CN115856112A - 基于dia技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法属于乳品技术领域。步骤包括：样品采集、乳清蛋白提取和分离、过滤辅助样品制备酶解、建库样本准备、DDA建库数据采集、DIA进行生物样本定量数据采集、差异表达蛋白质筛选及功能分析等。本发明首次从不同民族的人乳差异性出发，采用DIA技术对朝鲜族和汉族母乳中的乳蛋白进行系统化、高通量的研究，并进行比较分析，鉴定出的总蛋白种类多，能全面的获得不同民族之间人乳蛋白的差异，为开发针对特定人群的创新性婴幼儿配方食品提供技术支持和新的研发思路。
Description
技术领域
本发明属于乳品技术领域，具体涉及一种基于数据非依赖采集的蛋白组学技术(DIA)对采集的不同民族的人乳进行蛋白组成和含量差异性比较分析的方法。
背景技术
母乳是婴儿最天然、最理想的食物，为新生儿提供生长发育所必需的营养，并增强抵抗力。在这种情况下，作为母乳替代物，婴幼儿配方粉的科学设计和研发具有重要的意义。
为使婴幼儿能够获得更接近母乳的营养成分，国内外相关研究机构长期深入探索母乳组分，试图找到最符合母乳的营养均衡型婴幼儿配方乳粉。我国在母乳研究营养成分上取得了一定的研究成果，相关机构纷纷建立了中国母乳营养成分数据库，但仍存在样本地域碎片化、样本分析常规化的不足。我国人口众多、地域辽阔、膳食多样，如何利用现代技术详尽地分析中国母乳功能组分，将常规母乳营养素研究扩展到更加细微的母乳成分研究显得至关重要。我国东北朝鲜族、西北地区等母乳研究较少，对母乳的蛋白质组学研究也较少。而相关研究表明，母乳成分受种族、饮食等多种因素影响。因此，探究不同民族人乳之间的营养成分的差异性，并开发针对性的婴配粉具有重要意义。
乳主要包括乳蛋白、乳糖和乳脂等多种营养成分，其中乳蛋白质是最重要的组成成分。乳蛋白质可以为新儿和哺乳动物提供氮、酶、激素及免疫物质等，对其健康成长有重要的作用。乳中含有种类多样、含量丰富的蛋白质，由于遗传变异和翻译后修饰对乳蛋白的影响，使乳蛋白的组成变得复杂、庞大。其中酪蛋白(CN)、乳清蛋白(WP)和乳脂球膜蛋白(MFGM)是乳蛋白的重要组成部分。蛋白质组学是研究蛋白组的一个新的领域，主要研究蛋白质的特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质相互作用，在蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生理生化过程以及疾病的病理过程等。
采用蛋白质组学等技术对中国东北延边地区的朝鲜族和汉族人乳进行详细的分析和比较，探索民族差异对母乳中营养成分的影响，建立特色人群母乳数据库，为开发更加接近特定人群母乳营养成分及功效的婴幼儿配方奶粉提供依据，未来将有更多的婴幼儿受惠于针对性母乳数据库。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对蛋白种类繁多的我国不同民族的母乳，提供一种通过对样品进行高速分离得不同的乳清蛋白层、酪蛋白层和乳脂肪球膜蛋白层，并采用DIA技术对蛋白进行高通量分析的方法。为了达到上述技术效果，本发明包括以下技术方案：
一种基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法，有以下步骤：
步骤1：样品采集
采集不同民族新鲜母乳，每例30毫升放入50毫升的无菌离心管中，并贴上标签，获得的样品立即放置在-80℃的冰箱中储存，同一民族随机6～10个样品混合成一个混合样品，每个民族收集至少三个平行的混合样本进行生物学重复；
步骤2：乳清蛋白提取和分离
将蛋白酶抑制剂加入母乳样品，取12mL母乳样品装入15mL离心管；4℃，3000rpm，离心30min分层，最上层为脂肪层，贴挂侧管壁，轻柔倒出下层脱脂奶液至新管，留脂肪层于原离心管中；磷酸缓冲液(PBS)冲洗脂肪层5次，4℃存放待用；脱脂奶液取1mL用10％乙酸调节溶液pH值至4.6，用于酪蛋白析出，4℃，10000rpm，离心15min，使乳清蛋白与酪蛋白分离；
乳清蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，取上清液，加入4倍体积预冷丙酮，-20℃过夜，沉淀用预冷丙酮清洗3次，得到乳清蛋白沉淀，吹干备用；
酪蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，除去上清液，沉淀即为酪蛋白，预冷丙酮清洗3次，吹干备用；
脂肪蛋白提取：在母乳样品进行离心分离后得到的脂肪层中加入3倍体积甲醇，涡旋震荡，至脂肪层破碎悬浮于甲醇，4℃，9000g，离心10s；除去上清液，加入体系2倍体积的氯仿，涡旋震荡，至沉淀悬浮于氯仿；向体系中加入体系3倍体积去离子水，混匀，4℃，9000g，离心1min，溶液分三层，下层为氯仿，中间层为蛋白层，将上清液移除，向剩余体系中加入3倍体积甲醇，混匀，4℃，9000g，离心2min；除上清，将沉淀用甲醇洗涤2次，吹干，沉淀即为脂肪蛋白；
步骤3：过滤辅助样品制备(FASP)酶解
基于过滤辅助样品制备(FASP)方法，对100μg蛋白质样品进行蛋白质酶水解，所述的蛋白质样品是步骤2中分离出的乳清蛋白、酪蛋白、脂肪蛋白的一种，向蛋白质样品中添加8M尿素，使总体积达到200μL，加入二硫苏糖醇(DTT)至体系中DTT最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟，添加碘乙酸(IAA)至碘乙酸的终浓度为50mM，并在室温下无光反应40min，将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次，添加200μL浓度为50mM的碳酸氢铵溶液，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次，将胰蛋白酶以样品:酶＝50:1的质量比添加到试管中，并在37℃下酶解16小时，通过在12000g、4℃下离心获得多肽样品，然后冷冻干燥；
步骤4：建库样本准备
酶解后的多肽样品在色谱仪中进行High pH反相色谱分级，柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mL/min；随后柱流速增至0.7mL/min，使用1.5ml EP管，每1分钟接收1管；
步骤5：DDA建库数据采集
另取酶解后的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60/120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；所述溶液B为98％ACN，2％ddH2O，pH10；
轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget＝5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；将获得的质谱数据用Proteome Discoverer 2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；数据处理参数为：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率(FDR)设置为1％；肽和片段质量误差分别设置为±10ppm和±0.02Da；
步骤6：DIA进行生物样本定量数据采集
另取步骤3中的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60/120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；
轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget＝3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33％；
用Skyline软件进行DIA分析，通过导入步骤5所得的DDA参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析，设置参数为：多肽长度选6-25；子离子m/z要求为大于母离子且last ion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6；
步骤7：差异表达蛋白质筛选
将符合FC>1.5或<0.67，且Pvalue<0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行GO和KEGG功能富集分析和蛋白互作分析。
有益效果：
1、本发明首次从不同民族的人乳差异性出发，系统化研究其蛋白组成和含量的差异性。
2、本发明采用高速分离的方法得到乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白以及酪蛋白三层。
3、本发明采用DIA技术对朝鲜族和汉族母乳中的乳蛋白进行系统化、高通量的研究，并进行比较分析，鉴定出的总蛋白种类多，能全面的获得不同民族之间人乳蛋白的差异，为开发针对我国特定人群的创新性婴幼儿配方食品提供技术支持和新的研发思路。
附图说明
图1是乳清蛋白总鉴定蛋白及差异蛋白。
图2是乳清蛋白中差异蛋白的GO富集分析。
图3是乳清蛋白中差异蛋白的KEGG富集分析。
图4是酪蛋白总鉴定蛋白及差异蛋白。
图5是酪蛋白中差异蛋白的GO富集分析。
图6是酪蛋白中差异蛋白的KEGG富集分析。
图7是乳脂肪球膜蛋白总鉴定蛋白及差异蛋白。
图8是乳脂肪球膜蛋白中差异蛋白的GO富集分析。
图9是乳脂肪球膜蛋白中差异蛋白的KEGG富集分析。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1：样品采集及蛋白质分离
步骤1：样品采集
根据初步调查问卷，从吉林省延边自治州选择18名朝鲜族哺乳期母亲，在采集样本前仔细清洁乳晕和乳头数次，然后用无菌水冲洗相关部位。轻轻地挤出母乳，丢弃第一滴，然后将大约30毫升的母乳放入50毫升的无菌离心管中，并贴上标签。获得的样品立即放置在-80℃的冰箱中，然后通过冷链运输运送到实验室。每6个样品混合成一个混合样，得到3个平行样本；用于后续做三个平行样的生物学重复测定；
用同样的步骤得到汉族母乳的3个平行样本。
将蛋白酶抑制剂加入母乳样品，取12mL母乳样品装入15mL离心管；4℃，3000rpm，离心30min分层，最上层为脂肪层，贴挂侧管壁，轻柔倒出下层脱脂奶液至新管，留脂肪层于原离心管中；磷酸缓冲液(PBS)冲洗脂肪层5次，4℃存放待用；脱脂奶液取1mL用10％乙酸调节溶液pH值至4.6，用于酪蛋白析出，4℃，10000rpm，离心15min，使乳清蛋白与酪蛋白分离；
乳清蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，取上清液，加入4倍体积预冷丙酮，-20℃过夜，沉淀用预冷丙酮清洗3次，得到乳清蛋白沉淀，吹干备用；
酪蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，除去上清液，沉淀即为酪蛋白，预冷丙酮清洗3次，吹干备用；
脂肪蛋白提取：在母乳样品进行离心分离后得到的脂肪层中加入3倍体积甲醇，涡旋震荡，至脂肪层破碎悬浮于甲醇，4℃，9000g，离心10s；除去上清液，加入体系2倍体积的氯仿，涡旋震荡，至沉淀悬浮于氯仿；向体系中加入体系3倍体积去离子水，混匀，4℃，9000g，离心1min，溶液分三层，下层为氯仿，中间层为蛋白层，将上清液移除，向剩余体系中加入3倍体积甲醇，混匀，4℃，9000g，离心2min；除上清，将沉淀用甲醇洗涤2次，吹干，沉淀即为脂肪蛋白；
实施例2乳清蛋白的差异性分析
基于过滤辅助样品制备(FASP)方法，对实施例1得到的乳清蛋白质样品(100μg)进行蛋白质酶水解，向样品中添加8M尿素，使其体积达到200μL。引入二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟。将碘乙酸(IAA)添加到50mM的最终水平，并在室温下无光反应40min。将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次。添加碳酸氢铵溶液(200μL，50mM)，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次。将胰蛋白酶以样品：酶＝50:1(质量比)添加到试管中，并在37℃下进行酶解16小时。通过在12000g、4℃下离心获得肽样品，然后冷冻干燥。
酶解后的多肽样品在Agilent 1100色谱仪中进行High pH反相色谱分级。柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mL/min；随后柱流速增至0.7mL/min，流动相位变化情况为5-5.10min/3％B，5.10-10min/5％B，10-35min/18％B，35-45min/34％B，45-58min/95％B，58-60min/3％B。使用1.5ml EP管，每1分钟接收1管。
另取酶解后的多肽样品经由Orbitrap Fusion Lumos轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget＝5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；分级后的建库DDA数据用ProteomeDiscoverer 2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；相关数据处理参数如下：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606)；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率(FDR)设置为1％；肽和片段质量误差分别为±10ppm和±0.02Da。
另取酶解后的多肽样品经由Orbitrap Fusion Lumos轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget＝3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33％；用Skyline软件进行DIA分析，通过导入上面所得参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析。详细参数如下：多肽长度选6-25；子离子m/z要求为大于母离子且last ion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6。
上述测定，对每个民族样本做三个平行样的生物重复，结果取平均值。
对两个民族的测定结果进行比较，将符合FC>1.5或<0.67，且Pvalue<0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行功能注释和蛋白互作分析。
差异蛋白列表：
图1以柱状图的形式显示了总鉴定蛋白，差异蛋白的数目。相较于汉族组，朝鲜族母乳样品中共鉴定到54个差异表达蛋白，其中36个蛋白表达上调，18个蛋白表达下调。上调蛋白中，细胞间粘附分子-1具有最大的FC值5.50，P值为0.0076。它被认为在多种细胞上表达，同时也是许多关键生理过程所需的最重要的保守人类受体之一。WAP四个二硫核心结构域蛋白2，则是有着第二高的FC值4.72，以及0.04的P值，这表明在两组之间存在显著差异。作为WAP家族成员之一，它在肿瘤的进展、恶性和转移中起着重要作用，同时研究表明，它能促进卵巢癌的转移，并可能成为卵巢癌的潜在治疗靶点。下调蛋白中，磷酸丙糖异构酶是差异最大的蛋白质，有着最小的FC值0.03，p值为0.0027。它是糖酵解和糖异生过程中催化磷酸二羟丙酮(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G3P)相互转化的关键糖酵解酶。除了催化作用外，它还对所有活细胞的碳水化合物代谢和能量生产起着至关重要的作用。
差异蛋白的GO富集分析：
通过GO富集分析分析朝鲜族和汉族母乳之间的差异表达蛋白，结果表明722个GO项中共有357个显著富集(P<0.05)。最显著富集的前30个GO项，包括19个BP，9个CC和2个MF。作为参与蛋白数量最多的项(16)，细胞的富集因子为0.007。其P值为最小值2.85E-08，表明它是最显著富集的GO项。通过GO富集分析研究了韩国和汉族母乳之间的DEP，结果表明，722个GO项中共有357个显著富集(P<0.05)。图2以气泡图的形式显示了前30个显著富集的GO项，包括19BP、9CC和2MF。作为参与蛋白质数量最多的项(16)，细胞内的富集因子为0.007，最小P值为2.85E-08。
在54个DEP中，Rac1参与GO富集分析的项数最多，共101项，其次是40S核糖体蛋白S27a(96)和β淀粉样A4蛋白(95)。
差异蛋白的KEGG富集分析：
采用KEGG富集分析研究了朝鲜族和汉族乳清蛋白之间的差异表达蛋白。图3结果表明，129个KEGG途径中共有58个显著富集(P<0.05)。涉及6种蛋白质的病毒性心肌炎是最显著富集的途径，拥有最小P值4.14e-10，其富集因子为0.1。
差异蛋白的蛋白互作网络分析：
通过MCC法挖掘排名前10位的核心蛋白，按分数排序如下：40S核糖体蛋白S27a(150)，60S核糖体蛋白L10a(150)，60S酸性核糖体蛋白P2(146)，40S核糖体蛋白S4(145)，40S核糖体蛋白S18(120)，60S核糖体蛋白L35(120)，蛋白酶体亚单位α1型(26)，肽基脯氨酸顺反异构酶(12)、L-乳酸脱氢酶(12)和磷酸丙糖异构酶(11)。
实施例3：酪蛋白的差异性分析
基于过滤辅助样品制备(FASP)方法，对实施例1得到的酪蛋白样品(100μg)进行蛋白质酶水解，向样品中添加8M尿素，使其体积达到200μL。引入二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟。将碘乙酸(IAA)添加到50mM的最终水平，并在室温下无光反应40min。将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次。添加碳酸氢铵溶液(200μL，50mM)，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次。将胰蛋白酶以样品：酶＝50:1(质量比)添加到试管中，并在37℃下进行酶解16小时。通过在12000g、4℃下离心获得肽，然后冷冻干燥。
酶解后的多肽样品在Agilent 1100色谱仪中进行High pH反相色谱分级。柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mL/min；随后柱流速增至0.7mL/min，流动相位变化情况为5-5.10min/3％B，5.10-10min/5％B，10-35min/18％B，35-45min/34％B，45-58min/95％B，58-60min/3％B。使用1.5ml EP管，每1分钟接收1管。
另取酶解后的多肽样品经由Orbitrap Fusion Lumos轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60min梯度分离：0min/3％B，0-2min/8％B，2-46min/28％B，46-55min/50％B，55-56min/100％B，56-60min/100％B。柱流量控制在600nL/min；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget＝5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；分级后的建库DDA数据用Proteome Discoverer 2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；相关数据处理参数如下：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606)；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率(FDR)设置为1％；肽和片段质量误差分别为±10ppm和±0.02Da。
另取酶解后的多肽样品经由Orbitrap Fusion Lumos轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以120min梯度分离：0min/3％B，0-2min/7％B，2-92min/22％B，92-107min/40％B，107-110min/100％B，110-120min/100％B。柱流量控制在600nL/min；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget＝3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33％；用Skyline软件进行DIA分析，通过导入上面所得参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析。详细参数如下：多肽长度选6-25；子离子m/z要求为大于母离子且last ion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6。
上述测定，对每个民族样本做三个平行样的生物重复，结果取平均值。
对两个民族的测定结果进行比较，将符合FC>1.5或<0.67，且Pvalue<0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行功能注释。
差异蛋白列表：
图4以柱状图的形式显示了总鉴定蛋白，差异蛋白的数目。通过比较朝鲜族和汉族的酪蛋白中所鉴定蛋白质，观察到39种显著差异表达的蛋白质，其中有10种蛋白质上调，29种下调。在上调的蛋白质中，补体成分C9的FC最高，为5.74，P值为0.0013，这是两组之间差异最大的蛋白质。C9是母乳中补体的九种成分之一，在初乳中作为补体系统的防御因子发挥作用。而在下调的蛋白中，血清转铁蛋白的FC值最低，为0.19，P值为0.0045。作为一种铁结合糖蛋白，它除了能调节体液中的铁含量外，还与多种疾病有关，如无铁蛋白血症和心血管疾病。同时血清转铁蛋白及其受体的特性可以被用来向脑和癌细胞输送药物。
差异蛋白的GO富集分析：
通过GO富集分析分析朝鲜族和汉族母乳之间的差异表达蛋白，结果表示545个GO项中共有125个显着富集(q<0.05)。图5以气泡图的形式显示了前30个显著富集的GO项，其中BP的对刺激反应(7)，CC的细胞与外细胞器(8)，MF的作用于L-氨基酸肽的肽酶活性(3)和肽酶活性(3)分别是涉及蛋白数目最多的项。血液微粒是最富集的GO项，其富集因子为0.235，具有最小q值2.58E-06。经验细胞凋亡过程的负调控(2)则具有最高的富集因子0.33。该项涉及的蛋白质为纤维蛋白原α链和纤维蛋白原γ链。纤维蛋白原是一种丰富的血浆糖蛋白，由α、β和γ链组成。纤维蛋白原是止血的关键分子之一。凝血酶介导的纤维蛋白肽从纤维蛋白原中释放，将这种可溶性蛋白转化为纤维蛋白纤维网络，形成血栓的构建块。纤维蛋白原除了参与凝血，还参与炎症、细胞迁移和肿瘤发生。
差异蛋白的KEGG富集分析：
对于KEGG富集分析，图6结果表明113个KEGG途径中共有35个被显著富集(q<0.05)。金黄色葡萄球菌的富集因子为0.103，并且拥有最小q值为1.03E-10，是最富集的途径。而涉及蛋白质数量最多的途径是金黄色葡萄球菌感染和补体和凝血级联，这二者均涉及7种蛋白质。非洲锥虫病则是有最大富集因子0.135。
差异蛋白的蛋白互作网络分析：
差异表达蛋白的蛋白互作网络分析显示存在23个节点和47条边，表明有23个差异表达蛋白参与了47种相互作用。在这23种蛋白中，19个蛋白表达下调，4个蛋白表达上调。纤维蛋白原α链与9种差异蛋白存在相互作用，是相互作用最多的蛋白质。
通过MCC法挖掘排名前10位的核心蛋白，按分数排序如下：纤维蛋白原α链(1442)，补体成分C9(1442)，纤溶酶原(1441)，血清转铁蛋白(1441)，纤维蛋白原γ链(1440)，cDNAFLJ35730 fis(1440)，补体C3(724)，α-2-巨球蛋白(721)，CD59糖蛋白(5)，聚合免疫球蛋白受体(4)。
实施例4：脂肪蛋白的差异性分析
基于过滤辅助样品制备(FASP)方法，对实施例1得到的脂肪蛋白样品(100μg)进行蛋白质酶水解，向样品中添加8M尿素，使其体积达到200μL。引入二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟。将碘乙酸(IAA)添加到50mM的最终水平，并在室温下无光反应40min。将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次。添加碳酸氢铵溶液(200μL，50mM)，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次。将胰蛋白酶以样品：酶＝50:1(质量比)添加到试管中，并在37℃下进行酶解16小时。通过在12000g、4℃下离心获得肽，然后冷冻干燥。
酶解后的多肽样品在Agilent 1100色谱仪中进行High pH反相色谱分级。柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mL/min；随后柱流速增至0.7mL/min，流动相位变化情况为5-5.10min/3％B，5.10-10min/5％B，10-35min/18％B，35-45min/34％B，45-58min/95％B，58-60min/3％B。使用1.5ml EP管，每1分钟接收1管。
另取酶解后的多肽样品经由Orbitrap Fusion Lumos轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60min梯度分离，流速为0.60mL/min。梯度洗脱方法为：0min/3％B，0-2min/8％B，2-46min/28％B，46-55min/50％B，55-56min/100％B，56-60min/100％B。样品采用1.5mLEP管采集，间隔1min。轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget＝5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；分级后的建库DDA数据用Proteome Discoverer 2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；相关数据处理参数如下：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606)；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率(FDR)设置为1％；肽和片段质量误差分别为±10ppm和±0.02Da。
另取酶解后的多肽样品经由Orbitrap Fusion Lumos轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60min梯度分离：0min/3％B，0-2min/8％B，2-46min/28％B，46-55min/40％B，55-56min/100％B，56-60min/100％B。；柱流量控制在600nL/min；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget＝3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33％；用Skyline软件进行DIA分析，通过导入上面所得参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析。详细参数如下：多肽长度选6-25；子离子m/z要求为大于母离子且last ion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6。
上述测定，对每个民族样本做三个平行样的生物重复，结果取平均值。
对两个民族的测定结果进行比较，将符合FC>1.5或<0.67，且Pvalue<0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行功能注释。
差异蛋白列表:
图7以柱状图的形式显示了总鉴定蛋白，差异蛋白的数目。通过比较朝鲜族和汉族的酪蛋白中所鉴定蛋白质，观察到238种显著差异表达的蛋白质，其中有142种蛋白质上调，96种下调。在上调的蛋白质中，聚合酶蛋白同源样结构域，家族A，成员1，亚型CRA_a(PHLDA1)的FC最高，log2FC值为26.18，P值为0.000776，这是两组之间差异最大的蛋白质。PHLDA1是一种具有多种功能的蛋白，在调节细胞凋亡、增殖、分化和细胞迁移的许多生物学过程中发挥重要作用，因此在不同类型的癌症中表达改变。而在下调的蛋白中，酪氨酸蛋白激酶受体的FC值最低，log2FC值为-7.35，P值为0.01998。酪氨酸蛋白激酶受体可以协调多种细胞功能，如细胞增殖和分化，因此在多种细胞的起始和进化中发挥重要作用
差异蛋白的GO富集分析：
通过GO富集分析分析朝鲜族和汉族母乳之间的差异表达蛋白，结果表示共有374个显着富集(q<0.05)。图8显示了前三十项并对其进行研究，其中BP的细胞代谢过程(30)，CC的膜有界细胞器(37)，MF的催化活性(25)分别是涉及蛋白数目最多的项。细胞外间隙是最富集的GO项，其富集因子为0.045，具有最小q值2.27E-15。过氧化物还蛋白活性则具有最高的富集因子0.8。该项涉及的4个差异蛋白均为过氧化物酶，属于硫醇特异性过氧化物酶，分别催化过氧化氢和有机氢过氧化物还原为水和醇。通过解毒过氧化物和作为过氧化氢介导的信号事件的传感器，在细胞保护氧化应激中发挥作用。
差异蛋白的KEGG富集分析：
对于KEGG富集分析，共有118个被显著富集(q<0.05)。图9显示了前二十项并对其进行研究，数据显示，吞噬小体拥有最小q值为2.20E-12，是富集最显著的途径。而涉及蛋白质数量最多的途径是代谢途径，涉及33个差异蛋白。哮喘则是有最大富集因子0.194。过敏性哮喘是最常见的哮喘表型，通常始于儿童时期，通常同时伴有特应性皮炎和变应性鼻炎等并发症状
差异蛋白的蛋白互作网络分析：
差异表达蛋白的蛋白互作网络分析显示存在202个节点和979条边，表明有202个差异表达蛋白参与了979种相互作用。对PPI网络与对应的前20个枢纽基因的蛋白质的互作网络进行研究，数据表明存在20个节点和143条边。
通过Degree法挖掘排名前20位的核心蛋白，按分数排序如下：肌动蛋白，细胞质1，热休克蛋白HSP 90-alpha，热休克同源物71kDa蛋白，白蛋白，延伸因子1-alpha 1，40S核糖体蛋白SA，60S核糖体蛋白L9，T复合体蛋白1亚基，40S核糖体蛋白S4，40S核糖体蛋白S6，钙联接蛋白，60S核糖体蛋白L18，60S核糖体蛋白L27a，40S核糖体蛋白S19，增殖相关蛋白2G4，60S核糖体蛋白L15，真核翻译起始因子3亚基M，真核生物起始因子4A-I，真核生物起始因子4A-I以及40S核糖体蛋白S25。
Claims (1)
1.一种基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法，有以下步骤：
步骤1：样品采集
采集不同民族新鲜母乳，每例30毫升放入50毫升的无菌离心管中，并贴上标签，获得的样品立即放置在-80℃的冰箱中储存，同一民族随机6～10个样品混合成一个混合样品，每个民族收集至少三个平行的混合样本进行生物学重复；
步骤2：乳清蛋白提取和分离
将蛋白酶抑制剂加入母乳样品，取12mL母乳样品装入15mL离心管；4℃，3000rpm，离心30min分层，最上层为脂肪层，贴挂侧管壁，轻柔倒出下层脱脂奶液至新管，留脂肪层于原离心管中；磷酸缓冲液冲洗脂肪层5次，4℃存放待用；脱脂奶液取1mL用10％乙酸调节溶液pH值至4.6，用于酪蛋白析出，4℃，10000rpm，离心15min，使乳清蛋白与酪蛋白分离；
乳清蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，取上清液，加入4倍体积预冷丙酮，-20℃过夜，沉淀用预冷丙酮清洗3次，得到乳清蛋白沉淀，吹干备用；
酪蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，除去上清液，沉淀即为酪蛋白，预冷丙酮清洗3次，吹干备用；
脂肪蛋白提取：在母乳样品进行离心分离后得到的脂肪层中加入3倍体积甲醇，涡旋震荡，至脂肪层破碎悬浮于甲醇，4℃，9000g，离心10s；除去上清液，加入体系2倍体积的氯仿，涡旋震荡，至沉淀悬浮于氯仿；向体系中加入体系3倍体积去离子水，混匀，4℃，9000g，离心1min，溶液分三层，下层为氯仿，中间层为蛋白层，将上清液移除，向剩余体系中加入3倍体积甲醇，混匀，4℃，9000g，离心2min；除上清，将沉淀用甲醇洗涤2次，吹干，沉淀即为脂肪蛋白；
步骤3：过滤辅助样品制备酶解
基于过滤辅助样品制备方法，对100μg蛋白质样品进行蛋白质酶水解，所述的蛋白质样品是步骤2中分离出的乳清蛋白、酪蛋白、脂肪蛋白的一种，向蛋白质样品中添加8M尿素，使总体积达到200μL，加入二硫苏糖醇至体系中DTT最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟，添加碘乙酸至碘乙酸的终浓度为50mM，并在室温下无光反应40min，将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次，添加200μL浓度为50mM的碳酸氢铵溶液，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次，将胰蛋白酶以样品:酶＝50:1的质量比添加到试管中，并在37℃下酶解16小时，通过在12000g、4℃下离心获得多肽样品，然后冷冻干燥；
步骤4：建库样本准备
酶解后的多肽样品在色谱仪中进行High pH反相色谱分级，柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mL/min；随后柱流速增至0.7mL/min，使用1.5ml EP管，每1分钟接收1管；
步骤5：DDA建库数据采集
另取酶解后的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60/120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；所述溶液B为98％ACN，2％ddH2O，pH10；
轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget＝5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；将获得的质谱数据用ProteomeDiscoverer 2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；数据处理参数为：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率(FDR)设置为1％；肽和片段质量误差分别设置为±10ppm和±0.02Da；
步骤6：DIA进行生物样本定量数据采集
另取步骤3中的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60/120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；
轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget＝3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33％；
用Skyline软件进行DIA分析，通过导入步骤5所得的DDA参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析，设置参数为：多肽长度选6-25；子离子m/z要求为大于母离子且last ion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6；
步骤7：差异表达蛋白质筛选
将符合FC>1.5或<0.67，且Pvalue<0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行GO和KEGG功能富集分析和蛋白互作分析。
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Also Published As
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| CN115856112B (zh) | 2024-05-24 |
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