questa tecnica, il materiale di supporto {gel di silice, polvere di cellulosa, ecc.) impregnato con lo scambiatore anionico liquido, viene usato come fase stazionaria e una soluzione acquosa di un acido o uno dei suoi sali viene usata come eluente (fase mobile). Per la presente invenzione, la membrana dovrebbe essere scelta cos? da essere permeabile solo all'eluente ma non per lo scambiatore di ione liquido che dovrebbe rimanere nel canale longitudinale dello stantuffo .
Il dispositivo da utilizzare nella DCLC secondo la presente invenzione pu? essere fatto di qualsiasi materiale inerte quale vetro, polietilene o altro idoneo materiale plastico e anche il metallo potrebbe essere considerato per alcuni usi speciali.
L'invenzione? sar? ora ulteriormente illustrata dai seguenti Esempi senza essere da questi limitata o alle forme di realizzazione'descritte nella descrizione. Al contrario si intende coprire tutte le alternative, le modifiche e gli equivalenti che possono essere racchiusi nell'ambito dell'invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni.
Esempio 1 : Separazione di una miscela di ferocene e aldeide di ferocene.
(a ) Procedimento di impacchettamento
1,0 g di silice (Merk, Kieselgel/H, Tipo 60) ? disperso in 5 mi di una soluzione degasata di diclorometano/ esano 1 : 1 nel tubo di prova bloccato per fare una miscela liquida. Lo stantuffo dotato del tappo e della membrana superiore ? inserito nel tubo di prova fino a. che viene ottenuto uno stretto contatto fra 1?-ring e il tubo di prova.
L'intera unit? viene rovesciata rimanendo verticalmente sul tappo e l'aria viene tolta attraverso l'uscita nel tubo di prova. L'uscita del tubo di prova viene quindi bloccata e 1'impacchettamento viene effettuato muovendo il tubo di prova verso il basso dello stantuffo stazionario ad una velocit? di flusso di circa 1 ml/min. Quando il letto di silice ? completamente fissato l'uscita del tubo di prova viene sbloccata e il tubo di prova tolto dallo stantuffo. Viene installata la membrana inferiore e la colonna ? pronta per l'applicazione di campione.
{b) Applicazione di campione
Una miscela di ferocene e aldeide di ferocene viene dissolta in 0,2-0,4 mi di dielorometano e la soluzione viene applicata sulla membrana inferiore della colonna fissata verticalmente. La soluzione penetra nella membrana e i componenti vengono assorbiti sulla silice. Questo processo pu? essere accelerato applicando una certa pressione d'aria usando il tubo di prova bloccato .
{c) Eluzione
Lo stantuffo impacchettato viene inserito nel tubo di prova contenente 5 mi dell'eluente scelto. L'aria viene tolta come durante 1'impacchettamento della colonna e l'eluzione viene effettuata per discesa dello stantuffo nel tubo di prova riempito con una velocit? di flusso di circa 1 ml/min.
TABELLA 1
per scambio ionico
L'assorbente consisteva di DOWEX 50 WX8 (200 - 400 dimensione di magliai L'assorbente ? stato prima lavato e dopo lasciato per circa 30 minuti in acqua distillata acidificata con acido cloridrico (2N). L'acidit? ? stata successivamente rimossa lavando con acqua distillata e ?l?assorbente neutro introdotto nel canale dello stantuffo. Le due membrane che tenevano il letto assorbente consistevano di due dischi di filtro di polietilene poroso.
Il campione di soluzione acquosa consisteva di 359,3 mg di disciolti in un cc di acqua. Il campione ? stato introdotto attraverso l?assorbente, la quantit? di campione presa per l?analisi essendo 100^1. Gli ioni sono stati lavati dalla colonna e separati come segue:
- gli anioni con acqua distillata;
- i cationi con una soluzione acida consistente di acido cloridrico 2 N.
Le parti sono state raccolte in tubi di prova. La -fine del lavaggio ? stata determinata secondo il colore della soluzione di uscita. I campioni.sono stati successivamente analizzati quantitativamente essiccando le varie porzioni a 110?C e pesando il residuo secco.
Un esperimento di base del residuo ? stato realizzato in cui 100 ?l di campione sono stati introdotti in un tubo di prova ed essiccati a 110?C. Il residuo solido pesava 68,5 mg.
I risultati delle varie frazioni secce pesate sono dati nella seguente Tabella 2. Nell'Esempio 2, la colonna dopo l'Esempio 1 ? stata lavata a neutro e neutralizzata.
Dai predetti risultati risulta che dppo ott.o frazioni filtrate attraverso l'assorbente, sostanzialmente tutti i componenti sono stati rimossi e separati.
Al fine di puntualizzare il rendimento della DCLG secondo la presente invenzione, ? stata realizzata una pr?va comparativa usando cromatografia convenzionale, per flusso gravitazionale, con la stessa quantit? di 100 yul di campione e lo stesso assorbente. I risultati sono presentati nella seguente Tabella 3.
Esempio 3
In questo esperimento, una soluzione di 100 ?l di -hCG contenente 30-35% di iodio targhettato (*I2) ?
stata separata con la DOLO usando un assorbente Sephadex G-10. L'-eluzione ? stata realizzata con 10 mi
di tampone ad un pH di circa 8. Ciascuna frazione consisteva di circa 0,4 mi.
I risultati sono presentati nella seguente Tabella 4.
Risulta che il recupero ? circa l'85%. Questa separa ? zione quando realizzata in Una cromatografia convenzionale richieder? molto pi? eluente e richieder? anche molto pi? tempo per la separazione.
Esempio 4
In questo esperimento una soluzione di miscela di colorante consistente del 35% rosso Ceres 7B; 28% blu ' Nitro 2B; 25% violetto Nitro FBL e 12% giallo Ceres R (tutte percentuali in volume) ? stata separata con il procedimento.DCLC. Questa miscela di colorante ? stata fornita dalla Merck (Numero di catalogo 9354). Una quantit? di 30 yul della miscela di colorante nel diclorometano ? stata iniettata in una DCLC contenente LICHROPREP Si-60 (Marchio prodotto dalla Merck, Cat. No. 9336),. un assorbente a base di silice avente dimensione particellare di silice di 15-25 ym . Le dimensioni di colonna erano le seguenti: lunghezza cm 10,6 e diametro interno mm 10. La velocit? di flusso era 2 mi/min e 1*eluente era dielorometano.
I risultati della separazione sono presentati in figura 10 nella forma di grafici, densit? ottica (O.D.) a 254 nm in funzione delle frazioni.
Come risulta dai grafici ? stata ottenuta una separazione veloce e pulita.
Esempio 5
In questo esperimento una miscela di sostanze aromatiche policicliche consistenti di: 50% benzene; 30% naftalene e 20% antracene {percentuali in volume) in una soluzione n-eptana ? stata separata con il procedimento DCLC.
Il campione iniettato consisteva di 50 ?l usando una colonna con le stesse dimensioni dell?Esempio 4 contenente lo stesso assorbente. La velocit? di flusso era 2 ml/min, il volume di ciascuna frazione essendo 1 mi'. L'eluente era n-eptano.
I risultati della separazione sono presentati in figura 11 In forma di grafici, densit? ottica (O.D.) a 254 nm in funzione delle frazioni. Come appare dai grafici, i componenti sono stati separati in tre picchi ben distinti.
Esempio 6
In questo esperimento una miscela di.ftalati alchilici ? stata separata con il procedimento DCLC usando una colonna come nell'Esempio 4 con lo stesso assorbente.
Gli alchil ftalati consistevano di una miscela di dibutilftalato , dietilftalato e dimetilftalato in neptano/etil acetato (90/10 parti in volume). L'?luente era una miscela di n-eptano/eti1 acetato (90/10 parti in volume). La velocit? di flusso era 3 ml/min, il volume di ciascuna frazione essendo t mi,
1 risultati della separazione sono presentati in figura 12 nella forma di grafici, densit? ottica (O.D.) a 254 nm in funzione delle frazioni. Come appare dai grafici ? stata ottenuta una chiara separazione Esempio 7
Purificazione di anti-hCG
La purificazione di anti-hCG ? stata realizzata con il procedimentp DCLC usando due sorgenti diverse di questi composti: a)SERONO e b)MILES, quest?ultimo essendo noto per essere meno concentrato del primo,
a) Purificazione di anti-hCG (SERONO).
Una fiala di anti-hCG ? stata ricostituita con 1 mi di tampone di fosfato (pH = 6,3). La soluzione ? stata applicata su una colonna (10,6 cm di lunghezza e 10 mm di diametro interno) contenente 3 grammi di cellulosa (DEAE DE-52, Marchio prodotto dalla Whatman) come assorbente. La colonna ? stata eluita con tampone di fosfato (pH = 6,3) ad una velocit? di flusso di 2,5 ml/min. Immediatamente un picco molto elevato di proteine era visibile nelle prime frazioni (da 4 ad 8). La colonna ? stata collegata ad una cella di flusso e registratore per immediato rilevamento. Un cambiamento di tampone a pH = 7,1 ha portato un apparire quasi immediato di proteine. Due altri picchi principali di proteine sono stati eluiti.
L? determinazione ? stata realizzata leggendo su-un assorbimento a densit? ottica 280 (O.D.) nm ciascuna frazione. L'attivit? immunologica di ciascuna frazione del riconoscimento hCG ? stata fatta con il "presiedimento RIA usando le seguenti soluzioni: 100 ?l <125>I -hCG ; 100 ?l di siero libero di hCG e 100 JJ I di ciascuna frazione. L'incubazione ? stata fatta per 3 ore a temperatura ambiente. La separazione ? stata fatta usando un polietilen glicole/anticorpo doppio (20/1
parti in volume).
I risultati ottenuti sono presentati nella seguente Tabella 5.
TABELLA 5
Come appare dai risultati presentati nella Tabella 5, sono stati ottenuti tre picchi principali, l'attivit? immunologica rimanendo estremamente elevata in confronto alla concentrazione di proteina, b) Purificazione di anti-hCG (MILES)
70 1 di anticorpo (come siero di coniglio) sono stati applicati ad una colonna DEAE DE-52 come nel precedente caso ed eluiti prima con tampone di fosfato (pH = 6,3). Di nuovo come nel caso precedente, un veloce picco di proteina ? stato eluito.in frazioni 3 e .4; con una diminuzione nella densit? ottica (O.D.) e un cambiamento di tampone a pH = 7,1, sono stati raccolti tre altri picchi principali.
I risultati sono presentati nella seguente Tabella 6.
TABELLA 6
Come appare dai risultati presentati nella Tabella 6,
l'anti-hCG separato ? stato raccolto in tre picchi principali. Tutti mostravano un'attivit? immunologica , assorbimento a 280 nm e riconoscimento dalla Prateina A.
Tutti i picchi erano separati nettamente l'uno dal
l'altro ? raccolti.
Esempio 8
Separazione di siero umano
Una separazione di siero umano ? stata eseguita usando il procedimento DOLO, identico alla procedura descritta nel Libro di Immunologia Sperimentale (D.M.
Weir, Md. Blackwell Pubblicazioni Scientifiche, Oxford, Londra,'1973, 2? edizione).
-La cromatografia si basa sullo scambio ionico su un assorbente di cellulosa e una eluzione di gradiente con tampone di fosfato (0,02 M) di pH 5,7.
La colonna di diametro interno 10 mm ? stata impacchettata con 3 g di DEAE DE-52 (Marchio prodotto da Whatman) e lavata con il tampone di fosfato (pH = 8) ad una velocit? di flusso di 2,5 ml/min.
Il gradiente ? stato prodotto con un sistema a due camere, usando 40 mi di tampone di -fosfato pH 8 e 60 mi di tampone di fosfato pH 5,7.
Una quantit? di 3 mi di siero umano ? stata separata; frazioni di 1,5 mi ciascuna essendo raccolte e il contenuto di proteina ivi ? stato determinato con densit? ottica (O.D.) a 280 nm.
I risultati sono presentati nella seguente Tabella 7.
TABELLA 7
Come appare dai risultati presentati in Tabella 7, la separazione ottenuta con DCLC mostra la forma tradizionale di siero umano separato con due picchi maggiori
(IgG, Albumine). La separazione ? completata in breve
tempo.
Esempio 9
In questo Esempio il procedimento DCLC ? stato applicato a cromatografia per affinit?, per l'isolamento di
IgG di coniglio usando come legante SEPHAR0SE-4B (marchio prodotto da Pharmacia) - anticorpo (anticorpo =
coniglio anti-capra).
SEPHAR0SE^4B - anticorpo : L'anticorpo ? stato accoppiato al SEPHAR0SE-4B (marchio prodotto da ?Pharmacia)
assorbente usando le istruzioni date da Axel Porath
et al ( Nat ure 214 , 1967 ) .
La procedura comprendeva le seguenti fasi:
1. Accoppiamento di SEPHAR0SE-4B a siero di coniglio anticapra.
2. Impacchettamento di DCLC con SEPHAR0SE-4B-anticorpo 3 mi
di gel, chiuso da ambo i lati -con un sistema di filtro VYON (marchio) circa 40 ?m.
3. Lavaggio della colonna impacchettata con 6 mi di
tampone 1.
4. Caricamento della colonna con 0,5 mi N.R.S. (Siero
di Coniglio Normale).
5. Incubazione di 2 ore a 37?C.
6. Eluzione con tampone 1 e raccolta di frazione fino a
che la densit? ottica nel Fotometro ? al di sotto di 0,1.

Claims (21)

R I V E N D I C A Z I O N I
1. Procedimento per un nuovo tipo di tecnica di cromatografia qui.di seguito indicata come cromatografia 'liquida a colonna dinamica, per la separazione di uno o pi? composti presenti in una soluzione, caratterizzato dall?esistenza di un letto assorbente solido in movimento, che comprende uno stant-uffo avente nel suo fondo un elemento di tenuta e un canale longitudinale contenente un assorbente tenuto fra due barriere, un tubo di prova avente nel suo fondo una valvola a vie multiple, detto stantuffo inserendosi con precisione nel tubo di prova, per cui spingendo lo stantuffo nel tubo di prova, l?eluente desiderato che ? stato prima forzato attraverso detta valvola entra attraverso il canale muovendo i composti assorbiti che devono essere separati fra dette barriere, la soluzione ottenuta uscendo attraverso un ugello posizionato ad una delle parti estreme dello stantuffo.
2) Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che nella posizione chiusa'di detta valvola, il liquido entra sotto pressione intrinseca attraverso il canale muovendo i composti assorbiti che devono essere separati fra dette barriere-?
3) Procedimento.secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che un assorbente idoneo supplementare, diverso dall'assorbente utilizzato nella cromatografia liquida a colonna dinamica, ? incorporato al fine di preconcentrare il campione introdotto.
4) Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che il tubo di prova ? chiuso nel suo fondo, l'eluente essendo introdotto nel tubo di prova prima di spingere lo stantuffo verso il basso nel tubo di prova.
5) Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto che la tecnica di cromatografia ? scelta da cromatografia a gel di silice, cromatografia liquida a fase invertita, cromatografia ad affinit?, cromatografia capillare, cromato-focalizzazione, cromatografia a scambio ionico e filtrazione di gel.
6) Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'assorbente solido ? presente in una cartuccia posizionata nel .canale longitudinale dello stantuffo.
7) Dispositivo per la cromatografia liquida a .colonna dinamica per la separazione di uno o pi? composti presenti in una soluzione, caratterizzato dal fatto di comprendere un tubo di prova, avente nel suo'fotido un elemento di tenuta e una valvola a vie multiple, uno stantuffo inserito con precisione nel tubo di prova, detto stantuffo avendo un canale longitudinale contenente un assorbente tenuto fra due barriere, e un ugello posizionato ad una delle parti estreme dello stantuffo.
8) Dispositivo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che l'uscita dell'eluente ? attraverso uno stretto canale verticale in diretta continuazione della colonna.
9) Dispositivo secondo la rivendicazione 7 o 8, caratterizzato dal fatto che ? previsto un elemento di tenuta alla base dello stantuffo atto a scorrere lungo le pareti interne del tubo di/prova.
10) Dispositivo secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detto elemento di tenuta ? fatto di un materiale inerte.
11) Dispositivo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto elemento di tenuta consiste di un 0-ring in?gomma avente un orifizio collegato al canale longitudinale.
12) Dispositivo s?c?ndo le rivendicazioni da 7 a . , 11, caratterizzato dal fatto che lo stantuffo della colonna dinamica ? costruito di due o pi? sottounit?, ciascuna contenente lo stesso o diversi assorb?nti^
13) Dispositivo secondo le rivendicazioni da 7 a 12, caratterizzato !dal fatto che l'ugello ? collegato alla barriera superiore dello stantuffo?.
14) Dispositivo secondo le rivendicazioni da 7 a 13, caratterizzato 'dal fatto che un tappo ? posizionato
alla sommit? dello stantuffo.
15) Dispositivo secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che l'ugello ? collegato da un canale che passa attraverso il tappo.
16) Dispositivo secondo le rivendicazioni da 7 a 15, caratterizzato dal fatto che un serbatoio di solvente di colonna ? collegato alla colonna dinamica.
17) Dispositivo secondo le rivendicazioni da 7 a 16, caratterizzato dal fatto che il tubo di prova ? chiuso nel suo fondo.
18) Dispositivo secondo le rivendicazioni da 7 a 17, caratterizzato dal fatto che lo stantuffo ? dotato
di mezzi per accumulare una sacca di gas.
19) Dispositivo secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che detti mezzi per accumulare
detta sacca di gas consistono di scanalature orizzontali, verticali o ? ispirale,^'posizionate suIlo*stan- ? tuffo.
20) Dispositivo secondo le rivendicazioni da 7 a 19, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo ? fatto di un materiale inerte.
21) Dispositivo secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che detto materiale inerte ? scelto dal gruppo consistente di metallo, vetro, polietilene o altro adeguato materiale plastico.
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