CN111537658A - 一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法及应用。本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，包括在对血清或血浆蛋白进行酶解处理之前，先对血清或血浆样品进行过滤富集，富集其中的低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白，然后再对过滤富集的产物进行酶解处理，用于后续的数据非依赖性采集检测。本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，预先对血清或血浆中的低分子量蛋白进行富集，并部分去除高丰度蛋白；可以有效的提升血清或血浆中低丰度蛋白的定量水平，为血清或血浆生物标志物的研究和发现提供了一种新的高效的方法和途径。
Description
技术领域
本申请涉及血清或血浆的蛋白检测领域，特别是涉及一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法及应用。
背景技术
蛋白质组学的研究已经开始成为当今生命科学研究的重点之一，血清/血浆作为蛋白质组学中的一员，已经受到越来越多的重视。数据非依赖性采集(Data independentacquisition，DIA)定量检测技术，是将整个质谱扫描质量范围分为若干窗口，依次对每个窗口的所有离子进行碎裂，采集全部子离子信息；该技术无需指定目标肽段，扫描点数均匀，利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选，同时可实现数据回溯。DIA定量技术适用于多生物样本中的蛋白质组非标定量比较，差异蛋白质的发现等；具有定量重现性和准确度高、定量蛋白质通量高等优点。
然而由于血清/血浆的复杂性以及血清/血浆中大部分高丰度蛋白的影响，使得血清/血浆中的低丰度蛋白处于一个较低的定量水平。并且这些低丰度蛋白可能与疾病密切相关，对于寻找疾病生物标志物具有重大意义。因此，如何提升血清/血浆中低丰度蛋白的定量水平是目前需要解决的一个问题。
发明内容
本申请的目的是提供一种改进的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法及其应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，包括在对血清或血浆蛋白进行酶解处理之前，先对血清或血浆样品进行过滤富集，富集其中的低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白，然后再对过滤富集的产物进行酶解处理，用于后续的数据非依赖性采集检测。
需要说明的是，本申请的数据非依赖性采集(DIA)检测方法，预先对血清或血浆中的低分子量蛋白进行富集，并对高丰度蛋白进行部分去除，然后再进行后续的酶解处理以及数据非依赖性采集检测；通过预先的过滤富集处理，可以提升血清或血浆中低丰度蛋白的定量水平，为血清或血浆生物标志物的发现提供帮助。本申请的一种实现方式中，血清或血浆蛋白鉴定数目大大提高，可以高达1000以上；而现有的DIA定量技术鉴定蛋白数仅仅约300左右。
还需要说明的是，本申请的关键在于预先对血清或血浆样品进行过滤富集，并且，过滤富集的目的是对低分子量蛋白进行富集，并部分去除高丰度蛋白；只要能够实现富集低分子量蛋白的过滤柱或膜都可以用于本申请，在此不作具体限定。可以理解，高丰度蛋白由于本身的量比较大，在过滤富集过程中难免会有部分损失，这本身会造成蛋白损失和浪费，是蛋白过滤富集的一个缺陷；但是，本申请恰好利用这个缺陷，降低高丰度蛋白的含量及其影响；与此同时，富集低分子量蛋白，从而实现提高血清或血浆蛋白鉴定数目的效果。至于本申请血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法的其它步骤或处理，可以参考现有的DIA定量检测技术，在此不作具体限定。
优选的，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法中，过滤富集采用孔径为
的过滤柱。
优选的，本申请的过滤柱为固相萃取柱。
本申请的一种实现方式中，具体采用疏水性大于C2的固相萃取柱，疏水性大于C2仅仅是一种疏水性的条件限定，其不仅限于C类疏水性材质，还可以是其它疏水性材质，例如CN、NH2、PSA、SAX、COOH、PRS、SCX、Silica、Diol、PEP-2、PAX、PCX、PWAX、PWCX、PS等。
优选的，固相萃取柱采用硅胶基质键合C18(封端)、C18-N(未封端)、AQ C18、tC18、C8、C4、C2、CN、NH2、PSA、SAX、COOH、PRS、SCX、Silica或Diol的固体填料；或者，固相萃取柱采用高分子聚合物基质键合PEP、PEP-2、PAX、PCX、PWAX、PWCX或PS的固体填料。
需要说明的是，固相萃取柱过滤分离蛋白是比较常规的蛋白纯化分离技术，本申请采用孔径
且疏水性大于C2的固相萃取柱，目的就是为更好的实现低分子量蛋白富集，并实现高丰度蛋白的部分去除；以便于更好的提高血清或血浆蛋白鉴定数目。至于具体的固相萃取柱过滤富集方法可以参考相应的使用说明书，在此不作具体限定。
例如，本申请的一种实现方式中，具体采用tC18柱进行过滤富集，其过滤富集方法包括，先对tC18柱进行预处理，具体的，对tC18柱进行活化和平衡，然后再用于血清或血浆样品的蛋白质富集；其中，活化包括采用甲醇过柱进行活化；平衡包括采用0.1％甲酸过柱进行平衡；并且，在血清或血浆样品过柱后，采用0.1％甲酸过柱洗涤至少两次，然后采用75％乙腈洗脱富集产物，对含有富集产物的洗脱液进行干燥，即获得tC18柱的富集产物蛋白质。可以理解，tC18柱只是本申请的一种实现方式中具体使用的一种强疏水性的反相固相萃取柱，不排除还可以采用其它的能够富集低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白的固相萃取柱。
优选的，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，还包括在对血清或血浆样品进行过滤富集之前，对血清或血浆样品进行蛋白变性处理。
优选的，蛋白变性处理包括对所述血清或血浆样品进行还原烷基化反应。
优选的，还原烷基化反应具体包括，向血清或血浆样品中加入二硫苏糖醇进行反应，反应结束后，将反应液置于室温冷却，然后加入碘乙酰胺终止反应。
优选的，二硫苏糖醇在反应液中的浓度为1-50mM，反应条件为37℃水浴反应至少30min。
优选的，碘乙酰胺在反应液中的浓度为5-100mM，终止反应的条件为，室温避光反应至少30min。
需要说明的是，蛋白变性处理是为了后续能够有效的进行过滤富集，并方便后续处理；基于还原烷基化反应的蛋白变性处理只是本申请的一种实现方式中具体采用的蛋白变性方法，不排除还可以采用其它的蛋白变性处理方法，在此不作具体限定。
优选的，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，还包括对酶解处理的产物进行微量分离，用于DDA建库。
优选的，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法中，微量分离包括将酶解处理的产物分离为至少10组分。
需要说明的是，本申请创造性的采用微量分离进行DDA建库，与一般的常规分离后建库相比，具有更好的检测效果。
优选的，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法中，酶解处理采用的酶为Trypsin酶。
优选的，酶解处理包括采用碳酸氢铵溶液对过滤富集的产物进行复溶，然后按照酶:蛋白质的重量比为1μg酶:5-100μg蛋白质进行酶解反应，酶解反应的条件为37℃水浴反应至少10h。其中，37℃水浴反应至少10h，一般37℃水浴过夜即可。
优选的，酶解处理还包括对酶解反应的产物进行离心，取上清液进行干燥，并采用乙腈和甲酸的混合溶液进行复溶，用于后续检测。
需要说明的是，Trypsin酶进行酶解处理，只是本申请的一种实现方式中，经过证实的具有较好效果的酶解处理方法，不排除还可以参考现有的DIA定量技术采用其它酶进行酶解处理。
优选的，本申请的一种实现方式中，血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法具体包括以下步骤：
用色谱柱对血清或血浆样品进行过滤富集，富集其中的低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白，每种样品设计至少三个重复试验；其中，每种样品设计至少三个重复试验，例如，对于同一个血清样品，从中等量取至少三份血清进行试验；
分别对各个重复试验的过滤富集的产物进行酶解处理；
从各个重复试验的酶解处理产物中，取等量肽段进行混合，对混合肽段进行微量分离，用于DDA建库；其中，DDA建库即数据依赖性采集，可以参考现有的建库方法，本申请采用至少三个重复试验，并采用微量分离进行DDA数据库构建，流程相对简单；
根据DDA建库，采用质谱DIA技术进行血清或血浆样品的蛋白质定量检测分析。其中，质谱DIA技术即数据非依赖性采集(DIA)检测。
本申请的另一面公开了本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法在动物体液的蛋白质检测中的应用。其中，动物体液包括尿液、唾液或卵泡液。
需要说明的是，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，是针对人体的血清或血浆的低丰度蛋白的定量水平低而研发，其解决了现有的DIA定量技术在对人体血清或血浆进行蛋白分析时，由于血清或血浆的复杂性及其中大部分高丰度蛋白的影响导致的低丰度蛋白定量水平较低的问题。
可以理解，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，不仅可以用于对人的血清或血浆进行蛋白定量检测，同样可以用于其它动物的血清或血浆蛋白定量检测。并且，本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，其关键在于能够提高待测样品中低丰度蛋白的定量水平；因此，其不仅适用于血清或血浆样品，同样适用于其它体液的蛋白定量检测，例如尿液、唾液或卵泡液等，在此不作具体限定。
本申请的有益效果在于：
本申请的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，预先对血清或血浆中的低分子量蛋白进行富集，并部分去除高丰度蛋白；可以有效的提升血清或血浆中低丰度蛋白的定量水平，为血清或血浆生物标志物的研究和发现提供了一种新的高效的方法和途径。
附图说明
图1是本申请实施例中血清样本tC18柱富集前后的凝胶电泳结果图；
图2是本申请实施例中血清样本三个技术重复的overlap分析结果图；
图3是本申请实施例中血清样本三个技术重复的定量相关性分析结果图；
图4是本申请实施例中血浆样本tC18柱富集前后的凝胶电泳结果图；
图5是本申请实施例中血浆样本三个技术重复的overlap分析结果图；
图6是本申请实施例中血浆样本三个技术重复的定量相关性分析结果图；
图7是本申请实施例中PEP柱和tC18柱富集血浆样本三个技术重复的凝胶电泳图；
图8是本申请实施例中PEP柱富集血浆样本三个技术重复的overlap分析结果图；
图9是本申请实施例中tC18柱富集血浆样本三个技术重复的overlap分析结果图；
图10是本申请实施例中PEP柱和tC18柱分别富集血浆样本三个技术重复的定量相关性分析结果图。
具体实施方式
本申请研究发现，现有的DIA定量技术对血清或血浆中的低丰度蛋白的定量水平较低，其中一个重要因素是血清或血浆样品较复杂，含有大量的不同种类的低分子量的低丰度蛋白，这些低丰度且低分子量的蛋白，在检测和分析过程中容易被忽略或被高分子量或高丰度蛋白的检测信号影响，从而使得低丰度蛋白的定量水平较低。因此，本申请创造性的提出，如果能够适当的富集低分子量的蛋白，并去除部分高分子量且高丰度的蛋白，则能够提高低丰度蛋白的定量水平。
基于以上研究和认识，本申请创造性的提出了一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，包括在对血清或血浆蛋白进行酶解处理之前，预先对血清或血浆样品进行过滤富集，富集其中的低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白，然后再对过滤富集的产物进行酶解处理，用于后续的数据非依赖性采集检测。
现有的DIA定量检测，如Lin L,Zheng J,Yu Q,et al.High throughput andaccurate serum proteome profiling by integrated sample preparation technologyand single-run data independent mass spectrometry analysis[J].Journal ofProteomics,2018,174:9-16，对1μL血清样本进行定量，通过SISPROT技术制备样本，SISPROT技术是将C18圆盘放入200μL的枪头，再填充2毫克的20μm POROS SCX微珠，在枪头上完成样本，制备时间低于2h。单个样本DIA分析时长50min。其中，DDA数据库的建立包括，对混合的20个血清样本，用3种不同的方式处理，用于血清DDA分析；1μL血清样本的3个技术重复，DIA鉴定蛋白数大于300，具有较高的重复性。
本申请的检测方法，与现有的DIA定量技术相比，提高了血清或血浆蛋白的定量水平，本申请的一种实现方式中，血清或血浆蛋白鉴定数目可以高达1000以上。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例采用WATERS的tC18柱，在蛋白层面上利用tC18柱的孔径与强疏水作用富集血清或血浆中的低分子量蛋白，同时，部分去除高丰度蛋白，再进一步对富集后的蛋白进行酶解处理，结合微量分离与质谱DIA技术对蛋白进行定量检测和分析。其中，tC18柱的柱管体积为1cc，键合相TC18，为Vac小柱形式，质谱兼容，吸附剂材质为二氧化硅、粒径37-55μm，吸附剂重量50mg，tC18柱孔径为
非水可润湿性，pH2-8。
本例的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，具体检测步骤如下：
1、蛋白变性
取100μL血清或血浆样本，向其中加入无SDS裂解液，将体积补足1mL，然后进行还原烷基化反应；具体操作步骤如下：
a)加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)使其终浓度为10mM，37℃水浴反应30min；
b)反应结束后放置室温，待其温度降至室温后，立即加入碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)使其终浓度为55mM，室温避光反应30min。
2、tC18柱富集
a)活化：取一根新的tC18柱，用1mL甲醇过柱，重力作用下过柱；
b)平衡：用1mL的0.1％甲酸过柱，重力作用下过柱；
c)上样：如果样品体积小于1mL用无SDS裂解液稀释至1mL再过柱；如果样品体积大于1mL则分多次连续过柱即可；重力作用下过柱；
d)洗涤：用1mL的0.1％甲酸过柱，重力作用下过柱；共重复3次此步骤；
e)洗脱：用800μL的75％乙腈缓慢洗脱，重力作用下过柱；
f)抽干：对洗脱产物进行冷冻抽干，用于下一步实验操作。
3、蛋白酶解
a)抽干的蛋白样品用50mM的碳酸氢铵(NH4HCO3)复溶，采用“Pierce QuantitativeFluorometric PeptideAssay”试剂盒对蛋白进行定量，具体定量方法参考试剂盒使用说明书；
b)蛋白复溶液中加入Trypsin酶，按照酶:蛋白质量比＝1:20添加，例如20μg蛋白添加1μg酶；振荡混匀30s，短暂离心后，37℃，水浴锅中酶解过夜，至少10h；
c)取出蛋白液，20000g离心15min，取上清至新的1.5mL EP管，抽干终止酶解反应；
d)每个样品均用A液等浓度复溶，其中A液中含有2％乙腈和0.1％甲酸。
4、微量分离
从多个技术重复的酶解处理产物中，取等量肽段进行混合，对混合肽段微量分离10组分，用于DDA建库。一般采用三个技术重复即可。
5、质谱DIA技术检测和分析
根据DDA建库获得的数据库，采用质谱DIA模式检测个体血清或血浆样本。
本例按照以上检测方法，分别对人血清样本和血浆样本进行了蛋白定量检测，详细如下：
试验1个体血清样本
个体血清样本，3个技术重复，按照本例的“血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法”，分别对三个技术重复进行蛋白变性、tC18柱富集和蛋白酶解；然后，从三个技术重复的酶解处理产物中，取等量肽段进行混合，对混合肽段微量分离10组分，用于DDA建库，个体样本用DIA模式检测。
本例使用液质联用串联质谱，其中液相色谱仪采用的是Thermo Scientific公司的Ultimate 3000系列型号，质谱仪是Thermo Scientific公司Fusion Lumos型号。总检测时长为120min，DDA质谱主要参数为：一级质谱采用Orbitrap，分辨率120000；二级质谱采用HCD碎裂并在Orbitrap中检测，分辨率30000；最大离子注入时间为50ms；选择峰强度超过20,000排在前20的母离子。DIA质谱主要参数为：一级质谱采用Orbitrap，分辨率60000；二级质谱采用HCD碎裂并在Orbitrap中检测，分辨率30000；窗口设置为25个，最大离子注入时间为50ms。质谱数据分析所用软件为Proteome Discoverer 1.4(Thermo Scientific)和Spectronaut软件，PD软件搜索鉴定主要参数：数据库为Uniprot的human蛋白数据库；一级质谱误差范围20ppm；二级质谱误差范围0.05Da；固定修饰为“Carbamidomethyl(C)”；可变修饰为“Oxidation(M),N->D(N),Gln->pyro-glu(N-term Q)”，酶切方式Trypsin，允许漏切数为2；Spectronaut软件主要参数：数据库为Uniprot的human蛋白数据库；酶切方式Trypsin。
本例采用SDS-PAGE凝胶电泳对tC18柱富集前后的产物进行电泳检测，结果如图1所示。图1中，第一至第三泳道分别为没有富集之前的个体血清样本的三个技术重复的胶图，第四至第六泳道分别为tC18柱富集后血清样本的三个技术重复的胶图，上样量均为1μg；第七泳道为标准蛋白marker。图1的结果显示，经C18柱富集后，高丰度蛋白被部分去除，同时31KDa以下的低分子量蛋白较明显被富集。
本例对个体血清样本的蛋白分析结果如表1所示。
表1个体血清样本的蛋白分析结果
| 检测名称 | 蛋白鉴定数 |
| 血清样本重复试验1 | 898 |
| 血清样本重复试验2 | 926 |
| 血清样本重复试验3 | 872 |
对三个技术重复的蛋白分析结果进行overlap分析，结果如图2所示，图2中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个技术重复。图2的结果显示，三个技术重复中，共有823个蛋白在三个技术重复中均鉴定到，三个技术重复的overlap＝823/[(898+926+872)/3]＝91.5％。
个体血清经tC18富集后3个技术重复的定量相关性分析结果如图3所示，图中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个技术重复。图3的结果显示，三个技术重复的定量相关性大于0.9，特别是Repeat1和Repeat3的相关系数高达0.97。
试验2个体血浆样本
个体血浆样本，3个技术重复，按照本例的“血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法”，分别对三个重复试验进行蛋白变性、tC18柱富集和蛋白酶解；然后，从三个重复试验的酶解处理产物中，取等量肽段进行混合，对混合肽段微量分离10组分，用于DDA建库，个体样本用DIA模式检测
本例使用液质联用串联质谱，其中液相色谱仪采用的是Thermo Scientific公司的Ultimate 3000系列型号，质谱仪是Thermo Scientific公司Fusion Lumos型号。总检测时长为120min，DDA质谱主要参数为：一级质谱采用Orbitrap，分辨率120000；二级质谱采用HCD碎裂并在Orbitrap中检测，分辨率30000；最大离子注入时间为50ms；选择峰强度超过20,000排在前20的母离子。DIA质谱主要参数为：一级质谱采用Orbitrap，分辨率60000；二级质谱采用HCD碎裂并在Orbitrap中检测，分辨率30000；窗口设置为25个，最大离子注入时间为50ms；质谱数据分析所用软件为Proteome Discoverer 1.4(Thermo Scientific)和Spectronaut软件，PD软件搜索鉴定主要参数：数据库为Uniprot的human蛋白数据库；一级质谱误差范围20ppm；二级质谱误差范围0.05Da；固定修饰为“Carbamidomethyl(C)”；可变修饰为“Oxidation(M),N->D(N),Gln->pyro-glu(N-term Q)”，酶切方式Trypsin，允许漏切数为2；Spectronaut软件主要参数：数据库为Uniprot的human蛋白数据库；酶切方式Trypsin。
本例采用SDS-PAGE凝胶电泳对tC18柱富集前后的产物进行电泳检测，结果如图4所示。图4中，第一至第三泳道分别为没有富集之前的个体血浆样本的三个重复试验的胶图，第四至第六泳道分别为tC18柱富集后血浆样本的三个重复试验的胶图，上样量均为1μg；第七泳道为标准蛋白marker。图4的结果显示，经tC18柱富集后，高丰度蛋白被部分去除，同时31KDa以下的低分子量蛋白较明显被富集。
本例对个体血浆样本的蛋白分析结果如表2所示。
表2个体血浆样本的蛋白分析结果
| 检测名称 | 蛋白鉴定数 |
| 血浆样本重复试验1 | 1156 |
| 血浆样本重复试验2 | 1184 |
| 血浆样本重复试验3 | 1381 |
对三个重复试验的蛋白分析结果进行overlap分析，结果如图5所示，图5中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个重复试验。图5的结果显示，三个重复试验中，共有1068个蛋白在三个重复试验中均鉴定到，三个重复试验的overlap＝1068/[(1156+1184+1381)/3]＝86.1％。
个体血清经C18富集后三个重复试验的定量相关性分析结果如图6所示，图中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个重复试验。图6的结果显示，三个重复试验的定量相关性大于0.9，特别是Repeat1和Repeat2的相关系数高达0.96。
以上试验结果显示，本例的血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，能够有效的对血清或血浆样本中的蛋白质进行定量检测分析，并且，能够极大的提高低分子量的低丰度蛋白的定量水平。此外，本例的检测方法，只需要采用三个技术重复进行DDA建库即可，DDA建库流程简单，降低了检测成本。
实施例二
本例对不同的填充柱料进行试验，具体的，本例采用了平均孔径为
填充柱料为PEP的固相萃取柱，PEP固相萃取柱的填充柱料为高分子聚合物，高分子聚合物是以吡咯烷酮和二乙烯苯萃共聚得到的高分子材料。同一血浆样本，3个技术重复，具体试验方法与实施例一相同，不同的是采用了不同填充柱料的固相萃取柱。
本例分别采用tC18柱和PEP柱对相同的血浆样本进行富集，每个柱3个技术重复。并采用SDS-PAGE凝胶电泳对tC18柱和PEP柱富集前后的产物进行电泳检测，结果如图7所示。图7中，标记为M的第一泳道为标准蛋白marker，标记为1、2、3的第二至第四泳道分别为tC18富集的三个重复试验的胶图，标记为4、5、6的第五至第七泳道分别为PEP富集的三个重复试验的胶图；上样量均为2μL。图7的结果显示，PEP柱子跟tC18柱子一样，均可以血浆中的低分子量蛋白进行富集。
本例采用平均孔径
的PEP的固相萃取柱对个体血浆样本的蛋白分析结果如表3所示。
表3不同填充柱料固相萃取柱的个体血浆样本的蛋白分析结果
分别对三个重复试验的蛋白分析结果进行overlap分析，PEP填料的结果如图8所示，图8中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个重复试验。图8的结果显示，三个重复试验中，共有763个蛋白在三个重复试验中均鉴定到，三个重复试验的overlap＝763/[(843+827+833)/3]＝91.5％。硅胶填料tC18的结果如图9所示，图9中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个重复试验。图9的结果显示，三个重复试验中，共有755个蛋白在三个重复试验中均鉴定到，三个重复试验的overlap＝755/[(822+806+796)/3]＝93.4％。
个体血浆经tC18富集后三个重复试验的定量相关性分析结果如图10所示，图中Repeat1、Repeat2和Repeat3依序为三个重复试验。图10的结果显示，三个重复试验的定量相关性大于0.98；另外，血浆经PEP柱子富集后，三个重复试验的定量相关性也大于0.98。
表3以及图7至图10的结果显示，平均孔径
填充柱料为PEP的固相萃取柱和tC18柱都能够有效的对低分子量蛋白进行富集，并去除部分高丰度蛋白，从而提高低分子量的低丰度蛋白的定量水平。
根据以上试验可以预期，与tC18柱类似的，硅胶基质键合C18、C18-N、AQ C18、C8、C4、C2、CN、NH2、PSA、SAX、COOH、PRS、SCX、Silica或Diol的固体填料的固相萃取柱同样可以用于本例。与PEP固相萃取柱类似的，高分子聚合物基质键合PEP-2、PAX、PCX、PWAX、PWCX或PS的固体填料的固相萃取柱同样可以用于本例。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种血清或血浆蛋白的数据非依赖性采集检测方法，其特征在于：包括在对血清或血浆蛋白进行酶解处理之前，先对血清或血浆样品进行过滤富集，富集其中的低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白，然后再对过滤富集的产物进行酶解处理，用于后续的数据非依赖性采集检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述过滤富集采用孔径为
的过滤柱；
优选的，所述过滤柱为固相萃取柱。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述固相萃取柱采用硅胶基质键合C18、C18-N、AQ C18、tC18、C8、C4、C2、CN、NH2、PSA、SAX、COOH、PRS、SCX、Silica或Diol的固体填料；
或者，所述固相萃取柱采用高分子聚合物基质键合PEP、PEP-2、PAX、PCX、PWAX、PWCX或PS的固体填料。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括在对血清或血浆样品进行过滤富集之前，对所述血清或血浆样品进行蛋白变性处理；
优选的，所述蛋白变性处理包括对所述血清或血浆样品进行还原烷基化反应；
优选的，所述还原烷基化反应具体包括，向所述血清或血浆样品中加入二硫苏糖醇进行反应，反应结束后，将反应液置于室温冷却，然后加入碘乙酰胺终止反应；
优选的，所述二硫苏糖醇在反应液中的浓度为1-50mM，反应条件为37℃水浴反应至少30min；
优选的，所述碘乙酰胺在反应液中的浓度为5-100mM，终止反应的条件为，室温避光反应至少30min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括对酶解处理的产物进行微量分离，用于DDA建库。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述微量分离包括将酶解处理的产物分离为至少10组分。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述酶解处理采用的酶为Trypsin酶；
优选的，所述酶解处理包括采用碳酸氢铵溶液对过滤富集的产物进行复溶，然后按照酶:蛋白质的重量比为1μg酶:5-100μg蛋白质进行酶解反应，酶解反应的条件为37℃水浴反应至少0.5h；
优选的，所述酶解处理还包括对酶解反应的产物进行离心，取上清液进行干燥，并采用乙腈和甲酸的混合溶液进行复溶，用于后续检测。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
采用色谱柱对血清或血浆样品进行过滤富集，富集其中的低分子量蛋白，并过滤去除部分高丰度蛋白，其中，每种样品设计至少三个重复试验；
分别对各个重复试验的过滤富集的产物进行酶解处理；
从各个重复试验的酶解处理产物中，取等量肽段进行混合，对混合肽段进行微量分离，用于DDA建库；
根据DDA建库，采用质谱DIA技术进行血清或血浆样品的蛋白质定量检测分析。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法在动物体液的蛋白质检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述动物体液包括尿液、唾液或卵泡液。
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