JPH06510600A - 痕跡量混入物の検出方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 痕跡量混入物の検出方法及び装置 本発明は一般的にはクロマトグラフ操作に有用な方法及び装置に関する。より詳 細には、本発明は生成物試料中に存する可溶性の痕跡量混入物の検出に関する。

木見皿立宜量 精製した生成物試料中には、通常の方法では検出困難だが、生理学的に大きな作 用を有することがある痕跡量の可溶性混入物が存することがある。従って、痕跡 量の溶質不純物の存在は、生成物の合成または精製の過程、またはその後に、測 定の必要性がしばしばある。痕跡量の溶質不純物の存在を含めて、生成物製造の 質的内容の評価が、製造工程の各段階及び生成物が使用に供される最終段階で必 要となることがある。更に、米国連邦法の規制は多数の消費者製品、特に食品及 び医薬品に関して純度の特定を指示している。一般的に、生成物製造の品質は同 定確認、例えば特徴とする単位活性の為に、予め設定した規準を用いて測定する 。対象とする生成物が蛋白質の場合、同定は分子量、トリプシン分解／ペプチド 分布図、及び／または免疫親和性でもある。生成物中の可溶性の痕跡量混入物の 存在は、生成物自体の存在で隠されていることが、特に生成物が高度濃縮調製品 である場合にある。

生成物製造中の痕跡量の溶質不純物の検出は困難なことがあり、ムダに時間を要 する。そしてもし試料中に存する生成物の量が、存在する不純物の量と比較して 非常に大量であれば、大量の生成物を無駄にすることなしには不可能でさえある 。この点は医薬品として有用な製品中に存する微量の不純物が、患者に投与した 際に重大な身体的副作用を引き起こし得る場合には問題となる。痕跡量の混入物 の検出は正確、迅速で、適応性があり、且つ再現性がなければならない。

痕跡量の溶質は、組換え蛋白質混合物の背景成分に対して作成したポリクローナ ル抗血清を用いて検出してきた。例えば、もし組換え蛋白質が細菌中で産生され れば、抗血清は組換え蛋白質をコードするＤＮＡに依って形質転換されていなか った同一細菌菌株から得られた総蛋白質に対して生じさせることが可能である０ 本抗血清は細菌蛋白質のみを検出し、組換え蛋白質は検出しない、しかしながら 、この型の抗血清を利用する免疫検定の感度の限界は、免疫検定自体の感度の限 界即ちＩＱ−１２モルである。

また、抗原の複合混合物を用いて作成したポリクローナル抗血清を利用するこの 種の検定の再現性は非常に低い。

クロマトグラフ及び電気泳動の技術は、混合物中に存する複数溶質成分の分離方 法として周知の技術である。これらの技術は特に化学及び生物工学の分野で有用 である。真のクロマトグラフィーは２または３相の間の異なった溶質の分配に従 った分離を述べている０分配相は通常個体及び液体であり、溶質の分配は個体層 、典型的には微粒子のマトリックスを、流動相の存在下に通過する異なった移動 性の結果として現われる０層を通過する溶質の移動は、圧力勾配に従い、通常“ 液体クロマトグラフィー２と呼ばれる。これに反して、電気泳動システムは溶質 をその電気泳動の運動性、等電点、及び／または大きさを識別するマトリックス 中の異なった移動性を基本として分離する。

これらのシステム中の溶質の移動は、与えられた電界からの電圧勾配に依って行 なわれる。

クロマトグラフィー　マトリックスは、大きさ、荷電、疎水性相互作用、及び／ またはマトリックスまたはその結合部位への特異的親和性を含む多数の規準のい ずれかに従って成分に分離できる。混合物中の成分は、マトリックスへの親和性 が異なる為に、成分がマトリックスを通過する際の親和性で分離し、マトリック スを順次通過して時間的及び空間的に分離する０種々の分離成分、または流出す る順番内の与えられた対象成分の位置の決定は、通常マトリックスを流出する一 連の分画として液相、即ち溶出流の採取に依り、またこれらの分画がら試料を採 取して、技術分野で知られた、いずれかの方法に依ってその含有量を特定する。

混合物中の種々の成分の解離は、数種の要件に依存しており、その主たるものは 下記の様にマトリックスの分配能及びシステムの理論的なプレートの高さ及びプ レート数である。一般的に、表面積対容量比の大きいことが望ましい、液体クロ マトグラフィー　システムのマトリックスは、典型的にはカラムと呼ばれる円筒 形のクロマトグラフィー　システムに収納される。電気泳動システムに於ては、 高分解は負荷された電界に依って生じる熱の効果的な除去が必要である０毛細管 電気泳動、またはその他のジュール熱源を効果的に放散させる大きな表面積対容 量比を設けた電気泳動モジュールが、分解を大きく損なうことなく迅速な分析を 可能とする。

又１食！ｈ 本発明の特徴は、溶液中の主要成分が生成物である溶液中に存する痕跡量の溶質 を検出する方法であり、本方法は溶液を生成物を抽出する装置を通過させて、実 質的に生成物を含まず、残存する痕跡量の単一または複数の溶質を含有する溶出 液を生じる様に、流入させる段階を含み、溶出液を痕跡量の溶質の吸着剤に流入 させて、痕跡量の溶質を順次蓄積させ、蓄積した痕跡量の溶質を吸着剤から溶出 させて、痕跡量の溶質の検出可能量を含有する溶離液分画を製造するにある。

本発明の別の態様に於て、本発明は主要成分として生成物を含有する溶液中の、 痕跡量の溶質を検出する為の装置を特徴とし、本装置には溶液中から生成物を抽 出して、実質的に生成物を含まないが、痕跡量の溶質を含有する溶出液を製する 装置、痕跡量の溶質を溶出液から順次抽出して蓄積する装置、及び痕跡量の溶質 を吸着剤から溶出して痕跡量の溶質の検出可能量を含有する溶離液分画を製造す る装置を特徴とする。

本発明の双方の態様の好ましい実施態様に於ては、試料溶液、即ち溶液から試料 生成物の主要成分を抽出する為にクロマトグラフィー　マトリックス、好ましく は、潅流クロマトグラフィー　マトリックス、最も好ましくはアフィニティー　 クロマトグラフィー　マトリックスが使用可能である。好ましい別の実施１！欅 に於ては、痕跡量の溶質の吸着剤は、非選択的に蛋白質と結合し得る潅流マトリ ックスであり、また本装置は更に吸着剤から溶出される痕跡量の溶質を検出する 装置を含む、痕跡量の溶質は、例えば１種以上の発熱性物質（パイロジエン）ま たはその他の細菌性蛋白質であり、溶解した生成物は組換え蛋白質である。

ここに用いる様に゛°生成物“は抽出前の試料溶液の主要成分を現わし；°“痕 跡量の溶質”は生成物自体以外に生成物試料に痕跡量、即ち１０％未満存在する 可溶性成分を現わし、典型的には生成物試料中に１．０重量％未満存する可溶性 成分を現わし；“抽出”は実質的にすべて、即ち試料溶液の成分から９５％を超 える量の除去を現わし；試料溶液成分の“吸着”は接触する表面への成分の付着 を現わし；　“溶出液”は流出する流れを現わし；°°溶離液”は溶出された容 量を現わし；°“発熱性物質”は患者に発熱を来す蛋白質またはその他の混入物 であり；°検出可能量”は常法で検出可能な試料の成分量を現わし；“組換え蛋 白質”は組換えＤＮＡ技術から誘導された蛋白質を現わす。

本発明は比較的純粋な生成物である生物学的試料中の可溶性不純物、例えば発熱 性物質の痕跡量を検出する為の方法及び装置を提供する０本発明方法及び装置の 利点には、痕跡量の不純物検出の迅速性、質的内容、及び信幀性が含まれる。主 要な利点は細菌性エピトープに対するポリクロナール抗体及び関連する変異体の 使用の回避並びに経費の節減である。その他の本発明の分析検定技術の主要な利 点は、本質的に非常に高感度、即ち本発明の方法及び装置は、充分な量の試料が 入手可能であることを前提として、免疫学的検定法より一層希釈された不純物の 検出が可能である。試料中の主要生成物成分は、試料溶液からの生成物抽出の過 程で除去され、可溶性の痕跡量の混入物は、溶出後に検出可能となる痕跡量の溶 質が得られるに充分な、生成物が除かれた試料溶液量から吸着段階で蓄積される から、少容量の痕跡溶質の溶出では、比較的生成物が少なく、混入物が大量であ る試料溶液が得られる。混入物に富んだ溶出液は、次いで常法に依って検出及び ／または定量可能となる０本方法及び装置は、迅速な液体の移送が可能であり、 第１及び第２の溶出液流との間に、再溶解に依る顕著な損失がない、その他の主 要な利点は溶出された混入物が溶出勾配に依って二次的に分離可能であり、それ に依って別個に検出され、同定可能となる。

本発明のその他の態様及び利点は、本発明の好ましい実施態様の記述から明かと なるであろう。

メ」Ｂλ直隼」口り吸 第１図は本発明の１実施態様を図示する。

第２図は試料中に生成物が溶解している状態で、痕跡量の混入物の分析検定前の 試料溶液（ａ）の２８０　ｎ＊のクロマトグラムを現わし、（ｂ）は試料中に生 成物が存在しない状態で、本発明に依る痕跡量の混入物の検出を示す。

光里優昆に至に五 本発明の方法及び装置は、第１図に示す本発明の１実施態様の図示を参照すると 理解されるであろう。生成物及び痕跡量の不純物の混合物を含有する試料１０は 、試料生成物成分と選択的に結合し得る第１システム１２に供給され、試料中か ら生成物を抽出する。抽出装置１２の能力は、少なくとも試料溶液から生成物を 実質的にすべて抽出するに充分大きく、更に大きい方が好ましい、この第１シス テムから流出する痕跡量の溶質不純物を含有する溶出流１４は、次いでバルブ３ ２を経由して痕跡量の不純物が吸着可能な第２システム１６を通過させて、試料 溶液から不純物を抽出する。比較的大容量の試料、及び従って生成物を抽出した 溶出液１４は第２システムを通過して、試料溶液から痕跡量の溶質を典型的には 非選択的に吸着し、かくして痕跡量の溶質混入物を蓄積する。第２システム１６ からの溶出液は、バルブ３４及び排出管３６を経由して廃棄されるか、未吸着の 混入物を含有しないことを確認する為に検出器１８を通過させる。痕跡量の溶質 は次いで、供給管３０及びバルブ３２から供給される溶離液に依って第２システ ムから溶出され、例えば第２システムから排出される痕跡量の不純物の、時間的 及び／または量的な推移の出力２０を生じさせる検出器１８を通過させる。痕跡 量の溶質が蛋白質の場合、第２システム１６は逆相、疎水性相互作用、イオン交 換、等の蛋白質結合マトリックスのいずれかであり、検出は通常の検出器、例え ば液体の薄層を透過する紫外吸収を測定するもので良い。蛋白質以外の痕跡量の 溶質は適当な通常の機器で検出可能である。

装置の高感度は、第２システムの不純物の濃縮能力の成果である、即ち：　（１ ）生成物抽出試料の比較的大量を通過させて蓄積し、また（２）不純物を比較的 少量の溶離液中に放出することに依る。従って、例えば１０−”　ｇ／ｍｌの生 成物及び１０−”　ｇ７ｇＡＩの不純物を含有する試料１００１が、装置を通過 可能である。

生成物（０，１ｇ）が、第１システム１２で抽出され、不純物（１０−ＩＯｇ） は第２システム１６に蓄積される０次いで、第２システム１６中の不純物は、例 えば溶離液１０μＬで溶出され、溶出液は検出可能濃度１０−ｌ０ｇ／１０−’ 　Ｌ、即ち１０−５ｇ／Ｌの検出器１８に送られる。

第１システム１２で抽出された生成物は、次いで溶出液を流路１１から、バルブ ２８、抽出器１２、バルブ３２、及び流路３３を経由して回収される。

本装置は当業者には公知の自動蛋白質製造システムに見られる様な多方向バルブ ２８．３２、及び３４を備えるのが好ましい、多方向バルブ２８は、流路９を介 して試料を、流路１１を介して溶離液を、または流路１３を介して平衡緩衝液を 、第１システム１２に交互に、所要流量のすべてを供給する。バルブ３２はシス テム１２から流出する試料溶出液または緩衝液を、システム１６に流入させる様 に調整して、溶離液をシステム１６に導入し、システム１２からの溶出液を、次 の分析検定または生成物の採取の為に流路３３に分割する様に調節する。バルブ ３４は第２システム１６の溶出液を廃棄路３６または不純物の含有の有無双方の 溶出液を検出器１日に流入させる。すべての多方向パルプは手動またはコンピュ ーター操作で行なわれ、液体の供給は、図示はしてないが単一または複数の定量 ポンプで行なわれる。多方向パルプには更に第１及び第２システムへの流速を減 じ及び／または所望の方向のみに向ける“流量分割”またはその他の機器を備え ることが可能である。

操作に際して、試料１０を、例えば定量ポンプを用いて多方向パルプ２８の流路 ９を介して第１システムの抽出装置１２に負荷する。試料が抽出装置１２を通過 するに連れて、試料生成物の成分はシステム１２内に保持され、溶出液は第１シ ステム１２から、流路Ｉ４を介して流出し、多方向バルブ３２を通って第２シス テムに流入させる。溶出液試料中に存する痕跡量の溶質は、第２システム１６に 保持される。全溶出液が一旦第２システム１６に流入すると、多方向バルブ３２ は、流路３０からシステム１６に流入させる洗浄液でシステム１６を洗浄する。

洗液はシステム１６から多方向バルブ３４及び流路３６を介して流出する。痕跡 量の溶質はシステム１６から、溶出緩衝液を用いて同様に流路３０及びバルブ３ ２を介してシステム１６に供給することが可能である。痕跡量の溶質を含む比較 的少量の溶出液は、バルブ３４を介して検出器１日に流入させる。検出は通常の 分析検定、例えば紫外吸収を用いた場合は吸収スペクトル（クロマトグラム）２ ０が描き出され、システム１６のクロマトグラフ法に依って分離された溶出試料 中に存する痕跡量の、１種または複数の溶質の存在及びその量を示す。

もし、抽出生成物が第１システム１２から回収されるなら、システム１２は流路 １３を介して供給される洗浄液で洗浄し、溶離液は流路１１を介してシステム１ ２に供給可能である。溶出された生成物試料は、システム１２から流路１４及び ３３を介して、一旦夕方向バルブを適切な位置に向けて回収する。上記の手順の 一部及び全部はコンピューター機構に依って自動化が可能である。

生成物の評価及び監視システムの一部として、本発明の方法及び装置は痕跡量の 混入物の存在を確認し、対象とする生成物と共に精製するに有用である。第１シ ステムが、試料混合物中の痕跡量の不純物の量及び組成に大きな影響を与えずに 、液相から対象生成物のすべてを主として選択的に抽出することを前提として、 試料中の痕跡量の不純物の存在及び濃度が、本発明に依って検出可能である。

本発明が生成物及び／または製法の監視試験の１部として有用である重要な特徴 の中には、溶質中の痕跡量の混入物の検出の迅速さ、質的内容、及び信頼性があ る０本方法及び装置は、理論的に第１及び第２のシステムに通常の肝ＬＣを具備 することが可能であるが、実際の使用には迅速な液体移送が、本装置内の両シス テムを通じて行なわれねばならず、第１の溶出液の流れと溶離液との間に大きな 解離度の低下があってはならない。

混合物中の分配された溶質の分離は、システムの通常はマトリックスである分配 成分及び理論的なプレート高さに対する種々の溶質の双方の親和性の関数である 。カラム　クロマトグラフィーの“プレート”は、溶質に適合可能な最大の均− 領域であると考え得る。カラムのプレート高さが低ければ低い程、個々のプレー ト（プレート数の多さ）に、より多く？８質がマトリックスを通過中に接触し、 類似する成分の間により良い分離が得られる。通常、マトリックス表面積に対す るカラム容量比が大きい程、プレート高さは低くなり、得られるプレート数が多 くなる。カラムは通常、対象成分を分離するに充分なプレート数が得られる様に 、可能な最少のマトリックス容量をデザインする。小容量はシステムを通過する 液体の移送速度を増加し、領域の広がりが減少する。好ましいマトリックスは孔 のない固形微粒子の充填マトリックスより、実質的に大きな表面積対容量比が得 られる多孔性微粒子である。

今日使用される特に好ましく有用な段階的移動分離システムはＨＰＬＣ（高性能 液体クロマトグラフィー）システムである。ＨＰＬＣカラムは均一な多孔性小型 ビーズ微粒子のマトリックスを使用する。これら小型ビーズを緻密に充填すると 液体の流れに高い抵抗を生じるので、機器は高圧で操作する様にデザインされ、 迅速な液体の移送が可能となる。緻密に充填された微粒子は大きな表面積対容量 比を生じて、分子量の小さい溶質の分離に優れる。しかしながら、通常のＨＰＬ Ｃシステムは、蛋白質の様な巨大分子量の溶質の分離に用いた際には良好には作 用しない。蛋白質の様な巨大分子量の溶質が、通常のＨＰＬＣマトリックスを通 過する速度は、微粒子間の大量移送が対流であるのに比して、微粒子小孔内の大 量の移動が拡散であるので大きく制限される。

一方高圧滴下の代償として流速の増加が得られるが、分離性が低下する傾向を生 じる。

これらの通常のＨＰＬＣ分析の限界は、潅流クロマトグラフィーを可能とする高 速クロマトグラフィー　マトリックスの使用に依って克服し得る。これらのマト リックスは、時に通常のマトリックスに用いられるものと、全体として同一サイ ズの微粒子からなっていることもあるが、微粒子内の小孔のサイズは大きくなっ ている。更に直径が大きくなった微粒子内を貫通する小孔、例えば６　、０００ 〜８．０００人に加えて、潅流クロマトグラフィーが可能な微粒子は、大きな貫 通小孔から分岐する５００〜１　、５００人の小孔の網目構造を存している。こ うしてもたらされた網目状構造は、微粒子内の拡散経路の長さに限界を生じて、 広い流速範囲に亘る微粒子小孔内の大量移送は、主として本質的には対流に依っ て行なわれる。この作用はこれらのシステムの移動相速度の増加は、分離を実質 的に損なわず、１　、０００ｃｍ／時間より長時間を要する通常のＨＰＬＣシス テムの１０〜１００倍となる。より詳細な潅流クロマトグラフィーの記述は米国 特許第５，０１９，２７０号（１９９１年５月２８日発行）及び、＾ｆｅｙａｎ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏ　８：　２０３ −２０６にあり、いずれもここに引用した。

潅流クロマトグラフィー　マトリックスの材料は、米国マサチュウセンツ州ケン ブリッジ在のＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｊｏｓｙｓｔｅｍｓ＋　Ｉｎｃ。

より市販されている。多孔性が増大した微粒子は潅流クロマトグラフィーを可能 にし、カラムに与える表面積をかなり増大させ、典型的には約３０〜５０　ｍ！ ／ｓ＋１の範囲内に迄達して、カラムプレートの高さを大きく低下させる。従っ て、小型カラム（ミクロカラム）が使用可能で、分析は従来は得られなかった速 度で、分離に有意な損失なしに行なわれる。

潅流クロマトグラフィー　マトリックスは、現在のところ本発明の第１及び第２ システム双方に好ましいマトリックスである。本装置に用いる潅流マトリックス は、混合溶液中の溶質を分配及び分離する様にデザインされ、当業者に公知の方 法を用いて所望に従って変更して、特定のクロマトグラフィー　システムを形成 することが出来る。本発明の実施に適当な潅流クロマトグラフィー　カラムも、 同様にマサチュウセッッ州ケンブリッジ在のＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ＋　Ｉｎｃ、より市販されている。

好ましくは、第１システム１２は、例えば生成蛋白質に対するポリクローナルま たはモノクローナル抗体の様な、固定化結合蛋白質を含存する、ポリスチレン　 ジビニル　ベンゼン多孔性微粒子から成る、潅流親和性クロマトグラフィー　マ トリックスである。第２システム１６は、蛋白質を非特異的に吸着する様に変性 した同じマトリックスから成って良い。

本発明の方法、特に第２システム１６で使用される溶質を分離する別の有用な方 法は電気泳動である。特に毛細管電気泳動では、適用された強電界に依って発生 したジュール熱を放散させるに必要な、表面積対容量比の大きい適切な配列が得 られる。

これら適用された強電界に対する耐容性に依って、毛細管電気泳動システムは、 潅流）ＩＰＬｃと同様に、分解能を損なうことなしに迅速な処理を可能とする。

更に、毛細管配列は小容量で必要な段数が得られ、システムをマイクロ　カラム として使用可能とする。従って、潅流ＨＰＬＣシステムと同様に、毛細管電気泳 動システムは、試料の必要量を高度に減量し、迅速な分析を可能とする。

電気泳動は分子を多様な形態で分離出来て、これらのすべてが毛細管システムで 実施可能である。最も有用な形態の中には、ゾーンまたは゛自由流動″　（“° 開放”）電気泳動、ゲル電気泳動及び等電点集束がある。ゾーン電気泳動は、固 体の支持体のないこと、分離は例えば液体の様な単−相内であることを特徴とす る。それにも拘らず、ゾーン電気泳動の分離記録、特に毛細管ゾーン電気泳動は 標準的な溶出クロマトグラフィーで得られる記録に類似し、またカラム　クロマ トグラフィーに就いて定義された段数及び分離の型どおりの概念に類似している 。

一般に、例えば拡散、ジュール熱及び／または伝導度の変動が原因となってシス テムに課せられたゾーン拡大の限界を、熟知して最少とすることを前提として、 通常のポリアクリルアミド°板状“ゲルを含めて、いずれの電気泳動システムも 使用可能である。例えば、約２００μｍ未満の厚さのチャンネルを有する等電点 集束及びゾーン電気泳動システムが、本発明の方法及び装置にを用と考えられる 。毛細管電気泳動を含めて電気泳動的の理論、適用、機器及び自動化の詳細な情 報は、当業者に既知の多数の資料に見出される。

特に有用な起源には、Ｋａｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ−＋　（１９８９）　Ｊ、Ｃｈ ｒｏｍａｔｏ　ｒ、＋旦２：　５８５−６１４、Ｆｏｒｅｔ　ｅｔ　ａｌ、＋　 （１９９０）　Ｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓｉｓ　ＩＩ：６６１−６６４、及び Ｎｏｖｏｔｎｙ　ｅｔ　ａｌ−＋　（１９９０）　Ｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓ ｉｓ　ｌｂ。

７３５−７４９　が含まれる。

上記した様に、第１システムは、溶液中に残存する可溶性不純物の濃度に、大き く影響してはならない。これはシステムの配列が重要であることを意味する。好 ましくは対象とする溶質の殆どすべてに適切に結合するマトリックスの最少容量 を使用すべきである。幸いなことに、マトリックスの性状はカラムの最上領域で 吸収を促進する傾向があるので、これが潅流クロマトグラフィーを実施する様に 設定したマトリックス固有の特徴となる。更に、カラムの形態は通過する溶質に 、複数ステージ（段数）を介して効果的な抽出を可能とする。潅流クロマトグラ フィー　システムを使用する重要な利点は、痕跡量の混入物の極く少量に対して 、妥当な時間内に必要とする試料の比較的大量を供給する様に、流速が速やかで なければならず、これは潅流クロマトグラフィー　マトリックスを使用すると最 高に得られる。もし生成物がカラムに１０倍の速度で負荷可能なら、これに依っ て分析検定に要する時間は１７１０位に短縮する。例えば、直径４．６　ｍｍの ）ＩＰＬｃカラムは、通常１．０　ｍｌ／分の流速で用いられる。潅流マトリッ クスは流速１０　ｍｌ／分で容易に用いられる。従って、試料１００　ｍｌを潅 流マトリックスに負荷するに１０分を要し、通常のＨＰＬＣマトリックスでは１ ００分を要する。

好ましくは、非特異的な吸収は約１　ｎｇ／１０μｍ未満でなければならない。

従って、結合表面、即ちマトリックスは実質的に不活性で、対象とする単一もし くは複数の溶質生成物を、好ましくは定量的に、試料中の不純物を多量に吸収せ ずに選択的に抽出出来ねばならない。もし所望ならば、第１システム中の非特異 的結合は、試料を負荷する前に潜在的な非特異的結合部位を先ずコーティングす ることで最少に出来る。当業者にはこの“コービ分子は溶出液の出力に影響しな い様に充分に結合せねばならないことを承知していなければならない。例えば、 検査試料中に存在することが既知である対照不純物をアフィニティー　カラムに 負荷して、カラムから流出する洗液中に不純物が検出されなくなる迄洗浄する。

生成物抽出器１２を通過する不純物の通過を確実にする方法は、洗液を第２シス テム１６を通過させて、選択的溶離液で反復洗浄することである。

溶解した生成物を選択的に抽出する為に適したマトリックスは、溶質と特異的に 相互結合可能なマトリックスである。好ましくは、これらの相互作用は可逆性で あり、システムは溶質をカラムから分離可能な、単一または複数の再生溶媒に依 って再生可能であり、システムを別の試料の分析検定の為に調整出来る。結合相 互作用が不可逆性であれば、マトリックスの能力は好ましくは複数の試料と不可 逆的に結合する程充分に大きくなければならない。有用な生成物特異的な結合部 位には、例えば生成物に特異的な免疫グロブリンの様な免疫吸着剤、及び対象と する生成物と特異的に相互作用可能なその他の蛋白質が含まれる０例えば、ホル モン、毒素、レシチン及びそれらの適当な受容体を含む、いずれかのリガンド及 び酵素複合物から成る、生成物と生成物に特異的な結合部位が考えられる。対象 とする生成物が酵素の場合、結合部位は偽基質または阻害物質から成る。通常、 生成物に特異的な結合部位（生成物特異的親和性吸収剤）は、与えられた対象の 生成物に対して生物学的親和性を示す固定化リガンドであれば良い。マトリック ス表面は、生成物に特異的な結合部位が、マトリックス表面に不可逆的に結合す る様に変更可能である。分析が完了して、痕跡量の溶質を検出器で検出した後に 、結合した生成物を溶出し、カラムは上記した様に次の試料測定の為に再生する 。特定の生成物への特異的な結合部位の１つは、システムから単一または複数の 再生溶媒を用いて除去され、第２の異なった溶質に特異的な第２の結合部位がシ ステムに供給される。例えば、蛋白質ＡまたはＧがマトリックス表面に共有結合 可能で、複数の異なった生成物に特異的な抗体が、順次マトリックスに結合され る。第１システムの生成物に特異的なマトリックスは、液体クロマトグラフィー 　システムまたは電気泳動システム、例えば毛細管電気泳動システムに導入する ことが出来る。或は、生成物と結合するシステムが毛細管内部表面、または表面 積対容量比が充分に大きい表面が得られる様に結合させる。毛細管クロマトグラ フィーは次いで圧力勾配または電圧勾配を用いて行なわれる。

第２システムは好ましくは、第１システムの溶出液中に存する痕跡量の混在物に 非選択的に結合出来るのが好ましい。例えば、カラムは蛋白質に非選択的に結合 するアニオン性基、カチオン性基または疎水性基を導入した潅流マトリックスか ら成ることが出来る。大量の溶出液は、実質的に試料中の痕跡成分の殆どすべて を蓄積する様に第２システムを通過させる。結果として、第１システムは比較的 大量の生成物を、第２システムの為に生成物が失われた試料溶液を大量に生成す る様に、結合する能力を有しなければならない。試料を第２システムに通過させ た後に、第２システムは痕跡量の成分を溶出する前に洗浄する、或は、痕跡成分 を直接第２システムから溶出する。対象とする生成物である試料中の主要成分を 含まない原試料から、痕跡量の不純物を濃縮して含有する溶離液は、次いで痕跡 量成分の存在を分析する。溶離液中に存する痕跡量の不純物の検出は当業者には 周知の方法、例えば紫外吸収に依って行なわれる。

第２（ａ）図及び第２（ｂ）図に示すクロマトグラムは本発明の効果を図示する 。クロマトグラムは吸収を横軸に、流量を縦軸に示す。第２（ａ）図は、生成物 の溶出を示す単一の大きなピーク４４に°′精製″された生成物の典型的な状態 を現わす。ピーク４４に隠されたのは、痕跡量の混入物４６．４６″、及び４６ ”の３つのピークであり、幻影として現れ、クロマトグラムの検討からは見出さ れない。第２（ｂ）図は第２システム１６から流出し、検出器１８で読みとられ た不純物の典型的な状態を現わす、これらの不純物は、カラム１２から生成物を 含まない比較的大量の流出液として、順次システム１６に累積的に蓄積され、次 いで比較的少量の溶離液を用いて溶出され、濃度の高くなった不純物の存在は容 易に検出される。これらのピークから各混在物の量を測定し、システムに導入さ れた試料の量を基に、不純物の濃度を算出することが出来る。

本発明はその他の特定の形態に実現可能である。

ηＭＥ ＴＩＭＥ 、、Ｎｏ　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０５０４３

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．主要部分が溶解した生成物から成る溶液中の痕跡量の溶質を検出する方法に 於て、以下の段階から成る方法；溶液を生成物を抽出する機器に流入させて、前 記生成物を実質的に含有せず、前記痕跡量の溶質を含有する溶出液を製し； 前記溶出液を痕跡量の溶質を吸着する機器に流入させて、その内部に前記痕跡量 の溶質を段階的に蓄積し；次いで前記痕跡量の溶質を前記吸着剤から溶出して、 前記痕跡量の溶質の検出可能量を含有する溶離液分画を製造する段階から成る方 法。
2. ２．請求項１の方法に於て、前記抽出機器がクロマトグラフィーマトリックスか ら成る方法。
3. ３．請求項２の方法に於て、前記抽出機器が潅流クロマトグラフィーマトリック スから成る方法。
4. ４．請求項２または３の方法に於て、前記クロマトグラフィーマトリックスが生 成物特異的アフィニティークロマトグラフィーマトリックスから成る方法。
5. ５．請求項１の方法に於て、前記痕跡量の溶質の吸着機器が非特異的な結合蛋白 質の為の機器から成る方法。
6. ６．請求項５の方法に於て、前記結合蛋白質の為の機器が潅流クロマトグラフィ ーマトリックスから成る方法。
7. ７．請求項１の方法に於て、前記痕跡量の溶質が単一または複数の発熱性物質か ら成る方法。
8. ８．請求項１の方法に於て、前記の溶解生成物が組換え蛋白質から成る方法。
9. ９．主要部分が溶解された生成物から成る溶液内の痕跡量の溶質を検出する装置 に於て装置が； 溶液から生成物を抽出して、前記生成物が実質的に存在せず、前記痕跡量の溶質 を含有する溶出液を製造する機器；前記溶出液から痕跡量の溶質を吸着し、段階 的に蓄積する装置；及び 前記痕跡量の溶質を前記吸着剤から溶出して、前記痕跡量の溶質の検出可能量を 含有する溶出分画を製造する機器から成る装置。
10. １０．請求項９の装置に於て、更に前記溶出された痕跡量の溶質を検出する機器 を具備する装置。
11. １１．請求項９の装置に於て、前記抽出装置がクロマトグラフィーマトリックス から成る装置。
12. １２．請求項１１の装置に於て、前記クロマトグラフィーマトリックスが潅流的 である装置。
13. １３．請求項１１または１２の装置に於て、前記マトリックスが生成物に特異的 なアフィニティークロマトグラフィーマトリックスから成る装置。
14. １４．請求項９の装置に於て、前記吸着機器が蛋白質結合マトリックスから成る 装置。
15. １５．請求項９の装置に於て、前記蛋白質結合マトリックスがクロマトグラフィ ーマトリックスから成る装置。
16. １６．請求項１５の装置に於て、前記クロマトグラフィーマトリックスが潅流的 である装置。
17. １７．請求項９の装置に於て、前記痕跡量の溶質が単一または複数の発熱性物質 から成る装置。
18. １８．請求項９の装置に於て、前記溶解した生成物が組換え蛋白質から成る装置 。
19. １９．請求項９の装置に於て、更に試料、溶離液、及び緩衝液を、交互に前記抽 出機器を通過させる機器を具備する装置。
20. ２０．請求項９の装置に於て、更に前記溶出液流及び溶離液を、前記吸着機器を 交互に通過させる機器を具備する装置。
21. ２１．請求項９の装置に於て、更に前記抽出機器から前記生成物を採取する機器 を具備する装置。