CN104178480A - 利用dna吸附柱快速提取植物dna的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒及方法，属于生物技术领域。所述试剂盒的组成包括裂解液、抽提液、沉淀剂、去蛋白液、漂洗液、洗脱液和DNA吸附柱。方法包括植物组织样品的前处理、DNA的游离与杂蛋白的抽除、DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除、DNA洗脱。利用该试剂盒能够快速提取植物基因组DNA，所得到的基因组DNA具有较高的纯度。

Description

利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒及方法，属于生物技术领域。

背景技术

DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。DNA提取技术的不断发展，为全基因组测序等多项应用创造了有利条件。随着现代分子生物学的发展，DNA分离技术也层出不穷．DNA已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来，也可以从痕量材料获得DNA。目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。

传统的DNA提取与纯化，如CTAB法、SDS法是在裂解细胞的基础上，多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的；加入RNA酶除去核酸中的RNA；然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA；用70％乙醇漂洗沉淀，除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应，最后用TE溶解DNA备用。传统的植物组织DNA提取过程耗时长，容易造成DNA损失和降解，

因此需要研制一种适用于植物基因组DNA提取的方便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法所获得的DNA样品存在完整性不好、易降解等缺点。

此外，有效的提取植物基因组DNA，能够为进行基因分析与基因克隆提供重要保证，从而丰富基因组学的研究内容。

发明内容

本发明提供一种利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒及方法，利用该试剂盒能够快速提取植物基因组DNA，所得到的的基因组DNA具有较高的纯度。

本发明首先提供了一种利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒，所述试剂盒的组成包括：

（1）裂解液：0.1M Tris-HCl pH 8.0，0.025M EDTA pH 8.0，8-9%重量比 NaCl，3%重量比CTAB，2%重量比巯基乙醇；

（2）抽提液：氯仿；

（3）沉淀剂：70%重量比乙醇；

（4）去蛋白液：5M盐酸胍，20 mM Tris-HCI pH6.6，使用前加入乙醇，使乙醇浓度为38％；

（5）漂洗液：20mM NaCL，2mM Tris-HCI pH7.5；

（6）洗脱液：10mM Tris-HCI pH 8.5；

（7）DNA吸附柱。

本发明还提供了一种利用所述试剂盒快速提取植物DNA的方法，依次包括以下步骤：

（1）植物组织样品的前处理：称取0.5g植物组织样品，用液氮研磨成粉末；

（2）DNA的游离与杂蛋白的抽除：将样品粉末装入2ml的离心管中，加入800μl 裂解液破碎细胞，振荡器震荡30秒后，在65°C水浴锅中温育30分钟，每5分钟震荡一次，温育结束后加入800μl抽提液去除大部分杂蛋白，震荡30秒后，12000rpm/min 离心10分钟，将上清移至新的离心管中；

（3）DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在含有上清的离心管中加入等体积的沉淀剂，混匀后加入到DNA吸附柱中，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl去蛋白液除去剩余的蛋白，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl漂洗液洗去其他杂质，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，再次加入500μl漂洗液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，然后12000rpm/min 离心2分钟，静置吹干；

（4）DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入30μl洗脱液，12000rpm/min 离心2分钟，收集液体。

其中所述DNA吸附柱为硅胶膜DNA离心吸附柱，购自北京天恩泽公司。

本发明的显著优点：

                      1.   能够快速提取植物组织DNA。

           2.   所得的DNA完整性好、纯度高。

附图说明

图1为利用本方法提取的植物的基因组DNA电泳检测图，泳道1是利用本方法提取水稻DNA的结果图，泳道2是利用本方法提取甘蔗DNA的结果图，泳道3是利用本方法提取花生DNA的结果图，泳道4是利用本方法提取玉米DNA的结果图，泳道5是利用本方法提取小麦DNA的结果图，泳道6是DNA mark。

具体实施方式

一种利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒及方法，具体步骤如下：

（1）原料：分别称取水稻、甘蔗、玉米、花生、小麦五种植物样本各1g。

（2）植物组织样品的前处理：将称取的水稻、甘蔗、玉米、花生、小麦组织用液氮研磨成粉末。

（3）DNA的游离与杂蛋白的抽除：将样品粉末装入2ml的离心管中，加入800μl 裂解液，振荡器震荡30秒后，在65°C水浴锅中温育30分钟，每5分钟震荡一次。温育结束后加入800μl抽提液，震荡30秒后，12000rpm/min 离心10分钟。将上清移至新的离心管中。

（4）DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在含有上清的离心管中加入等体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl去蛋白液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl漂洗液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl漂洗液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，12000rpm/min 离心2分钟，静置吹干。

（5）DNA洗脱：往吸附柱中加入30μl洗脱液，12000rpm/min 离心2分钟，所得液体为植物基因组DNA。取5μl DNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。如图1所示，利用该试剂盒能快速地获得到植物的基因组DNA。

（6）将获得的基因组DNA样品通过紫外分光光度计测定OD(260：280)比值，通过测定结果显示通过此方法获得的基因组DNA具有较高的纯度。

表1：不同植物样本基因组DNA的OD(260：280)比值

试剂的配方如下：

裂解液：0.1M Tris-Hcl PH 8.0、0.025M EDTA PH 8.0、8.775% Nacl、3%CTAB、2%巯基乙醇；

抽提液：氯仿；

沉淀剂：70%乙醇；

去蛋白液：5M盐酸胍，20 mM Tris-HCI，pH6.6，使用前加入乙醇，乙醇浓度为38％；

漂洗液：20mM NaCL，2mM Tris-HCI，pH7.5；

洗脱液：10mM Tris-HCI，pH 8.5。

Claims (2)

1.一种利用DNA吸附柱快速提取植物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成包括：

（1）裂解液：0.1M Tris-HCl pH 8.0，0.025M EDTA pH 8.0，8-9%重量比 NaCl，3%重量比CTAB，2%重量比巯基乙醇；

（2）抽提液：氯仿；

（3）沉淀剂：70%重量比乙醇；

（4）去蛋白液：5M盐酸胍，20 mM Tris-HCI pH6.6，使用前加入乙醇，使乙醇浓度为38％；

（5）漂洗液：20mM NaCL，2mM Tris-HCI pH7.5；

（6）洗脱液：10mM Tris-HCI pH 8.5；

（7）DNA吸附柱。

2.一种利用权利要求1所述试剂盒快速提取植物DNA的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

（1）植物组织样品的前处理：称取0.5g植物组织样品，用液氮研磨成粉末；

（2）DNA的游离与杂蛋白的抽除：将样品粉末装入2ml的离心管中，加入800μl 裂解液，振荡器震荡30秒后，在65°C水浴锅中温育30分钟，每5分钟震荡一次，温育结束后加入800μl抽提液，震荡30秒后，12000rpm/min 离心10分钟，将上清移至新的离心管中；

（3）DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在含有上清的离心管中加入等体积的沉淀剂，混匀后加入到DNA吸附柱中，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl去蛋白液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，加入500μl漂洗液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，再次加入500μl漂洗液，12000rpm/min 离心1分钟，弃废液，然后12000rpm/min 离心2分钟，静置吹干；

（4）DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入30μl洗脱液，12000rpm/min 离心2分钟，收集液体。