CN114839253A - 血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其包括：步骤一、获得富集分子量低于65kDa蛋白的预处理样品；步骤二、对预处理样品进行质谱DDA模式采集数据；步骤三、利用步骤二中两次质谱DDA模式采集数据建立蛋白信息库；步骤四、采用质谱DIA模式采集对分子量小于65kDa蛋白的待测样品进行测定，得到待测样品的DIA原始数据；步骤五、将步骤四得到的DIA原始数据与步骤三得到的蛋白信息库进行匹配得到待测样品的蛋白含量。本发明可重复稳定地进行血清/血浆中的分子量小于65kDa蛋白的定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及血清或血浆的蛋白检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法及应用。
背景技术
血液是基因组、转录组、蛋白质组和代谢组学等研究的首选来源，主要因为它具有微创和临床容易获得的特点。作为基因组和转录组学的补充，基于质谱的蛋白质组学的快速发展可提供蛋白质表达和翻译后修饰的等更多丰富的生物学信息。事实上，蛋白在健康和疾病状态的评估中发挥着关键作用，因此血液的蛋白质组正在成为临床研究和生物标志物发现的重要环节。目前，虽然在一次液相色谱串联质谱运行中，在未去除高丰度蛋白条件下，可以鉴定400～500种蛋白，而在去除高峰度蛋白、分离、富集等措施的帮助下可达到数千种蛋白质的鉴定。但这些策略往往忽略了小于65kDa的低分子量蛋白质。
小于65kDa的低分子量蛋白是一组异质性物质，包括细胞因子、生长因子、肽激素和蛋白质片段等。由于小于65kDa的蛋白分子量足够小，可从机体组织或病灶等各个位置自由进入血液，因此它们被认为是与疾病发生发展相关的生物标记物，在临床医学和生物制药等领域有着非常广的应用前景。然而，血液中小于65kDa蛋白的丰度比较低，而且半衰期短，因此它们的分析和鉴定仍面临着分析挑战。如何提取和富集小于65kDa的低分子量蛋白是高覆盖鉴定和定量分析的关键环节。尽管针对血液中小于65kDa蛋白的富集，发展了包括有机和无机溶剂沉淀方法、超滤技术、固相萃取技术、免疫亲和法及凝胶分离法等多种不同方法，但每种方法富集的蛋白种类不同，加上血液样本的高度复杂性和大量高丰度蛋白质的存在，大大限制了这些方法的分析和鉴定中的应用，且血液中的小于65kDa的定量分析也鲜有报道。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其可重复稳定地进行血清/血浆中的分子量小于65kDa蛋白的定量分析。
本发明还有一个目的是提供一种血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，其可应用于动物体液中低分子量蛋白的检测，还可应用于胃癌疾病诊断中标志物的检测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其包括：
步骤一、将血清或血浆样品中的高丰度蛋白去除，获得富集分子量低于65kDa蛋白的预处理样品；
步骤二、对预处理样品进行变性及酶解处理，获得肽段样品，将肽段样品分为两份，一份肽段样品直接进行质谱DDA模式采集数据，将另一份肽段样品分离出5个馏分样品，并对5个馏分样品分别进行质谱DDA模式采集数据；
步骤三、利用步骤二中两次质谱DDA模式采集数据建立蛋白信息库；
步骤四、采用质谱DIA模式采集对分子量小于65kDa蛋白的待测样品进行测定，得到待测样品的DIA原始数据；
步骤五、将步骤四得到的DIA原始数据与步骤三得到的蛋白信息库进行匹配得到待测样品的蛋白含量；
其中，DIA模式包括一个一级全扫描和30个可变窗口的数据非依赖二级扫描，所述的一级全扫描的扫描范围为350-1550m/z；30个可变窗口具体如下：
352-418m/z，418-449m/z，449-476m/z，476-495m/z，495-514m/z，514-532m/z，532-548m/z，548-567m/z，567-581m/z，581-599m/z，599-618m/z，618-635m/z，635-652m/z，652-669m/z，669-689m/z，689-710m/z，710-730m/z，730-754m/z，754-780m/z，780-801m/z，801-829m/z，829-860m/z，860-893m/z，893-925m/z，925-964m/z，964-1009m/z，1009-1058m/z，1058-1121m/z，1121-1220m/z，1220-1509m/z。
优选的是，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤一中的预处理样品包括第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品，分别取三份血清或血浆样品，并对三份样品分别进行如下三种富集方法处理得到第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品，具体为：
方法一、将第一份样品与其3倍体积的去离子水混合置于离心管内，向离心管中加入第一份样品4倍体积的冰冻乙腈，随后进行涡旋处理，涡旋处理后将离心管置于温度为3～5℃的条件下静置30～60min后进行离心处理，将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第一预处理样品；
方法二、将第二份样品与其4倍体积的含有25mM碳酸氢铵的体积浓度为20％的乙腈水溶液混合，随后进行涡旋处理10～30s，向涡旋后的混合液中加入第二份样品8倍体积的冰冻乙腈，然后置于温度为3～5℃条件下静置30～60min后进行离心处理，将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第二预处理样品；
方法三、将第三份样品与其9倍体积的体积浓度为0.05～0.15％的甲酸水溶液混合，进行涡旋处理30～120s，随后将涡旋后的混合液转移至截留分子量为30～50kDa的超滤管内，然后进行离心处理，将离心得到的滤液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第三预处理样品；其中，甲酸水溶液中含有体积浓度为2％的乙腈。
优选的是，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，方法一、方法二和方法三中的离心处理的参数条件均为：温度为3～5℃，离心力为14000～16000×g，离心时间为20～40min。
优选的是，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤二中对预处理样品进行变性处理具体为对预处理样品进行还原烷基化处理。
优选的是，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤二中对预处理样品进行酶解处理，具体为将预处理样品与Trypsin酶按照重量比为25～100:1的比例进行混合，于温度为37℃条件下进行酶解反应16h。
优选的是，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤二中预处理样品在进行变性及酶解处理后，还进行了脱盐、冻干、用体积浓度为0.1％甲酸水溶液进行复溶，即得肽段样品。
本发明还提供一种所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，所述方法在动物体液的低于65kDa蛋白检测中的应用。
本发明还提供一种所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，所述方法在表征胃癌中低分子量蛋白标志物的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明基于可变窗口的数据非依赖性模式采集的质谱定量分析，在确保可获得准确的定量结果的同时，最大程度地实现了小于65kDa蛋白高覆盖定量分析；
2、整合多种低分子量蛋白富集方法的优势，建立了一种高覆盖度的分子量小于65kDa蛋白的鉴定方法，实现了分子量小于65kDa蛋白的准确定量分析。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述方法的流程示意图；
图2为本发明中数据依赖性采集和数据非依赖性采集的鉴定数目分析；
图3为本发明中数据依赖性采集和数据非依赖性采集的定量性能对比图；
图4为本发明中数据非依赖性采集单次可定量的＜30kDa，30kDa～65kDa，和＞65kDa不同分子量区间的蛋白数；其中C代表健康对照组，G代表胃癌组；
图5为本发明中数据非依赖性采集单次可定量的＜30kDa，30kDa～65kDa，和＞65kDa不同分子量区间的蛋白的占比；其中C代表健康对照组，G代表胃癌组；
图6为本发明中LMWPs在胃癌和正常人体中表达的火山图，其中C代表健康对照组，G代表胃癌组。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
本发明提供一种血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其包括：
步骤一、将血清或血浆样品中的高丰度蛋白去除，获得富集分子量低于65kDa蛋白的预处理样品；
步骤二、对预处理样品进行变性及酶解处理，获得肽段样品，将肽段样品分为两份，一份肽段样品直接进行质谱DDA模式采集数据，将另一份肽段样品分离出5个馏分样品，并对5个馏分样品分别进行质谱DDA模式采集数据；
步骤三、利用步骤二中两次质谱DDA模式采集数据建立蛋白信息库；
步骤四、采用质谱DIA模式采集对分子量小于65kDa蛋白的待测样品进行测定，得到待测样品的DIA原始数据；
步骤五、将步骤四得到DIA原始数据与步骤三得到的蛋白信息库进行匹配得到待测样品的蛋白含量；
其中，DIA模式包括一个一级全扫描和30个可变窗口的数据非依赖二级扫描，所述的一级全扫描的扫描范围为350-1550m/z；30个可变窗口具体如下：
352-418m/z，418-449m/z，449-476m/z，476-495m/z，495-514m/z，514-532m/z，532-548m/z，548-567m/z，567-581m/z，581-599m/z，599-618m/z，618-635m/z，635-652m/z，652-669m/z，669-689m/z，689-710m/z，710-730m/z，730-754m/z，754-780m/z，780-801m/z，801-829m/z，829-860m/z，860-893m/z，893-925m/z，925-964m/z，964-1009m/z，1009-1058m/z，1058-1121m/z，1121-1220m/z，1220-1509m/z。
在上述技术方案中，本发明首先对血清或血浆样品进行高丰度蛋白的预处理，得到富集低分子量(分子量小于65kDa)的预处理样品，对预处理样品进行变性及酶解处理得到肽段样品，然后基于DDA对肽段样品进行质谱鉴定并建立分子量小于65kDa蛋白的特异性图谱库，随后利用可变窗口的数据非依赖性采集模式进行小于65kDa蛋白的定量分析，在确保可获得准确的定量结果的同时，最大程度地实现了小于65kDa蛋白高覆盖定量分析；本发明方法具有高通量、高重现性和高准确性的特点，适合于大规模临床血液样本的分析及小于65kDa蛋白疾病标志物的检测，具有广泛的应用前景。
另一种技术方案中，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤一中的预处理样品包括第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品，分别取三份血清或血浆样品，并对三份样品分别进行如下三种富集方法处理得到第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品，具体为：
方法一、将第一份样品与其3倍体积的去离子水混合置于离心管内，向离心管中加入第一份样品4倍体积的冰冻乙腈，随后进行涡旋处理，涡旋处理后将离心管置于温度为3～5℃的条件下静置30～60min后进行离心处理，将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第一预处理样品；
方法二、将第二份样品与其4倍体积的含有25mM碳酸氢铵的体积浓度为20％的乙腈水溶液混合，随后进行涡旋处理10～30s，向涡旋后的混合液中加入第二份样品8倍体积的冰冻乙腈，然后置于温度为3～5℃条件下静置30～60min后进行离心处理，将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第二预处理样品；
方法三、将第三份样品与其9倍体积的体积浓度为0.05～0.15％的甲酸水溶液混合，进行涡旋处理30～120s，随后将涡旋后的混合液转移至截留分子量为30～50kDa的超滤管内，然后进行离心处理，将离心得到的滤液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第三预处理样品；其中，甲酸水溶液中含有体积浓度为2％的乙腈。
在上述技术方案中，本发明提供了三种富集方法，整合多种低分子量蛋白富集方法的优势，建立了一种高覆盖度的小于65kDa蛋白的鉴定方法，实现了小于65kDa蛋白的准确定量分析。
另一种技术方案中，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，方法一、方法二和方法三中的离心处理的参数条件均为：温度为3～5℃，离心力为14000～16000×g，离心时间为20～40min。在达到技术效果的基础上，设计合理的前处理参数。
另一种技术方案中，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤二中对预处理样品进行变性处理具体为对预处理样品进行还原烷基化处理。
另一种技术方案中，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤二中对预处理样品进行酶解处理，具体为将预处理样品与Trypsin酶按照重量比为25～100:1的比例进行混合，于温度为37℃条件下进行酶解反应16h。富集后的预处理样品利用BCA方法测定总蛋白浓度。
另一种技术方案中，所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，步骤二中预处理样品在进行变性及酶解处理后，还进行了脱盐、冻干、用体积浓度为0.1％甲酸水溶液进行复溶，即得肽段样品。
本发明还提供一种所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，所述方法在动物体液的低于65kDa蛋白检测中的应用。
本发明还提供一种所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，所述方法在表征胃癌中低分子量蛋白标志物的应用。
<实施例1>
如图1所示，本发明提供一种血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其包括以下步骤：
步骤一、取5例疾病组和5例健康组的血清样本进行等量混合制成混合样品；
步骤二、取三份样品，并分别通过如下三种方法进行高丰度蛋白的去除，获得富集分子量低于65kDa蛋白的预处理样品：
方法一(50％ACN富集)、将50μL的血清样品与150μL的去离子水置于1.5mL的离心管内，向离心管内加入200μL的冰冻乙腈，然后将离心管进行涡旋处理，随后置于温度为4℃条件下静置60min，然后于温度为4℃，离心力为14000g条件下离心处理30mins，随后将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第一预处理样品；
方法二(20％ACN+25mM碳酸氢铵富集)、将50μL的血清样品与200μL的pH＝8.0、含有25mM碳酸氢铵的体积浓度为20％的乙腈水溶液混合，随后进行涡旋处理10s，向涡旋后的混合液中480μL的冰冻乙腈，然后置于温度为4℃条件下静置60min，然后在温度为4℃，离心力为3000g条件下离心10min，随后将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第二预处理样品；
方法三(30kDa超滤离心富集)、将50μL的血清样品与450μL的体积浓度为0.1％的甲酸水溶液混合，进行涡旋处理60s，随后将涡旋后的混合液转移至截留分子量为30kDa的0.5mL的超滤管内，然后在温度为4℃，离心力为14000g条件下离心15min，将离心得到的滤液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第三预处理样品；其中，甲酸水溶液中含有体积浓度为2％的乙腈。
步骤三、将步骤二得到的第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品进行还原烷基化和酶解(预处理样品与Trypsin酶按照重量比为25:1的比例进行混合，于温度为37℃条件下进行酶解反应16h)得肽段样品，将每份肽段样品分为两部分，其中一部分肽段样品直接进行DDA数据依赖性采集(3次重复采集)，另外一部分肽段样品在高pH条件下分离5个馏分，每个馏分进行DDA数据依赖性采集(3次重复采集)，基于上述得到的采集得到DDA数据(总共24个数据)进行建库，得到分子量小于65kDa蛋白信息谱图库；
步骤四、将步骤三获得的DDA数据进行整合，初步建立质谱DIA模式采集方法(数据非依赖性采集模式方法)，数据非依赖性采集模式设置为一个一级全扫描包含30个可变窗口的数据依赖性二级扫描；所述的一级全扫描的扫描范围为350-1550m/z；30个可变窗口具体如下：
352-418m/z，418-449m/z，449-476m/z，476-495m/z，495-514m/z，514-532m/z，532-548m/z，548-567m/z，567-581m/z，581-599m/z，599-618m/z，618-635m/z，635-652m/z，652-669m/z，669-689m/z，689-710m/z，710-730m/z，730-754m/z，754-780m/z，780-801m/z，801-829m/z，829-860m/z，860-893m/z，893-925m/z，925-964m/z，964-1009m/z，1009-1058m/z，1058-1121m/z，1121-1220m/z，1220-1509m/z。
所建立的DIA谱库包含的小于30kDa和65kDa蛋白种类分别多达230和450。
步骤五、采用质谱DIA模式采集方法对分子量小于65kDa蛋白的待测样品进行测定，得到待测样品的DIA原始数据；其中质谱采用的是液相色谱-质谱联用仪，条件为：色谱柱为C18进行梯度洗脱，所采用的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％的甲酸乙腈溶液。所采用的高分辨质谱系统电离模式为纳喷雾正离子，喷雾电压为1.7-2.5kV，离子传输管温度为250-380℃；
步骤六、将步骤五得到的DIA原始数据与步骤三得到的蛋白信息库进行匹配得到待测样品的蛋白含量；实现对待测样品蛋白的定量分析。
图2和图3分别是实施例1中三种富集方法分别在平行三次采集后的数据依赖性采集模式(DDA-1，DDA-2和DDA-3)和数据非依赖性采集模式(DIA-1，DIA-2和DIA-3)鉴定到的蛋白种类重现性及定量重现性和稳定性。由图所知，数据非依赖性采集不论在蛋白鉴定的重现性还是蛋白定量的稳定性均优于数据依赖性数据采集。
图4和图5分别是将优化后的DIA方法进行经过50％乙腈富集后的胃癌血清临床样本分析。由图可知，在临床样本的中，单次DIA实验平均可鉴定并定量到405±18个蛋白。且与其它LMWPs研究相比，本方案的LC时间仅为1小时。为了进一步了解低分子量蛋白的分子量分布，我们发现405个蛋白中有136个和293个蛋白平均分子量小于30kDa和65kDa。在整个批次中，不同样本中蛋白分子量分布的比例相当稳定，平均相对标准偏差小于1.1％。需要说明的是，这是首次基于可变窗口的数据非依赖性数据采集进行的小于65kDa蛋白的高覆盖高通量的定量分析。
通过对富集的低分子量蛋白进行数据分析，研究结果如图6所示，与正常健康组相比，胃癌患者的血清中部分低分子量蛋白的表达发生了显著性的变化。由此证明，低分子量蛋白是一种可进行疾病的诊断及筛查的潜在生物标志物。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其特征在于，包括：
步骤一、将血清或血浆样品中的高丰度蛋白去除，获得富集分子量低于65kDa蛋白的预处理样品；
步骤二、对预处理样品进行变性及酶解处理，获得肽段样品，将肽段样品分为两份，一份肽段样品直接进行质谱DDA模式采集数据，将另一份肽段样品分离出5个馏分样品，并对5个馏分样品分别进行质谱DDA模式采集数据；
步骤三、利用步骤二中两次质谱DDA模式采集数据建立蛋白信息库；
步骤四、采用质谱DIA模式采集对分子量小于65kDa蛋白的待测样品进行测定，得到待测样品的DIA原始数据；
步骤五、将步骤四得到的DIA原始数据与步骤三得到的蛋白信息库进行匹配得到待测样品的蛋白含量；
其中，DIA模式包括一个一级全扫描和30个可变窗口的数据非依赖二级扫描，所述的一级全扫描的扫描范围为350-1550m/z；30个可变窗口具体如下：
352-418m/z，418-449m/z，449-476m/z，476-495m/z，495-514m/z，514-532m/z，532-548m/z，548-567m/z，567-581m/z，581-599m/z，599-618m/z，618-635m/z，635-652m/z，652-669m/z，669-689m/z，689-710m/z，710-730m/z，730-754m/z，754-780m/z，780-801m/z，801-829m/z，829-860m/z，860-893m/z，893-925m/z，925-964m/z，964-1009m/z，1009-1058m/z，1058-1121m/z，1121-1220m/z，1220-1509m/z。
2.如权利要求1所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其特征在于，步骤一中的预处理样品包括第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品，分别取三份血清或血浆样品，并对三份样品分别进行如下三种富集方法处理得到第一预处理样品、第二预处理样品和第三预处理样品，具体为：
方法一、将第一份样品与其3倍体积的去离子水混合置于离心管内，向离心管中加入第一份样品4倍体积的冰冻乙腈，随后进行涡旋处理，涡旋处理后将离心管置于温度为3～5℃的条件下静置30～60min后进行离心处理，将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第一预处理样品；
方法二、将第二份样品与其4倍体积的含有25mM碳酸氢铵的体积浓度为20％的乙腈水溶液混合，随后进行涡旋处理10～30s，向涡旋后的混合液中加入第二份样品8倍体积的冰冻乙腈，然后置于温度为3～5℃条件下静置30～60min后进行离心处理，将离心得到的上清液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第二预处理样品；
方法三、将第三份样品与其9倍体积的体积浓度为0.05～0.15％的甲酸水溶液混合，进行涡旋处理30～120s，随后将涡旋后的混合液转移至截留分子量为30～50kDa的超滤管内，然后进行离心处理，将离心得到的滤液收集并冻干处理，即得分子量低于65kDa蛋白的第三预处理样品；其中，甲酸水溶液中含有体积浓度为2％的乙腈。
3.如权利要求2所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其特征在于，方法一、方法二和方法三中的离心处理的参数条件均为：温度为3～5℃，离心力为14000～16000×g，离心时间为20～40min。
4.如权利要求1所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其特征在于，步骤二中对预处理样品进行变性处理具体为对预处理样品进行还原烷基化处理。
5.如权利要求4所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其特征在于，步骤二中对预处理样品进行酶解处理，具体为将预处理样品与Trypsin酶按照重量比为25～100:1的比例进行混合，于温度为37℃条件下进行酶解反应16h。
6.如权利要求5所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其特征在于，步骤二中预处理样品在进行变性及酶解处理后，还进行了脱盐、冻干、用体积浓度为0.1％甲酸水溶液进行复溶，即得肽段样品。
7.如权利要求1～6任一一项所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，其特征在于，所述方法在动物体液的低于65kDa蛋白检测中的应用。
8.如权利要求1～6任一一项所述的血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法的应用，其特征在于，所述方法在表征胃癌中低分子量蛋白标志物的应用。
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