CN102841126A

CN102841126A - 一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法

Info

Publication number: CN102841126A
Application number: CN2012103153989A
Authority: CN
Inventors: 滕年军; 黄至喆; 陈发棣; 张凤姣; 房伟民; 蒋甲福; 管志勇; 陈素梅; 刘兆磊
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: CN102841126B

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，属于菊花蛋白质组学领域。该方法包括：以栽培菊花作母本，野菊为父本进行菊花远缘杂交工作。授粉后1h及24h，剪下已授粉的花序；去除取得的花序中舌状花花瓣及萼片得到雌蕊。所得的雌蕊用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质样品；运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析。本发明针对菊花及其近缘属野生种，提供了一种快速准确鉴定菊花花粉与柱头互作过程中的关键差异蛋白，为解决菊花远缘杂交不亲和性提供研究基础。

Description

一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法

技术领域

本发明涉及菊花蛋白质组学领域，具体地说涉及菊花杂交后花粉与柱头互作差异蛋白的快速检测与鉴定方法。

背景技术

菊花是中国十大传统名花和世界四大切花之一，它品种繁多，色彩丰富，花形多变，姿态万千，在世界花卉栽培与应用中的地位极为重要。菊花原产中国，距今已有1600多年的栽培历史目前，中国选育的菊花品种约有4000多个，全球品种总数超过2万，但多数菊花品种的抗逆性较差，严重限制了其产量和品质的提高和推广应用地域范围。因此，培育抗性强的菊花新品种刻不容缓。菊花近缘种属野生植物中具有许多栽培菊花所缺乏的优良性状，如甘菊、野菊等的抗病虫性，蒙菊的抗旱性，菊花脑的耐热性及阿尔菊的抗寒性等，因此通过栽培菊花与野生菊间远缘杂交，将野生资源的优异基因导入栽培品种是进行菊花抗性种质创新和新品种选育的重要途径之一。

然而在野菊与栽培菊种间杂交中，经常遇到结实率低、甚至不能获得杂交种子的问题，致使许多低倍性野菊的优异基因难以导入栽培品种中以实现其抗性改良。已有研究表明，栽培菊花与野生菊杂交失败的主要原因包括受精前障碍和受精后障碍两方面，其中花粉与柱头之间，更确切的说是花粉壁与柱头表膜之间的作用是识别的第一步, 也是至关重要的一步, 对于完成受精起着决定性的作用。现已确认, 在传粉受精过程中, 花粉壁蛋白与雌蕊组织蛋白之间的识别反应决定花粉是否萌发以及亲和性或不亲和性。因此，准确快速的鉴定花粉与柱头互作过程中的差异蛋白有十分重要的意义。

多重化学标记串联质谱技术（iTRAQ）是近年来新研发的一种多肽体外标记技术，该技术采用4 种或8 种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，尔后进行串联质谱分析，可同时比较4 种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。通过该技术，可以快速鉴定菊花花粉与柱头互作过程中的关键差异蛋白，为解决菊花远缘杂交不亲和性提供研究基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，以为克服菊花杂交中的障碍提供分子基础，实现不同菊属间各种优良基因的转移。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）以栽培菊花作母本，野菊为父本进行菊花远缘杂交工作，于授粉后1h及24h，分别剪下已授粉的花序；

（2）去除所述花序中的舌状花花瓣及萼片得到授粉后1h的雌蕊和授粉后24h的雌蕊，将所述的的雌蕊分别用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，得到授粉后1h雌蕊的蛋白质样品（I）和授粉后24h雌蕊的蛋白质样品（II）；

（3）将授粉后1h雌蕊的蛋白质样品（I）和授粉后24h雌蕊的蛋白质样品（II）分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析鉴定出菊花花粉与柱头互作差异蛋白。

菊花授粉后，分别在1h和24h剪下已授粉的花序，是本发明的一个重要关键，如果取样时间不合适，即使下面实验进行的再完美，也不能获得影响花粉在柱头萌发的关键差异蛋白。第二次取样时间如果超过24h，例如30h取样，则影响花粉与柱头互作关键差异蛋白很可能已降解，所获得的结果就不是影响花粉与柱头互作的关键差异蛋白。

步骤（3）中运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白的过程为：以授粉后1h雌蕊的蛋白质样品（I）作为对照样品，以授粉后24h雌蕊的蛋白质样品（II）作为处理样品，将对照样品和处理样品分别定量、纯化和酶解后，再分别进行iTRAQ标记、去除残留标记试剂和脱盐，最后分别进行第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，得到对照样品的试验数据和处理样品的实验数据；将对照样品的实验数据和处理样品的实验数据进行生物信息学分析，鉴定出菊花花粉与柱头互作差异蛋白。

上述的第一维高pH反相色谱分离的过程为：将iTRAQ标记处理后的肽段粉末使用高pH流动相A溶解上样，使用梯度洗脱，0-30分钟，流动相由5%B升至35%B；30-32分钟，由35%B升至80%B；32-35分钟保持80%B，35-36分钟由80%B降至5%B，并保持14分钟平衡色谱柱，高pH反相梯度共50分钟，流速为200μl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214nm波长检测。第一维高pH反相色谱分离的高pH流动相：A为20mM甲酸铵水溶液，pH=10.0(色谱纯氨水调节)； B为：20mM甲酸铵，90%乙腈，pH=10.0(色谱纯氨水调节)。

上述的第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集过程为：（1）第一维高pH反相色谱分离得到的肽段干粉使用流动相A溶解上样；（2）上样流速为20μl/min，上样5分钟，肽段直接被捕集柱捕集，同时经过捕集柱的盐溶液直接排入废液；（3）经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段；

100分钟内流动相从5% B升至40% B，5分钟内B从40%升至80%，然后1分钟内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14分钟，反相过程共120分钟，流速为500nL/min，色谱柱温度为35℃；所述的第二维低pH反相色谱分离的流动相：A为5%乙腈，0.1%甲酸水溶液（体积比），pH=2.5(色谱纯甲酸调节)； B为90%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5(色谱纯甲酸调节)。

质谱条件：离子源喷雾电压为1.2kV，LTQ Orbitrap XL质谱仪加热毛细管设定为200℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集；全扫描MS使用Orbitrap进行质心模式扫描，扫描范围为m/z 400-1800，分辨率设定为30,000 (m/z 400处)；线性离子阱离子最大引入时间为200ms，自动增益控制设定为1×10⁶，随后使用高能碰撞解离对符合串级碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描；对强度排名前6的离子进行MS/MS并进行Centroid模式扫描，对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，MS/MS使用高纯氦气，40%的碰撞能量，碰撞反应40ms。

上述生物信息学分析的过程为：获得的实验数据使用ProteinPilot软件的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量，检索数据库为NCBI拟南芥和水稻种属非冗余数据库(拟南芥2011_11，222070条序列；水稻2011_11，277623条序列)；搜索参数设置如下：胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切为2，固定修饰为半胱氨酸的甲基甲基硫代甲砜（methylmethanethiosulfonate ，MMTS）烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，肽段N端和赖氨酸的iTRAQ修饰；为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3，同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量；数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。

通常TRAQ标记和质谱技术能获得对照和处理样品的差异蛋白一般超过100个，然而绝大部分不是目标差异蛋白，因此如何准确、高效地从这多100个差异蛋白中找到所要的目标差异蛋白也是本申请专利的个重要关键。为此将蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3（此时蛋白置信度≥95%），同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量。此外，数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。这样获得的差异蛋白就是我们想要的目标差异蛋白。

本发明的有益效果：

本发明的一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法针对菊花及其近缘属野生种，提供了一种快速准确鉴定菊花花粉与柱头互作过程中的关键差异蛋白，为解决菊花远缘杂交不亲和性提供研究基础。

具体实施方式

实施例1

一、以市售的栽培菊花‘雨花星辰’作母本，选取发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，即将内轮两性管状小花全部去除，同时剪去舌状花花瓣直到可见柱头（不能伤及柱头），并严格进行套袋。父本在头状花序开放散粉前套袋隔离。待母本柱头伸出并开叉呈现锐角和分泌黏液时（去雄后3~5 d），收集已套袋的父本菊花脑新鲜花粉，用毛笔对母本进行授粉，授粉后立刻对母本继续套袋隔离。授粉后1h及24h，分别剪下已授粉的花序，立即在液氮中速冻后保存于-80℃备用。

二、去除所述花序中的舌状花花瓣及萼片并用镊子取出授粉后1h的雌蕊和授粉后24h的雌蕊，将所述的雌蕊分别用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，得到授粉后1h雌蕊的蛋白质样品（I）和授粉后24h雌蕊的蛋白质样品（II），并保存于-80℃备用；

TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的详细过程为：

1、取0.2g雌蕊在液氮中将其研磨成粉末，悬浮于5ml的含10%(w/v)三氯乙酸(TCA)和0.07%(m/v)二硫苏糖醇（DTT）的丙酮中（-20℃预冷），充分震荡混匀，-20℃静止1h以上；

2、12000g，4℃离心15min，弃上清，将沉淀悬浮于含0.07%DTT的-20℃丙酮中；

3、重复上一步骤1-2，将沉淀冷冻干燥获得蛋白质干粉。

三、将授粉后1h雌蕊的蛋白质样品（I）和授粉后24h雌蕊的蛋白质样品（II）分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析鉴定出菊花花粉与柱头互作差异蛋白。

以授粉后1h的雌蕊提取的蛋白质样品（I）作为对照样品，进行定量、纯化和酶解后，进行iTRAQ标记、去除残留标记试剂和脱盐，然后进行第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，得到对照样品的实验数据；

以授粉后24h的雌蕊提取的蛋白质样品（II）作为处理样品，进行定量、纯化和酶解后，进行iTRAQ标记、去除残留标记试剂和脱盐，然后进行第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，得到处理样品的实验数据；

将对照样品的实验数据和处理样品的实验数据进行生物信息学分析，鉴定出菊花花粉与柱头互作差异蛋白。

（一）蛋白质样品前处理

蛋白定量、纯化、酶解的详细过程为：

1、使用iTRAQ 8标试剂盒的溶解液（Dissolution Buffer）20微升溶解100微克蛋白质干粉样品。

2、每样品添加1微升变性剂溶液（Denaturant），混旋均匀。所用的变性剂溶液为2%十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）。

3、每样品添加2微升还原剂（Reducing Reagent），混旋均匀后，5,000g离心。所用的还原剂为5 mM的三羧甲基磷酸（Tris-(2-carboxyethy) phosphine，TCEP）。

4、于60℃下反应1小时。

5、5,000g离心使得样品位于EP管管底部。

6、每蛋白质样品添加1微升半胱氨酸封闭试剂（Cysteine BlockingReagent），混旋均匀后，5,000g离心得样品位于EP管管底部，室温下反应10分钟。

7、每蛋白质样品添加测序级胰酶1微升（0.6微克/微升），混旋均匀后，5,000g离心得样品位于EP管管底部。

8、37℃下酶解反应16小时，制得酶解后的蛋白质样品溶液。

按照上述步骤共制备8份酶解后的样品溶液。

iTRAQ标记（多重化学标记串联质谱技术）：

1、配制iTRAQ 8标试剂：a)于-20℃下取出8标试剂，使试剂恢复到室温（25±5℃）。b)1,000g下离心使试剂位于管底。c)每管试剂添加50微升异丙醇溶剂。d)混旋均匀后，5,000g离心得样品位于EP管管底部。

2、将各个标记试剂分别添加至酶解后的样品溶液当中。

3、混旋均匀后，5,000g离心得样品位于EP管管底部。

4、吸取0.5微升溶液，使用pH试纸测定pH值，添加1~5微升iTRAQ 8标试剂盒的溶解液（Dissolution Buffer）调整pH值至7.5-8.5。

5、室温（25±5℃）下反应2小时。

6、将各标记后的样品溶液混合成一管。

7、混合均匀后5,000g离心得样品位于EP管底部。

8、使用冷冻离心干燥机将标记后的混合肽段干燥成粉末。

去除残留标记试剂：

使用PolyLC公司PolySULFOETHYL A强阳离子交换柱脱去残留的标记试剂。将iTRAQ标记后的混合肽段粉末使用强阳离子溶解液（10mM磷酸钾，5%乙腈，pH=2.5）200μl溶解，溶解液使用流动注射泵以40μl/min速度注入离子交换柱。使用400μl溶解液注入交换柱洗下不保留物质，弃去流出液。注入200μl洗脱液[10mM磷酸钾，500mM氯化钾，25%乙腈，pH=2.5(磷酸调节)]收集洗脱液。

脱盐：

1、离子交换后的洗脱液使用冷冻离心干燥机干燥成粉末，以除去乙腈成分。

2、使用1%(v/v)乙腈（ACN），0.1%(v/v)三氟乙酸（TFA）溶液400微升重溶。

3、C18脱盐柱（Sep-Pack Cartridge，Waters公司），使用60% ACN，0.1%TFA溶液200微升清洗。

4、使用1% ACN，0.1%TFA溶液600微升平衡脱盐柱。

5、将重溶样品加入到脱盐柱内，使样品缓慢流过脱盐柱，标记肽段被脱盐柱捕集，盐等其它非疏水性小分子流出。

6、再添加200微升1% ACN，0.1%TFA溶液清洗脱盐柱，洗去残留的盐类。

7、添加300微升60% ACN，0.1%TFA溶液，使液体缓慢流过脱盐柱，将肽段洗脱下来，使用EP管收集洗脱液。

8、洗脱液使用冷冻离心干燥机内冻干，形成纯化后的标记肽段粉末。

（二）第一维高pH反相色谱分离

高pH流动相A为20mM甲酸铵，pH=10.0(色谱纯氨水调节)；高pH流动相B为20mM甲酸铵，90%乙腈，pH=10.0(色谱纯氨水调节)。纯化后的标记肽段粉末使用高pH流动相A 100μl溶解上样，使用梯度洗脱，0-30分钟，流动相由5%B升至35%B；30-32分钟，由35%B升至80%B；32-35分钟保持80%B，35-36分钟由80%B降至5%B，并保持14分钟平衡色谱柱，高pH反相梯度共50分钟。流速为200μl/min，色谱柱保持在室温（25±5℃）条件，使用紫外214nm波长检测。

第一维高pH反相色谱分离共收集15份馏分，使用冷冻离心干燥机(RVC2-25离心冷冻真空干燥器(Christ,德国))干燥成肽段粉末。

（三）第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集及分析

硬件系统：肽段使用反相纳升级液相色谱(Nano-RPLC)/ESI-MS/MS进行分析。

反相色谱分离：

1、第一维高pH反相色谱分离得到的肽段干粉使用51μl流动相A溶解，溶解后上样50μl。

第二维低pH反相色谱分离流动相：A为5%乙腈，0.1%甲酸水溶液（体积比），pH=2.5(色谱纯甲酸调节)； B为90%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5(色谱纯甲酸调节)。

2、上样流速为20μl/min，上样5分钟，肽段直接被捕集柱捕集，同时经过捕集柱的甲酸铵等盐溶液直接排入废液。

3、经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段。

100分钟内从5% B升至40% B，5分钟内B从40%升至80%，然后1分钟内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14分钟，反相过程共120分钟，流速为500nL/min，色谱柱温度为35℃。

质谱条件：离子源喷雾电压为1.2kV，LTQ Orbitrap XL质谱仪加热毛细管设定为200℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS使用Orbitrap进行质心模式（Centroid）扫描，扫描范围为m/z 400-1800，分辨率设定为30,000 (m/z 400处)。线性离子阱（LTQ）离子最大引入时间为200ms，自动增益控制(Automatic gaincontrol, AGC)设定为1×10⁶，随后使用高能碰撞解离（Higherenergy C-trap dissociation, HCD）对符合串级（MS/MS）碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描。对强度排名前6的离子进行MS/MS并进行Centroid模式扫描。对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集。MS/MS使用高纯氦气，40%的碰撞能量，碰撞反应40ms。

采用以上的定量、纯化、酶解、iTRAQ标记、去除残留标记试剂、脱盐、第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集操作步骤，得到对照样品和处理样品的实验数据；将对照样品和处理样品的实验数据进行生物信息学分析，鉴定出菊花花粉与柱头互作差异蛋白。

数据分析：iTRAQ实验数据使用ProteinPilot软件(version 4.0, Applied Biosystems, USA)的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量。检索数据库为NCBI拟南芥（水稻）种属非冗余(non-redundant,nr)数据库(拟南芥2011_11，222070条序列；水稻2011_11，277623条序列)。搜索参数设置如下：胰蛋白酶(Trypsin)，全酶切方式，最大漏切为2。固定修饰为半胱氨酸(Cysteine)的甲基甲基硫代甲砜（methyl methanethiosulfonate ，MMTS）烷基化，可变修饰为甲硫氨酸(Methionine)的氧化，肽段N端和赖氨酸(lysine)的iTRAQ修饰。为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3（此时蛋白置信度≥95%），同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量。数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。

结果共鉴定出的差异蛋白8个，其中上调蛋白7个，下调蛋白1个。

菊花抗性育种和新品种选育中经常遇到受精前生殖障碍（即花粉与雌蕊柱头不能相互识别，花粉很难在柱头表面萌发或萌发的花粉管生长异常，最终无法将精细胞带到胚囊与母细胞完成受精作用）是影响菊花抗性育种和新品种选育的一个重要因素，而引起受精前生殖障碍主要是花粉粒表面蛋白与柱头表面蛋白未能很好地识别，即花粉与柱头的相互设别是靠双方所含的特定蛋白完成的。通过本发明我们获得了在受精前生殖障碍过程中8个明显变化的关键蛋白，即这8个蛋白是引起受精生殖障碍的关键因子（尽管各个蛋白发挥的功能可能存在差异）。因此，通过本发明我们获得了引起菊花抗性种质创新和新品种选育中受精前生殖障碍的关键因子，这将为我们今后深入开展后续研究，最终从细胞和分子水平上阐明受精前生殖障碍真正机理奠定了重要基础，然后我们会采取相应的措施有效克服受精前生殖障碍，最终能够加快菊花抗性种质创新和新品种选育的进程。

Claims

1.一种快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于步骤（3）中运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白的过程为：以授粉后1h雌蕊的蛋白质样品（I）作为对照样品，以授粉后24h雌蕊的蛋白质样品（II）作为处理样品，将对照样品和处理样品分别定量、纯化和酶解后，再分别进行iTRAQ标记、去除残留标记试剂和脱盐，最后分别进行第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，得到对照样品的试验数据和处理样品的实验数据；将对照样品的实验数据和处理样品的实验数据进行生物信息学分析，鉴定出菊花花粉与柱头互作差异蛋白。

3.根据权利要求2所述的快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于所述第一维高pH反相色谱分离的过程为：将iTRAQ标记处理后的肽段粉末使用高pH流动相A溶解上样，使用梯度洗脱，0-30分钟，流动相由5%B升至35%B；30-32分钟，由35%B升至80%B；32-35分钟保持80%B，35-36分钟由80%B降至5%B，并保持14分钟平衡色谱柱，高pH反相梯度共50分钟，流速为200μl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214nm波长检测。

4.根据权利要求3所述的快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于第一维高pH反相色谱分离的高pH流动相：A为20mM甲酸铵水溶液，pH=10.0； B为：20mM甲酸铵，90%乙腈，pH=10.0。

5.根据权利要求2所述的快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于所述的第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集过程为：（1）第一维高pH反相色谱分离得到的肽段干粉使用流动相A溶解上样；（2）上样流速为20μl/min，上样5分钟，肽段直接被捕集柱捕集，同时经过捕集柱的盐溶液直接排入废液；（3）经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段；

100分钟内流动相从5% B升至40% B，5分钟内B从40%升至80%，然后1分钟内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14分钟，反相过程共120分钟，流速为500nL/min，色谱柱温度为35℃；

6.根据权利要求5所述的快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于所述的第二维低pH反相色谱分离的流动相：A为5%乙腈，0.1%甲酸水溶液（体积比），pH=2.5； B为90%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5。

7.根据权利要求1或2所述的快速鉴定菊花花粉与柱头互作差异蛋白的方法，其特征在于所述生物信息学分析的过程为：获得的实验数据使用ProteinPilot软件的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量，检索数据库为NCBI拟南芥和水稻种属非冗余数据库；搜索参数设置如下：胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切为2，固定修饰为半胱氨酸的甲基甲基硫代甲砜烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，肽段N端和赖氨酸的iTRAQ修饰；为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3，同时最少使用2条置信度≥95%的肽段进行蛋白定量；数据结果经过自动偏离校正以便消除标记样品合并时引入的误差。