JP2002527748A - 混合物の迅速液体クロマトグラフ分離と物質同定の方法および装置 - Google Patents

混合物の迅速液体クロマトグラフ分離と物質同定の方法および装置

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、混合物の迅速液体クロマトグラフ分離と物質同定の方法、および装置に関する。本発明は、分析的あるいは半予備的規模の範囲において、混合物の液体クロマトグラフ分離、物質の単離と同定のための方法と装置を提供することを目的としており、これにより、混合物の活性試験を不要とし、混合物の分離や個々の物質の単離と同定を従来よりも迅速に行うことができるものである。上記目的は、物質の混合物が、ソフトウェア制御の迅速液体クロマトグラフ２工程分離の第１工程において予備分離され、収集カラムに析出した予備分離された画分が、第２工程における少なくとも二つの分離ラインにおいて並行する微細分離にかけられ、微細分離された画分が、その都度並行する操作で同定かつ単離されることを特徴とする方法と装置によって達成される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、請求項１と請求項５の前文にあるように、混合物（物質の混合物）
の迅速液体クロマトグラフ分離と物質同定の方法、および装置に関する。
【０００２】 背景技術 たとえば薬学研究においては、しばしば、混合物から薬学的に活性な物質を単
離するという問題にぶつかる。このように、潜在的な活性を見つけるために、天
然生成物、或いは組み合わせの化学により製造された混合物からの抽出が試験さ
れてきた。そして、活性を有することがわかった物質の混合物から、複雑な分離
手順によって活性物質を単離することが試みられた。その後、このようにして単
離された混合物からの個々の物質が、再び活性試験に供された。見つけられた個
々の活性物質については、既知の活性物質と区別しなければならないので、その
構造が研究された。この方法の一つの欠点は、混合物を試験するとき、重ね合わ
せ効果によって個々の物質の活性が抑えられ、活性物質を検出できなくなってし
まう可能性があることである。他の欠点は、重ね合わせ効果による活性のシミュ
レーションをしてしまい、次いで、混合物の仮想上の活性物質を見つけるための
、経費のかかる無用な探索をしてしまう、ということである。また、これに加え
て不利なことは、少なくとも二つの生物学的活性に関する試験と、経費のかかる
複雑な単離手順を踏んだ後にやっと既知の活性物質を除外することができる、と
いうことである。一般的に、前記のような試験を行うためには大量の物質が必要
である、すなわち、分離操作はかなり大きな予備的規模で行わなければならない
。しかしながら、資本投入の見地からすれば、予備的規模の装置は分析的規模の
装置と比べてずっと大きな経費がかかる。その上、予備的規模の装置は、分離の
ときに大量の溶媒やバッファ物質を使用するので、操作に経費がかかり、かつ、
廃棄物処理や環境汚染といった問題を生ずる。
【０００３】 本発明は、上記のような問題点に鑑み、分析的あるいは半予備的規模の範囲に
おいて、混合物の液体クロマトグラフ分離、物質の単離と同定のための方法と装
置を提供することを目的としており、これにより、混合物の活性試験を不要とし
、混合物の分離や個々の物質の単離と同定を従来よりも迅速に行うことができる
ものである。
【０００４】 発明の開示 前記した目的は、請求項１と請求項５の特徴部分によって、達成される。 従属項には、具備した場合に、より有利になる事項が特定されている。
【０００５】 本発明は、種々の効果を有する。物質の二重試験、すなわち混合物のときの試
験と単離後の試験が不要となる。本発明によれば、複雑で高コストそして時には
不完全な、混合物の第１の活性試験が省略できる。そのかわりに、組み合わされ
た単離と同定に続いて、潜在的に新規な活性物質だけが、その後の試験の対象と
なる。従来までは普通に行われていた経費のかかる既知物質の処理なしで実行で
きる。新規の活性物質を検出するための時間とコストの投入は、大いに削減され
る。加えて、本発明の手順は信頼性が高い。なぜなら、未知の個々物質について
の試験結果は、あいまいなところがなく、また、混合物の中に存在する活性物質
はすべて検出されるからである。
【０００６】 研究対象の混合物は、２工程分離にかけられる。分離カラムと固相抽出カラム
（収集カラム）は、本発明の仕方でポンプ群と接続されているので、第１の分離
工程からの多様な画分の並行分離が、第２のクロマトグラフ分離工程において可
能である。したがって、本発明の装置は迅速に作動して、既知の２工程装置と比
べてより経済的である。
【０００７】 検出器から得られるクロマトグラフやスペクトルと第１分離工程からの保持範
囲と第２工程からの保持時間とに対して、データベースにある既知物質の情報を
、よく知られた直接的コンピュータ制御による仕方で比較することにより、個々
の物質が同定される。紫外線吸収、質量分析、光散乱、蛍光、赤外線吸収、核磁
気共鳴などの各種分析方法が検出と同定の方法として可能である。このほかに、
たとえば試料の出所や起源といった付加的な同定パラメータを活用することもで
きる。混合物中の物質を同定したり、既知の物質を除外したりするのにより少数
の試験が必要なので、装置一式は分析的規模、そして半予備的規模に寸法合わせ
することができる。従来、普通に用いられてきた予備的装置に比べると、分析的
あるいは半予備的装置は、初期経費とランニングコストにおいてずっと経済的で
ある。本発明の方法と装置は、溶媒やバッファ物質の消費が少ないので、廃棄物
が少量で済むことにより環境保全の見地から有利である。
【０００８】 発明を実施するための最良の形態 以下、図面と具体例により、本発明を詳細に説明する。 図１〜図７は、本発明による装置の輪郭と流れの仕組みを示しており、各図は
一つの分離カラムと三つの下流分離ラインを含んでいる。
【０００９】 三つのポンプ２．１〜２．３を含むポンプ群２は、６路２状態弁（６つの通路
を有し、２つの切り換え状態を有する弁）３．１、６路２状態弁３．３、３路２
状態弁５．７を経由して、供給カラム群６、第１分離工程の分離カラム１０、並
行操作が可能な三つの分離ラインを含む第２分離工程へ接続されている。この三
つの分離ラインは、それぞれ上流に６路２状態弁３．５，３．６，３．７を有し
ている。このようにして、所望組成の可動相（mobile phase）を、連続的あるい
は並行的に、装置の任意の部位に運ぶことができる。
【００１０】 各分離ラインは、収集カラム群７，８，９と分離カラム群１１，１２，１３を
有する。たとえば、一つの分離カラム群１１は収集カラム群７と分離カラム群１
１を有しており、収集カラム群７は収集カラム７．１〜７．６を含み、分離カラ
ム群１１は分離カラム１１．１と１１．２を含む。図中の他の二つの分離ライン
も同様の構成である。これについて種々の変形、たとえば、供給カラム群６中に
供給カラム６．１〜６．６以外の供給カラムを設けたり、複数の分離カラム１０
を設けたり、収集カラム群７，８，９以外の収集カラム群を設けたり、これらの
収集カラム群の中に６個を超える収集カラムを設けたり、各群あたり２個を超え
る分離カラムを有する分離カラム群１１，１２，１３に更にまたこれ以外に分離
カラム群を設けたりする変形が可能である。
【００１１】 以下に、本発明による方法の典型的な操作順序について説明する。混合物（物
質の混合物）試料を溶媒に溶かし、吸着剤をその都度添加する。次いで、ロータ
リーエバポレータを用いて溶媒を除去し、吸着剤で被覆された試料物質が流動性
をもつようにする。吸着剤で被覆された混合物を、供給カラム群６の供給カラム
６．１〜６．６に満たして確保する。その後のプログラム順序ステップはソフト
ウェアによって制御される。
【００１２】 分離カラム１０は図１にしたがって平衡にされる。これと並行して、供給カラ
ム群６から空気が除去される。ポンプ２．３，３路２状態弁５．７，６路２状態
弁３．１，３．３を経由して、乾燥した供給カラム６．１〜６．６のうち一つの
供給カラムから、水を用いて空気が除去され、次に注入される。これと同時に、
ポンプ２．１と６路２状態弁３．１，３．３経由で、分離カラム１０が適切な可
動性の溶媒と平衡させられる。
【００１３】 図２は、分離カラム１０での第１分離工程における混合物の分離と、それに引
き続いて起きる、収集カラム群７の収集カラム７．１〜７．６を含む分離ライン
における画分の吸着を示す説明図である。
【００１４】 供給カラム６．１〜６．６のうち一つの供給カラムから空気が除去されると、
分離プログラムが開始される。最初、６路２状態弁３．３と３．５が状態切り換
えされる。低圧弁１．１〜１．３を含む低圧弁群１を経由して、可動相の成分が
ポンプ群２によって系内に供給される。可動相はポンプ２．１の低圧弁１．１経
由で運ばれ、系は平等に、あるいは等級をつけて運転される。６路２状態弁３．
３と７路６状態弁４．１／４．２を経由して、可動相がポンプ２．１によって、
そこから試料物質が処理される供給カラム６．１〜６．６のうちの特定供給カラ
ムに運ばれる。分離されるべき試料は、供給カラム６．１〜６．６のうち一つの
供給カラムから分離カラム１０へ移動される。６路２状態弁３．４と検出器１４
．１経由で、分離カラム１０から吐き出される分離された試料成分は、Ｔ片１７
に到着する。このＴ片１７にて、ポンプ２．２と６路２状態弁３．１経由で、水
が可動相に混合される。混合する水の量は、分離される試料の極性に依存する。
水によって可動相の極性が増加する場合は、収集カラム群７の収集カラム７．１
〜７．６上の吸着が可能である。最初は、６路２状態弁３．５経由で収集カラム
群７上の吸着がなされる。ここで、収集カラム７．１〜７．６は、次々に画分を
詰め込まれる。
【００１５】 図３は、収集カラム群８の収集カラム８．１〜８．６上の、更なる画分の吸着
を示す説明図である。収集カラム群７の全収集カラムに画分が詰め込まれると、
６路２状態弁３．５，３．６が収集カラム群８を溶出液流れの方に切り換える。
そうすると、収集カラム８．１〜８．６が次々に画分を詰め込まれる。
【００１６】 図４は、収集カラム群９の収集カラム９．１〜９．６上の、画分の吸着を示す
説明図である。収集カラム群８の全収集カラム８．１〜８．６に画分が詰め込ま
れると、６路２状態弁３．６，３．７が収集カラム群９を溶出液流れの方に切り
換える。そうすると、収集カラム９．１〜９．６が次々に画分を詰め込まれる。
次の操作順序ステップにおいて、三つの収集カラム群７，８，９上に吸着した画
分は並行して溶出され、適切に割り当てられた分離カラム群１１，１２，１３上
で更に分離される。
【００１７】 分離カラム群１１，１２，１３は、それぞれの分離に先立って平衡にされてい
る。図５は、分離カラム群１１，１２，１３の平衡を説明する図である。平衡に
するために、ポンプ２．１と６路２状態弁３．１，３．５を経由して、可動相が
分離カラム群１１の分離カラム１１．１，１１．２に運ばれる。そこから可動相
が、６路２状態弁３．４、検出器１４．１と画分収集器１５．１を経由して廃棄
される。並行して、分離カラム群１２の分離カラム１２．１，１２．２が、ポン
プ２．２、６路２状態弁３．１，３．６、検出器１４．２と画分収集器１５．２
を経由して平衡にされる。同様に、並行して、分離カラム群１３の分離カラム１
３．１，１３．２が、ポンプ２．３、６路２状態弁３．７、３路２状態弁５．７
、検出器１４．３と画分収集器１５．３を経由して平衡にされる。
【００１８】 図６は、分離カラム群１１，１２，１３を用いての、収集カラム群７，８，９
上に吸着した画分の並行分離を説明する図である。分離工程を開始させるため、
ポンプ群２のポンプ２．１と６路２状態弁３．１，３．５経由で、可動相が収集
カラム群７に運ばれる。収集カラム群７（すなわち収集カラム７．１）からの第
１の溶出画分は、６路２状態弁３．５経由で分離カラム群１１に送られる。そこ
で、分離カラム１１．１または１１．２のいずれかが状態切り換えされる。この
切り換えは、ソフトウェア制御で行ってもよい。次いで、分離された成分は、６
路２状態弁３．４，３．５経由で検出器１４．１に送られる。電子制御ユニット
のソフトウェアは、信号をピーク検出により評価し、分離された成分を画分収集
器１５．１の適切なバイアル（ガラス瓶）中へ導く。同時に、画分収集器１５．
１の時間制御も可能である。この時間制御は、検出器を通過するピークがない場
合、自動的に活性化される。
【００１９】 並行して、ポンプ２．２と６路２状態弁３．１，３．６経由で、可動相が収集
カラム群８に運ばれる。収集カラム群８（すなわち収集カラム８．１）からの第
１の溶出画分は、６路２状態弁３．６経由で分離カラム群１２に送られる。そこ
で、分離カラム１２．１または１２．２のいずれかが状態切り換えされる。この
切り換えは、ソフトウェア制御で行ってもよい。分離された成分は検出器１４．
２に送られる。この場合においても、ソフトウェアは信号をピーク検出により評
価し、分離された成分を画分収集器１５．２の適切なバイアル中へ導く。同様に
、画分収集器１５．２の時間制御も可能である。この時間制御は、検出器を通過
するピークがない場合、自動的に活性化される。
【００２０】 二つの分離ラインにおける動作と並行して、第３の分離ラインが分離工程を開
始させるべく活性化される。ポンプ２．３，３路２状態弁５．７と６路２状態弁
３．７経由で、可動相が収集カラム群９へ送られる。収集カラム群９（すなわち
収集カラム９．１）からの第１の溶出画分は、弁３．７経由で分離カラム群１３
に送られる。そこで、分離カラム１３．１または１３．２のいずれかが状態切り
換えされる。この切り換えは、ソフトウェア制御で行ってもよい。分離された成
分は検出器１４．３に送られる。下流にある画分収集器１５．３は上記したよう
に制御される。それぞれの第１の画分のうちの一つが並行して処理された後、分
離カラム群１１，１２，１３が、準備のために、また次の画分を分離するために
、再び平衡にされる（図５参照）。次いで、収集カラム群７，８，９の７路６状
態弁４．３／４．４、４．５／４．６、４．７／４．８が状態切り換えされ、図
６に示されたように、第２画分の処理ができるようにする。これらの操作はすべ
ての画分が処理されるまで続けられる。
【００２１】 図７は、収集カラム群７の収集カラム７．１〜７．６の平衡を説明する図であ
る。このプログラム順序ステップにおいて、収集カラム７．１〜７．６は水で洗
浄され、次のサイクルに備える。この洗浄は、ポンプ２．２，６路２状態弁３．
１，３．５，３．６，３．７、収集カラム群７の７路６状態弁４．３／４．４を
経由して、連続的に行われる。収集カラム群８，９の平衡が、類似の仕方で行わ
れる。６路２状態弁３．５と３．６が状態切り換えされ、ポンプ２．２，６路２
状態弁３．１，３．５，３．６，３．７、収集カラム群８の７路６状態弁４．５
／４．６を経由して、収集カラム８．１〜８．６が平衡にされる。次いで、６路
２状態弁３．６と３．７が状態切り換えされ、ポンプ２．２，６路２状態弁３．
１，３．５，３．６，３．７、収集カラム群９の７路６状態弁４．７／４．８を
経由して、収集カラム９．１〜９．６が平衡にされる。このプログラム順序に次
いで、供給カラム群６の７路６状態弁４．１／４．２が次の供給カラム（すなわ
ち６．２）に状態切り換えされ、そして全プログラムサイクルが再び開始される
（順序ステップ１：図１などに描いてある分離カラム１０の平衡と、供給カラム
６．２のガス抜き）。
【００２２】 第２の試料を処理した後、次の供給カラム６．３が溶出液流れの方に切り換え
る。処理に使用した試料供給カラムは、何時でも新品と取り替えることができる
ので、数多くの試料について連続操作が可能である。
【００２３】 第１と第２の分離工程の際、クロマトグラム、保持データとスペクトルは、検
出器１４．１，１４．２，１４．３を経て集められ、コンピュータで直接処理さ
れ、そして既知物質のデータと比較される。このようにして、既知の物質が同定
され、オンラインモードで区別される。疑わしい場合は、分離や単離に次いでオ
フラインで得られた付加的なデータが、同定のために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１の分離工程における平衡と供給カラム群の洗浄の作動順序を示す説明図で
ある。
【図２】 第１の分離工程における混合物の分離と第１の収集カラム群の上への画分の吸
着を示す説明図である。
【図３】 第１の分離工程における混合物の分離と第２の収集カラム群の上への画分の吸
着を示す説明図である。
【図４】 第１の分離工程における混合物の分離と第３の収集カラム群の上への画分の吸
着を示す説明図である。
【図５】 第２の分離工程の分離カラム群の平衡を示す説明図である。
【図６】 第２の分離工程における吸着画分の並行分離を示す説明図である。
【図７】 収集カラム群の平衡を示す説明図である。
【符号の説明】 １ 低圧弁群 １．１ 低圧弁 １．２ 低圧弁 １．３ 低圧弁 ２ ポンプ群 ２．１ ポンプ ２．２ ポンプ ２．３ ポンプ ３ ６路２状態弁 ３．１ ６路２状態弁 ３．２ ６路２状態弁 ３．３ ６路２状態弁 ３．４ ６路２状態弁 ３．５ ６路２状態弁 ３．６ ６路２状態弁 ３．７ ６路２状態弁 ４ ７路６状態弁 ４．１ ７路６状態弁 ４．２ ７路６状態弁 ４．３ ７路６状態弁 ４．４ ７路６状態弁 ４．５ ７路６状態弁 ４．６ ７路６状態弁 ４．７ ７路６状態弁 ４．８ ７路６状態弁 ５ ３路２状態弁 ５．１ ３路２状態弁 ５．２ ３路２状態弁 ５．３ ３路２状態弁 ５．４ ３路２状態弁 ５．５ ３路２状態弁 ５．６ ３路２状態弁 ５．７ ３路２状態弁 ６ 供給カラム群 ６．１ 供給カラム ６．２ 供給カラム ６．３ 供給カラム ６．４ 供給カラム ６．５ 供給カラム ６．６ 供給カラム ７ 収集カラム群 ７．１ 収集カラム ７．２ 収集カラム ７．３ 収集カラム ７．４ 収集カラム ７．５ 収集カラム ７．６ 収集カラム ８ 収集カラム群 ８．１ 収集カラム ８．２ 収集カラム ８．３ 収集カラム ８．４ 収集カラム ８．５ 収集カラム ８．６ 収集カラム ９ 収集カラム群 ９．１ 収集カラム ９．２ 収集カラム ９．３ 収集カラム ９．４ 収集カラム ９．５ 収集カラム ９．６ 収集カラム １０ 分離カラム １１ 分離カラム群 １１．１ 分離カラム １１．２ 分離カラム １２ 分離カラム群 １２．１ 分離カラム １２．２ 分離カラム １３ 分離カラム群 １３．１ 分離カラム １３．２ 分離カラム １４ 検出器群 １４．１ 検出器 １４．２ 検出器 １４．３ 検出器 １５ 画分収集器群 １５．１ 画分収集器 １５．２ 画分収集器 １５．３ 画分収集器 １６ 廃棄物 １６．１ 廃棄物 １６．２ 廃棄物 １７ Ｔ片
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ノッツェ、ホルガー ドイツ国 デー−13591 ベルリン、シュ トラッセ 345 ヌマー ６ (72)発明者 ゴート、ラルフ ドイツ国 デー−14167 ベルリン、シー ホフシュトラッセ 52

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 物質の迅速液体クロマトグラフ分離と同定の方法であって、
    物質の混合物が、ソフトウェア制御の迅速液体クロマトグラフ２工程分離の第１
    工程において予備分離され、収集カラムに析出した予備分離された画分が、第２
    工程における少なくとも二つの分離ラインにおいて並行する微細分離にかけられ
    、微細分離された画分が、その都度並行する操作で同定かつ単離されることを特
    徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記第１の工程において物質の混合物の前記予備分離が連続
    して行われ、前記第２の工程における微細分離が、連続的におよび／または並行
    して行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記第１の工程の後および前記第２の工程の後に、少なくと
    も一つの検出器（１４．１）が用いられることを特徴とする、請求項１または２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 分離ラインにおいて分離され、単離された物質が、付加的な
    精製、特に吸着精製にかけられることを特徴とする、請求項１〜３のうちいずれ
    か１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 物質の迅速液体クロマトグラフ分離と同定のための装置であ
    って、複数の分離カラムと、複数の収集カラムと、複数の供給系と、複数の検出
    器と、複数の画分収集器とを備えており、これら構成要素のあいだの相互作用は
    中央制御ユニットにより制御され、複数の並行する液体クロマトグラフ分離ライ
    ンが少なくとも一つの分離カラム（１０）の下流に配設され、前記各分離ライン
    は分離カラム群（１１，１２，１３）、収集カラム群（７，８，９）、検出器群
    （１４）と画分収集器群（１５）の組み合わせから構成され、可動相を運ぶため
    の三つのポンプ（２．１，２．２，２．３）からなるポンプ群（２）が前記分離
    カラム（１０）と前記分離ラインの両方に接続され、ソフトウェアにより切り換
    えられる多通路弁が上記個々の構成要素の間に配設されていることを特徴とする
    装置。
  6. 【請求項６】 前記各分離ラインが、その上流に一つの多通路弁（３．５，
    ３．６，３．７）を有することを特徴とする請求項５記載の装置。
  7. 【請求項７】 前記分離ラインの下流に、付加的な収集カラムが配設された
    ことを特徴とする請求項５または６記載の装置。
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