CN109613253A - 利用dda-dia交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用DDA‑DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，包括以下步骤：1)、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；2)、DIA模式采集待试样品信息：取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头，分别制备成肽段溶液，再进行DIA模式采集定量数据；3)、筛选差异蛋白：将步骤1)得到的信息库列表和步骤2)得到的DIA原始文件导入分析软件Spectronaut Pulsar进行匹配定量、T检验分析，以中蕾期样品为总对照筛选出p<0.05且小蕾期样品、大蕾期样品分别相较中蕾期样品表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白。采用该方法能实现对红颊草莓柱头差异蛋白的定量筛选。
Description
技术领域
本发明涉及植物蛋白组学领域，提供一种定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法。
背景技术
红颊是我国目前面积较广的草莓主栽品种之一，也是常规杂交育种中使用最频繁的亲本材料之一，因此研究其柱头在不同花蕾期的可授性变化，选择适宜的杂交授粉时期，对提高红颊草莓杂交成功率、获得更多的杂交后代、提高杂交效率具有重要的意义。生物体发育过程中，蛋白质作为生命活动的执行和组成者发挥着重要作用，研究红颊草莓柱头蛋白组学、筛选柱头各时期蛋白差异有助于诠释其可授性变化机理，为育种实践提供理论基础。
蛋白组学自1994年提出，进入21世纪后在基因组学物种测序陆续完善的背景下，基因的表达产物蛋白质成为新的热点研究方向。近年来质谱技术凭借其高通量和超高分辨率，代替双向凝胶电泳成为蛋白组学的主要研究方法，随着2005年左右Q TOF和Orbitrap系列等高分辨质谱的普及，蛋白组学正式进入高通量大数据时代。
目前蛋白组学应用较广的质谱采集方法主要有4种，分别为数据依赖型采集(DDA)、数据非依赖型采集(DIA)、平行反应监测(PRM)和多反应监测(MRM)。其中PRM和MRM主要是进行靶向定量的技术手段，适用于定量筛选后的差异蛋白验证；DDA是目前应用最广的蛋白组学定量技术，其采集方式是质谱根据实时一级质谱挑选丰度最高的20或30个母离子进行二级质谱解析，此方法采集效率高、试验设计简单，但由于其实时决定采集序列的特点，重复性差，低丰度蛋白不容易采集到；DIA是近年来新发展的定量技术，其采集方式是将扫描范围分为若干个质荷比(m/z)窗口，每个窗口内的所有母离子都进行二级质谱解析，此方法数据重现性高、二级谱图完善、定量准确，但是需要预先建立母离子和子离子的关联谱图库、实验设计较复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是挖掘红颊草莓柱头不同时期的蛋白水平差异。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，依次包括以下步骤：
1)、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库：
将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，从而建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；
2)、DIA模式采集待试样品信息：
①、质谱上机样品准备和分组
取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头，分别液氮研磨，从而分别获得相应的样品；
每个样品经处理后所得的肽段干粉用体积浓度为0.1％甲酸水溶液进行溶解，从而得到浓度为1μg/μL的肽段溶液；
②、DIA模式采集定量数据
上述每个样品均分别进行如下操作：
取20μL肽段溶液到进样管，再加入1μL 1×iRT标准肽段溶液(Biognosys)混匀，分别进行反向C18液相分离串联Q Exactive质谱DIA模式采集，从而获得相应的DIA原始数据文件；
C18液相流动相组分：C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液，C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 Buffer B；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1ml/min；
DIA模式参数设置为：扫描时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1300m/z；二级扫描分辨率17500@m/z 200；碰撞能量27％，分设32个隔离窗口，具体为350-381m/z,381-398m/z,398-415m/z,415-432m/z,432-444,444-456m/z,456-468m/z,468-480m/z,480-492m/z,492-504m/z,504-516m/z,516-528m/z,528-540m/z,540-552m/z,552-564m/z,564-576m/z,576-592m/z,592-608m/z,608-624m/z,624-640m/z,624-640m/z,640-656m/z,656-672m/z,672-688m/z,688-712m/z,712-736m/z,736-766m/z,766-806m/z,806-856m/z,856-926m/z,926-1300m/z；
3)筛选差异蛋白：
将步骤1)得到的信息库列表和步骤2)得到的DIA原始文件导入分析软件Spectronaut Pulsar(Biognosys)进行匹配定量、T检验分析，
以中蕾期样品为总对照筛选出p<0.05且小蕾期样品、大蕾期样品分别相较中蕾期样品表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白。
作为本发明的利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法的改进，所述步骤1)为：
将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品(即，随机取各时期(包括小蕾期、中蕾期、大蕾期)草莓柱头各50个混合成建库样品)，进行蛋白提取、定量、还原烷基化和酶解除盐，经SCX强阳离子交换-反向C18二维液相分离后进入QExactive质谱仪进行DDA模式数据，质谱得到的原始文件经Maxquant搜库鉴定获得蛋白和肽段信息列表。
作为本发明的利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法的改进，步骤1)中，肽段经SCX强阳离子交换-反向C18二维液相分离的方法是：
①、第一维SCX强阳离子交换液相色谱分离肽段混合物；
SCX Buffer A：10mMKH2PO4，25％乙腈，pH 2.9；
SCX Buffer B：10mM KH2PO4，400mM KCl，25％乙腈，pH 2.9；
SCX Buffer A的制备方法为：在1L体积浓度为25％的乙腈水溶液中加入10mmol的KH2PO4，调节至pH 2.9；
SCX Buffer B的制备方法为：在1L体积浓度为25％的乙腈水溶液中加入10mmol的KH2PO4、400mmol的KCl，调节至pH 2.9；
肽段干粉用100μL SCX Buffer A复溶，经BioBasic SCX柱(Thermofisher)梯度分离，分离梯度：0～5min，0％SCX Buffer B；5～8min，0％～3％SCX Buffer B；8～50min，3％～40％SCX Buffer B；50～60min，40～100％SCX Buffer B；60～65min，100％SCX BufferB；65-70min，100～0％SCX buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为SCX Buffer A；每个时间段内，SCX Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min；
收集10-50min的洗脱液，具体为：第10-18min每分钟收集1管，18-50min每4分钟收集1管(即，每分钟收集1小管，每4小管合并成1管)，共计16管；每管均除盐后冻干(于-70～-20℃冻干至恒重)；因此得到16种肽段粉末；
采用PierceTMC18 Tips(Thermofisher)除盐，步骤依据说明书；
②、第二维反向C18液相分离串联Q Exactive质谱进行DDA模式数据采集；
C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液；
C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；
上述步骤所得的16种肽段粉末均分别进行以下操作：
将肽段粉末用20μL C18 Buffer A复溶，加入1μL 1×iRT标准肽段溶液(Biognosys)，经AcclaimTMPepMapTM100 C18液相色谱柱(Thermofisher)梯度在线分离后，进Q Exactive质谱仪(Thermofisher)进行DDA模式扫描；
DDA模式参数设置：采集时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1500m/z，二级质谱分辨率17500@m/z 200，碰撞能量27％，Top 20模式；
液相分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 BufferB；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min。
作为本发明的利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法的进一步改进，步骤2)的①为：
取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头各50个，分别液氮研磨成样品组1、样品组2、样品组3，每组各分3份共9个样品，分别编号为1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3；
每个样品分别进行蛋白提取、定量、还原烷基化和酶解除盐，各得到约200μg的肽段干粉，加入200μL 0.1％甲酸水溶液，溶解得到1μg/μL的肽段溶液。
本发明是利用Q Exactive质谱仪数据依赖型(Data dependent acquisition,DDA)和数据非依赖型采集模式(Data independent acquisition,DIA)交替采集并定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法。
本发明中，通过Q Exactive质谱仪DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白信息库后，以DIA模式分别采集小蕾期和中蕾期蛋白质谱数据进行定量。
DIA质谱采集方式重现性高、采集数据完整，但需要预先建立母、子离子的关联谱图库，根据质谱仪扫描速度、色谱峰宽制定扫描范围和质荷比隔离窗口。本发明利用DDA采集模式建立红颊草莓柱头母、子离子之间的关联谱图库(即蛋白肽段信息表)，通过DDA结果优化设置了DIA隔离窗口。
依照上述方法，定量到小蕾期、中蕾期、大蕾期的红颊草莓柱头蛋白单针数量均在4500以上，肽段数量单针在26000以上，筛选到红颊草莓柱头小蕾期与中蕾期的差异蛋白282个，大蕾期与中蕾期的差异蛋白157个，实现了对红颊草莓柱头差异蛋白的定量筛选。
附图说明
图1为对比例1(DDA)和实施例1(DIA)分别定量到的红颊草莓柱头蛋白肽段数量；
1-1，1-2，1-3为小蕾期柱头重复；2-1，2-2，2-3为中蕾期柱头重复；3-1，3-2，3-3为大蕾期柱头重复。
每组中，从左至右分别是1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3。
图2为对比例1(DDA)和实施例1(DIA)分别定量到的红颊草莓柱头蛋白数量；
1-1，1-2，1-3为小蕾期柱头重复；2-1，2-2，2-3为中蕾期柱头重复；3-1，3-2，3-3为大蕾期柱头重复。
每组中，从左至右分别是1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3。
图3为对比例1(a、b、c)和实施例1(d、e、f)的质谱二级谱图缺失矩阵对比；
图3中，a,b,c分别为DDA采集的小蕾期、中蕾期、大蕾期柱头蛋白质谱二级谱图缺失矩阵；d、e、f分别为DIA采集的小蕾期、中蕾期、大蕾期柱头蛋白质谱二级谱图缺失矩阵。
灰色条带代表二级谱图缺失；
图4为对比例1和实施例1筛选到的差异蛋白。
A为对比例1筛选到的小蕾期与中蕾期差异蛋白，B为实施例1筛选到的小蕾期与中蕾期差异蛋白；
C为对比例1筛选到的大蕾期与中蕾期差异蛋白，D为实施例1筛选到的大蕾期与中蕾期差异蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中的草莓均指红颊草莓。
实施例1、一种利用Q Exactive质谱仪DDA和DIA模式交替采集并定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，依次进行以下步骤：
1)、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；
在Q Exactive质谱仪(Thermofisher)上通过DDA采集模式建立各个时期红颊草莓柱头蛋白的肽段离子信息库，包括多肽序列(ID号)、数量、子母离子碎片质荷比(m/z)、谱图、相对保留时间(iRT)等数据。其具体步骤包括：
①、建库样品准备和提取纯化；
随机取各时期(包括小蕾期、中蕾期、大蕾期)草莓柱头各50个混合成建库样品，液氮研磨均匀，取0.25g草莓柱头研磨物转移至2mL离心管，加入900μL 4℃预冷提取液和900μL Tris饱和酚组成的抽提剂，冰上震荡混匀30min，4℃5000g离心30min，上清移至干净的10mL管。将离心所得的沉淀(滤饼)替代0.25g草莓柱头研磨物，再重复上述抽提步骤2次(即，重复上述加入抽提剂于冰上震荡、离心2次)，将3次上清液合并后，得合并上清液。
所述提取液为：0.7M蔗糖，0.1M KCl，0.5M Tris-HCl，2％巯基乙醇，50mM EDTA，调至pH8.0；
该提取液的制备方法为：在1L 0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液中加入0.7mol蔗糖、0.1mol KCl、20mL巯基乙醇、50mmol EDTA，调节至pH8.0(利用1M盐酸调节)；
所述Tris饱和酚为：苯酚在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中充分饱和的溶液；
在上述合并上清液中加入5倍合并上清液体积-20℃预冷的0.1M醋酸铵甲醇溶液，于-20±2℃沉淀过夜(静置10～14小时)后5000g离心30min弃上清；-20℃预冷甲醇清洗沉淀三次后，冻干(于-70～—-20℃冻干至恒重)成蛋白粉(约800μg)。
②、蛋白定量和还原烷基化；
取400μL裂解液溶解蛋白粉成蛋白溶液，定量后取含200μg蛋白的蛋白溶液，加入NH4HCO3溶液(pH7.8)直至NH4HCO3的浓度为100mM。再加入11μL 100mM的DTT(DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇)溶液，混匀后放于37℃的金属浴上反应1h；加入12μL 500mM的IAM(Iodoacetamide，碘乙酰胺)溶液，避光室温反应30min；
该裂解液的制备方法为：取48g尿素、0.017gPMSF溶于0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，定容至100mL，调节pH至8.0(利用1M盐酸调节)；
即，所述裂解液为：8M尿素，0.1M Tris-HCl，1mM PMSF(Phenylmethanesulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟)，调至pH 8.0；
备注：上述步骤可在1.5mL离心管中进行；
蛋白定量采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，步骤参照说明书；
③、蛋白酶解；
将步骤②所得的反应液转移至Amicon-Ultra-15超滤管(Millipore)中，按照超滤管说明书进行除杂。即具体为：4℃12000rpm离心20min；弃收集管中废液，再向超滤管中加入150μL100mM NH4HCO3溶液，于4℃12000rpm离心20min，重复上述加入100mM NH4HCO3溶液、离心的步骤1次；更换新的收集管，超滤管中加入100mM NH4HCO3至总体积为100μL，加入4μgTrypsin(Promega)，于37℃金属浴上反应12～16h(过夜)；从而实现酶解。
酶解完成后4℃12000rpm离心15min，再向超滤管中(离心所得沉淀中)加入100mMNH4HCO3(pH8.0)100μL后重复离心(4℃12000rpm离心15min)一次，合并两次离心所得液，即得肽段溶液。
肽段溶液中加入5％(V/V)TFA水溶液至TFA(Trifluoroacetic acid，三氟乙酸)终浓度为1％(V/V)作为肽段样品(约为200μL)，采用PierceTMC18 Tips(Thermofisher)除盐，步骤参照其说明书。
除盐具体为(此为常规技术)：将C18 tip紧密固定在100μL移液器上，吸取100μL50％ACN后打出，重复此步骤一次。吸取吹打100μL 0.1％FA(Formic acid,甲酸)2次，吸取吹打肽段样品10次，吸取吹打100μl 0.1％FA 3次以清洗除盐。依次缓慢吸取50μL 0.1％FAin 50％、60％、70％、80％ACN(Acetonitrile,乙腈)以洗脱肽段，并将洗脱液收集到新的1.5mL离心管中。得到终体积200μL的样本。
将上述PierceTMC18 Tips(Thermofisher)除盐后的肽段样品冻干(于-70～-20℃冻干至恒重)。
④、第一维SCX强阳离子交换液相色谱分离肽段混合物；
SCX Buffer A：10mMKH2PO4，25％乙腈，pH 2.9；
SCX Buffer B：10mM KH2PO4，400mM KCl，25％乙腈，pH 2.9；
SCX Buffer A的制备方法为：在1L体积浓度为25％的乙腈水溶液中加入10mmol的KH2PO4，调节至pH 2.9；
SCX Buffer B的制备方法为：在1L体积浓度为25％的乙腈水溶液中加入10mmol的KH2PO4、400mmol的KCl，调节至pH 2.9；
步骤③所得的干粉(全部冻干粉)用100μL SCX Buffer A复溶，经BioBasic SCX柱(Thermofisher)梯度分离；分离梯度：
0～5min，0％SCX Buffer B；
5～8min,0％～3％SCX Buffer B；
8～50min,3％～40％SCX Buffer B；
50～60min,40～100％SCX Buffer B；
60～65min,100％SCX Buffer B；
65-70min,100～0％SCX buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为SCX Buffer A；每个时间段内，SCX Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min。
收集10-50min的洗脱液，具体为：第10-18min每分钟收集一管，18-50min每4分钟收集1管(即，每分钟收集1小管，每4小管合并成1管)，共计16管；每管均除盐后冻干(于-70～-20℃冻干至恒重)；因此得到16种肽段粉末；
除盐采用PierceTMC18 Tips(Thermofisher)，依据说明书；类同于上述步骤③。
⑤、第二维反向C18液相分离串联Q Exactive质谱进行DDA模式数据采集；
C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液；
C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液。
步骤④所得的16种肽段粉末均分别进行以下操作：
将肽段粉末用20μL C18 Buffer A复溶，加入1μL 1×iRT标准肽段溶液(Biognosys，货号Ki-3002-1)，经AcclaimTMPepMapTM100 C18液相色谱柱(Thermofisher)梯度在线分离后，Q Exactive质谱仪(Thermofisher)进行DDA模式扫描；
DDA模式参数设置：采集时间120min,离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1500m/z，二级质谱分辨率17500@m/z 200，碰撞能量27％，Top 20模式；
液相分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 BufferB；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B。
上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min。
备注：第二维C18色谱柱分离得到的组分直接实时进入质谱仪分析，搭载C18色谱柱的液相与质谱是配套在线连接的，某一时间从液相洗脱下来的组分在几秒钟内就会完成进入质谱得到碎裂离子谱图的过程。
TOP20即质谱每一时间点根据一级谱图对丰度最高的20个肽段进行碎裂采集二级谱图。
⑥、DDA采集结果数据分析。
质谱得到的原始文件经Maxquant搜库鉴定获得蛋白和肽段信息列表，至此建立成功Q Exactive平台上各个时期红颊草莓柱头的蛋白肽段信息库；蛋白库下载自StrawberryGarden，搜库参数参照Maxquant使用说明。
备注：原始文件为记录有肽段母子离子的质荷比、峰面积、保留时间等质谱信息的raw file格式的原始文件，需用搜库软件进行搜库后才能解读成蛋白和肽段信息。
具体而言：信息库肽段共有48578条，包含每条肽段的氨基酸序列、保留时间、质荷比、峰强度等数据；按照上述步骤就能获得此信息。
2)、DIA模式采集待试样品信息；
①、质谱上机样品准备和分组；
各取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头50个，分别液氮研磨成样品组1、样品组2、样品组3，每组各分3份共9个样品，分别编号为1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3。
参照步骤1)中第①-③步的方法进行蛋白提取、定量、还原烷基化和酶解除盐，每个样品各得到约200μg的肽段干粉(冻干粉)，加入200μL 0.1％甲酸水溶液,溶解得到1μg/μL的肽段溶液。
②、DIA模式采集定量数据；
上述每个样品均分别进行如下操作：
取20μL肽段溶液到进样管，再加入1μL 1×iRT标准肽段溶液(Biognosys)混匀，分别进行反向C18液相分离串联Q Exactive质谱DIA模式采集，共得到9个DIA原始数据文件。
反向C18液相分离梯度同步骤1)中第⑤步，即，具体为：
C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液；
C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液。
液相分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 BufferB；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B。
上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min。
DIA模式参数设置为：扫描时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1300m/z；二级扫描分辨率17500@m/z 200；碰撞能量27％,分设32个隔离窗口，为350-381m/z,381-398m/z,398-415m/z,415-432m/z,432-444,444-456m/z,456-468m/z,468-480m/z,480-492m/z,492-504m/z,504-516m/z,516-528m/z,528-540m/z,540-552m/z,552-564m/z,564-576m/z,576-592m/z,592-608m/z,608-624m/z,624-640m/z,624-640m/z,640-656m/z,656-672m/z,672-688m/z,688-712m/z,712-736m/z,736-766m/z,766-806m/z,806-856m/z,856-926m/z,926-1300m/z。
备注：DIA采集模式则对所有肽段都进行碎裂采集二级谱图，其采集方式是将扫描范围分为若干个区块(隔离窗口)进行分段采集。肽段二级谱图是蛋白准确定量的主要依据和关键因素。
3)筛选差异蛋白。
将步骤1)得到的信息库列表和步骤2)得到的DIA原始文件(质谱所得)导入分析软件Spectronaut Pulsar(Biognosys)进行匹配定量、T检验分析，筛选出p<0.05且样品组1、样品组3分别相较组2表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白，所有软件参数均采用默认设置。
实施例1定量到的小蕾期和中蕾期的红颊草莓柱头肽段单针在26000以上(如图1所示)，蛋白单针数量在4500以上(如图2所示)，筛选到小蕾期和中蕾期的红颊草莓柱头差异蛋白282个(如图4B所示)，大蕾期和中蕾期的差异蛋白157个(如图4D所示)。组1、组2和组3的蛋白二级谱图缺失分别仅为1.71％、1.99％和2.46％(如图3d、e、f所示)，数据完整度高，组内重复性好，定量结果准确。
说明：
缺失率＝缺失次数/理论鉴定次数。举例：组1分3次重复共鉴定到5个蛋白，理论鉴定次数应为5*3＝15次；实际上有1个蛋白只在1个重复中鉴定到，即缺失了2次鉴定结果，总缺失率为2/15。
差异蛋白筛选由Spectronaut Pulsar软件自动进行T检验分析，然后根据p<0.05，表达倍数≥1.5或者≤2/3的标准获得。
对比例1：相对于实施例1而言，样品准备和分组与步骤2)中第①步相同，后续步骤更改为每个样品各取20μL肽段溶液到进样管，分别进行反向C18液相分离串联Q Exactive质谱DDA模式采集，共得到9份DDA原始数据，液相分离梯度、DDA模式参数设置与实施例1步骤1)中第⑤步相同。使用Maxquant软件对DDA数据进行搜库鉴定，使用Persues软件对搜库结果进行定量分析，筛选出p<0.05且样品组1、组3对别相较组2表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白，所有软件参数均按照软件开发者说明设置。
对比例1定量到的单针肽段量在10000-13000左右(如图1所示)，单针蛋白量在3300-3400左右(如图2所示)，相比实施例1大幅减少。筛选到小蕾期与中蕾期的差异蛋白250个(如图4A所示)，大蕾期与中蕾期的差异蛋白149个(如图4C所示)。但定量数据缺失比例较高，组1、组2和组3的二级谱图缺失分别达到18.59％、20.19％和17.28％(如图3a、b、c所示)，数据完整度和重复性远不及实施例1，因此定量可靠性不及实施例1。
上述实施例1、对比例1的分析结果比较如下表1所述。
表1、实施例1与对比例1的分析结果比较
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，其特征是依次包括以下步骤：
1)、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库：
将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，从而建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；
2)、DIA模式采集待试样品信息：
①、质谱上机样品准备和分组
取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头，分别液氮研磨，从而分别获得相应的样品；
每个样品经处理后所得的肽段干粉用体积浓度为0.1％甲酸水溶液进行溶解，从而得到浓度为1μg/μL的肽段溶液；
②、DIA模式采集定量数据
上述每个样品均分别进行如下操作：
取20μL肽段溶液到进样管，再加入1μL 1×iRT标准肽段溶液混匀，分别进行反向C18液相分离串联Q Exactive质谱DIA模式采集，从而获得相应的DIA原始数据文件；
C18液相流动相组分：C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液，C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 Buffer B；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1ml/min；
DIA模式参数设置为：扫描时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1300m/z；二级扫描分辨率17500@m/z 200；碰撞能量27％，分设32个隔离窗口，具体为350-381m/z,381-398m/z,398-415m/z,415-432m/z,432-444,444-456m/z,456-468m/z,468-480m/z,480-492m/z,492-504m/z,504-516m/z,516-528m/z,528-540m/z,540-552m/z,552-564m/z,564-576m/z,576-592m/z,592-608m/z,608-624m/z,624-640m/z,624-640m/z,640-656m/z,656-672m/z,672-688m/z,688-712m/z,712-736m/z,736-766m/z,766-806m/z,806-856m/z,856-926m/z,926-1300m/z；
3)筛选差异蛋白：
将步骤1)得到的信息库列表和步骤2)得到的DIA原始文件导入分析软件SpectronautPulsar进行匹配定量、T检验分析，
以中蕾期样品为总对照筛选出p<0.05且小蕾期样品、大蕾期样品分别相较中蕾期样品表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白。
2.根据权利要求1所述的利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，其特征是所述步骤1)为：
将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，进行蛋白提取、定量、还原烷基化和酶解除盐，经SCX强阳离子交换-反向C18二维液相分离后进入QExactive质谱仪进行DDA模式数据，质谱得到的原始文件经Maxquant搜库鉴定获得蛋白和肽段信息列表。
3.根据权利要求2所述的利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，其特征是步骤1)中，肽段经SCX强阳离子交换-反向C18二维液相分离的方法是：
①、第一维SCX强阳离子交换液相色谱分离肽段混合物；
SCX Buffer A：10mMKH2PO4，25％乙腈，pH 2.9；
SCX Buffer B：10mM KH2PO4，400mM KCl，25％乙腈，pH 2.9；
SCX Buffer A的制备方法为：在1L体积浓度为25％的乙腈水溶液中加入10mmol的KH2PO4，调节至pH 2.9；
SCX Buffer B的制备方法为：在1L体积浓度为25％的乙腈水溶液中加入10mmol的KH2PO4、400mmol的KCl，调节至pH 2.9；
肽段干粉用100μL SCX Buffer A复溶，经BioBasic SCX柱梯度分离，分离梯度：0～5min，0％SCX Buffer B；5～8min，0％～3％SCX Buffer B；8～50min，3％～40％SCXBuffer B；50～60min，40～100％SCX Buffer B；60～65min，100％SCX Buffer B；65-70min，100～0％SCX buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为SCX Buffer A；每个时间段内，SCX Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min；
收集10-50min的洗脱液，具体为：第10-18min每分钟收集1管，18-50min每4分钟收集1管，共计16管；每管均除盐后冻干；因此得到16种肽段粉末；
②、第二维反向C18液相分离串联Q Exactive质谱进行DDA模式数据采集；
C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液；
C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；
上述步骤所得的16种肽段粉末均分别进行以下操作：
将肽段粉末用20μL C18 Buffer A复溶，加入1μL 1×iRT标准肽段溶液，经AcclaimTMPepMapTM100 C18液相色谱柱(Thermofisher)梯度在线分离后，进Q Exactive质谱仪进行DDA模式扫描；
DDA模式参数设置：采集时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1500m/z，二级质谱分辨率17500@m/z 200，碰撞能量27％，Top 20模式；
液相分离梯度：0～3min，4～7％C18 Buffer B；3～103min，7～18％C18 Buffer B；103～113min，18～35％C18 Buffer B；113～117min，35～75％C18 Buffer B；117～120min，75％C18 Buffer B；
上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1mL/min。
4.根据权利要求1或2所述的利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，其特征是所述步骤2)的①为：
取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头各50个，分别液氮研磨成样品组1、样品组2、样品组3，每组各分3份共9个样品，分别编号为1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3；
每个样品分别进行蛋白提取、定量、还原烷基化和酶解除盐，各得到约200μg的肽段干粉，加入200μL 0.1％甲酸水溶液，溶解得到1μg/μL的肽段溶液。
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