CN109055352B - 一种中药植物基因组dna提取试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药植物基因组DNA提取试剂盒，其包括:沉淀液：1‑5％CTAB，1‑4％PVP‑40，8‑12mmol/L EDTA，1‑10％β‑巯基乙醇，80‑120mmol/L Tris‑HCl，pH＝8.0；或其浓缩液第一缓冲液：0.5‑2.5％SDS，80‑120mmol/L Tris‑HCl，400‑600mmol/L NaCl，0.5‑2.5％PVP，40‑60mmol/L EDTA‑Na2，pH＝8.0；或其浓缩液第二缓冲液：Proteinase K15‑25mg/mL，RNA酶溶液5‑15mg/mL；或其浓缩液。本发明的中药植物基因组DNA提取试剂盒及相应的提取方法可以提取植物类中药包括种子以及组织，用白及、天麻、半夏、麦冬、降香、大腹皮以及石斛等难提植物的DNA提取效果都比较优佳，基因组的纯度高、杂质少、提取效率高。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中DNA提取技术技术领域，具体涉及一种中药植物基因组DNA提取试剂盒及其应用。
背景技术
中医中药博大精深，其具有广泛的用途，而市场上收购来的中药中，药材由于采收时误混，或者人为掺伪导致出现“方灵药不灵”，甚至由于药材的不纯导致威胁人的生命的现象发生。很多中药外形相似，但药性差异巨大，例如“关木通误当木通服用，致急性肾功能衰竭；土三七误当三七服用，致严重肝毒性”。因此，中药材的检测一直是生药学研究的核心问题，药材的真伪不仅关乎治疗效果，而且关系到临床用药的疗效与安全性，如何准确有效地鉴别中药材真伪是中药研究的根本性问题。
植物类中药是中医药的重要组成部分，根据第三次全国中药资源普查结果，我国药用植物有11146种。DNA是基本遗传物质，是遗传信息的载体。一定数量及高质量的DNA样品是进行限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的基础。因此，如何获取高质高量的DNA显得极为重要。植物细胞有细胞壁，其含有较多的多糖、多酚、酯类等次生代谢产物。不同植物中次生代谢产物的种类和含量差异很大，有时同种植物不同器官或组织的次生代谢产物的种类和含量也不一样，导致获取高质量的DNA有一定的难度。
目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法，但由于植物材料在化学成分、组织结构等方面有差异，提取效果时常欠佳，在使用上受到一定的限制，因此迫切需要一种简便、高效、经济且通用性较好的植物DNA提取试剂盒及提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药植物基因组DNA提取试剂盒及相应的提取方法，用以解决现有提取试剂盒提取效率低，提取的基因组质量低，纯度差，杂质多的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种中药植物基因组DNA提取试剂盒，所述提取试剂盒包括:
沉淀液：1-5％CTAB，1-4％PVP-40，8-12mmol/L EDTA，1-10％β-巯基乙醇，80-120mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；或其浓缩液
第一缓冲液：0.5-2.5％SDS，80-120mmol/L Tris-HCl，400-600mmol/L NaCl，0.5-2.5％PVP，40-60mmol/L EDTA-Na2，pH＝8.0；或其浓缩液
第二缓冲液：Proteinase K 15-25mg/mL，RNA酶溶液5-15mg/mL；或其浓缩液
第三缓冲液：2-6mmol/L醋酸钾，pH＝6.7；或其浓缩液
第四缓冲液：80-90％无水乙醇，0.2-0.5mmol/L醋酸钠，pH＝5.2；或其浓缩液
洗脱缓冲液：5-25mmol/L Tris-HCl，0.5-2mmol/LEDTA-Na2，pH＝8.0；或其浓缩液。
优选的，所述试剂盒还包括：漂洗液，其配置为60-80％乙醇。
优选的，所述沉淀液配置：2.5％CTAB，2.5％PVP-40，10mmol/L EDTA， 5％β-巯基乙醇，100mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；或其浓缩液。
优选的，所述第一缓冲液配置为：0.5-2.5％SDS，80-120mmol/L Tris-HCl，400-600mmol/L NaCl，0.5-2.5％PVP，40-60mmol/L EDTA-Na2，pH＝8.0；或其浓缩液。
优选的，所述第三缓冲液配置为3mmol/L醋酸钾，pH＝6.7；或其浓缩液。
优选的，所述第四缓冲液配置为85％无水乙醇，0.3mmol/L醋酸钠，pH ＝5.2；或其浓缩液。
本发明提供的所述的试剂盒在提取中药植物基因组中的应用。
本发明还提供一种提取中药植物基因组的方法，其包括以下步骤：
步骤A：取干燥的中药植物，粉碎的粉末并过60目筛；
步骤B：按照重量体积比加入1：5-20的权利要求1-6任一项所述试剂盒的沉淀液；
步骤C：振荡混匀，60-70℃水浴15-25min，离心弃上清，将沉淀加入沉淀液振荡混匀，60-70℃水浴8-15min，离心，弃上清；
步骤D：将沉淀加入第一缓冲液和第二缓冲液振荡混匀，60-70℃水浴 8-15min；
步骤F：加入第三缓冲液，冰浴3-10min，离心取上清；
步骤G：将上清加入第四缓冲液混匀，加入吸附柱，离心，弃滤液；
步骤F：用漂洗液对吸附柱漂洗，离心，弃滤液；
步骤G：用洗脱缓冲液洗脱吸附柱，离心，收集含有基因组的溶液，
若所述沉淀液、第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液、第四缓冲液以及洗脱缓冲液为其浓缩液时，稀释至工作浓度使用。
本发明具有如下优点：
本发明的中药植物基因组DNA提取试剂盒及相应的提取方法可以提取植物类中药包括种子以及组织，用白及、天麻、半夏、麦冬、降香、大腹皮以及石斛等难提植物的DNA提取效果都比较优佳，基因组的纯度高、杂质少、提取效率高。
附图说明
以上所述是对本发明技术方案的概述，为进一步解释本发明，以下结合附图与实施方式对本发明做进一步的详细说明。
图1为本发明的本发明的中药植物基因组提取方法对14白及样本的基因组电泳结果图。
图2为本发明的本发明的中药植物基因组提取方法对14白及样本的基因组PCR验证的电泳结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下面将更详细地描述本发明的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明中，涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定除外，是指溶液100ml含有溶质的质量数；液体之间的百分比，是指20℃时容量比。
实施例1本发明的方法提取中药植物基因组的过程
1、选取无霉变的待测干燥药材标本1g，置于粉碎机中研磨粉碎成粉末并过60目筛。
2、取0.02g粉末置于2.0mL的微量离心管中，加入沉淀液(2％CTAB， 2％PVP-40，100mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，10mmol/L EDTA，β-巯基乙醇10 μl)1000μl，用于有效去除多糖多酚多脂等成分以及保护DNA，减少降解率。充分震荡混匀，65℃水浴保温20min(中间震荡混匀3次)；1200rpm/min离心10min，弃上层清液；沉淀加入1000μl沉淀液，充分震荡混匀；65℃水浴保温10min，1200rpm/min离心10min，弃上层清液；重复此步骤；
3、将沉淀加入600μL第一缓冲液(2％SDS、100mmol/L Tris-HCl，pH＝ 8.0、500mmol/L NaCl、50mmol/L EDTA-Na2，pH＝8.0、2％PVP)
和第二缓冲液7.5μL 20mg/mL Proteinase K和6μL 10mg/mL RNA酶溶液，涡漩振荡，充分混匀帮助裂解。第二缓冲液用于消化细胞膜细胞壁的蛋白，提高细胞破碎率，使DNA充分释放出来。65℃水浴加热10分钟，在水浴过程中颠倒离心管2-3次，混合样本。
5、加入195μL第三缓冲液(5M醋酸钾，pH＝6.7)，用于沉淀蛋白等杂质，PH值在此时，沉淀蛋白等杂质效果最好，充分混匀，冰浴冷却5分钟， 14000rpm离心10分钟，取上清。
6、小心吸取上清液到一新的离心管中，加入1.5倍体积的第四缓冲液(90％无水乙醇，10％的0.3mmol/L醋酸钠，pH＝5.2)，立即混匀。将混合物(包括可能出现的沉淀)加入吸附柱，13000rpm离心1分钟，弃滤液。
7、加入700μL漂洗液(75％乙醇)，12000rpm离心30秒，弃滤液。再加入漂洗液700μL，12000rpm离心30秒，弃去过滤液。
8、将吸附柱放回空收集管，再13000rpm离心2分钟。取出吸附柱，放入一新的干净离心管中，加入100μL洗脱缓冲液(10mmol/LTris-HCl、1mmol/L EDTA-Na2，pH 8.0)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1min，将得到的溶液重新加入原吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，取上步收集的含基因组的溶液-20℃保存。
按照实施1的方法提取的白及、天麻、半夏、麦冬、降香以及大腹皮基因组的检测结果。
表一不同的中药植物提取基因组的检测结果：
表二：本发明的试剂盒对川贝母五个样本进行提取试验，每个样本重复10次，每次的样本量为20mg，其提取的基因组的结果如下：
表三：现有的基因组提取试剂盒提取的基因组的结果
| 试剂盒 | Sample Name | Sample Type | 260/280 | Concentration(ng/ul) | 样本量 |
| 厂家1 | 川贝母1 | dsDNA | 1.51972 | 10.51786 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母1 | dsDNA | 1.74663 | 10.01742 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母1 | dsDNA | 1.67875 | 14.64479 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母2 | dsDNA | 1.56802 | 2.26815 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母2 | dsDNA | 1.43137 | 3.37084 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母2 | dsDNA | 1.7508 | 2.37491 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母3 | dsDNA | 1.56632 | 10.13594 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母3 | dsDNA | 1.54895 | 11.54217 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母3 | dsDNA | 1.55474 | 12.24556 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母4 | dsDNA | 1.63748 | 16.61822 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母4 | dsDNA | 1.6643 | 18.69904 | 20mg |
| 厂家1 | 川贝母4 | dsDNA | 1.60984 | 11.29943 | 20mg |
| 厂家2 | 川贝母1 | dsDNA | 2.20731 | 3.2731 | 20mg |
| 厂家2 | 川贝母1 | dsDNA | 1.98943 | 3.91345 | 20mg |
| 厂家2 | 川贝母2 | dsDNA | 1.61953 | 4.48875 | 20mg |
| 厂家2 | 川贝母2 | dsDNA | 2.05685 | 4.38516 | 20mg |
| 厂家3 | 川贝母1 | dsDNA | 2.07882 | 72.77133 | 100mg |
| 厂家3 | 川贝母1 | dsDNA | 2.11521 | 89.3159 | 100mg |
| 厂家3 | 川贝母2 | dsDNA | 1.94148 | 45.93049 | 100mg |
| 厂家3 | 川贝母2 | dsDNA | 1.96971 | 63.37844 | 100mg |
通过表二和表三的对比结果，可知本发明提取的中药植物基因组纯度和浓度都比现有的提取试剂盒效果好。
表四：本发明的中药植物基因组的提取方法与现有的现有的CTAB方法比较
表四说明，本发明的植物基因组的提取方法，其提取速度快，提取的基因组的浓度和纯度高。
利用本发明中药植物基因组提取方法分别取新鲜白及14个样本，每个样本各取100mg，提取结果见表五。
表五本发明的中药植物基因组提取方法对白及14个样本进行提取的结果：
| 样本编号 | 样本类型 | 浓度(ng/L) | 260/280 |
| BJ-01 | 新鲜组织 | 147.35552 | 2.0201 |
| BJ-02 | 新鲜组织 | 125.0215 | 2.02964 |
| BJ-03 | 新鲜组织 | 40.76604 | 2.16949 |
| BJ-04 | 新鲜组织 | 88.75207 | 2.10469 |
| BJ-05 | 新鲜组织 | 72.05675 | 2.05416 |
| BJ-06 | 新鲜组织 | 86.91094 | 2.11617 |
| BJ-07 | 新鲜组织 | 63.77234 | 2.11974 |
| BJ-08 | 新鲜组织 | 60.32483 | 1.87761 |
| BJ-09 | 新鲜组织 | 58.58767 | 2.09689 |
| BJ-10 | 新鲜组织 | 171.43953 | 2.07105 |
| BJ-11 | 新鲜组织 | 118.43112 | 2.07663 |
| BJ-12 | 新鲜组织 | 85.98256 | 2.10823 |
| BJ-13 | 新鲜组织 | 106.32427 | 2.01449 |
| BJ-14 | 新鲜组织 | 240.38904 | 2.09041 |
如图1所示，本发明的本发明的中药植物基因组提取方法对14个白及样本的基因组电泳结果图，经验证提取的14个样本的基因组，浓度和纯度都较高。
如图2所示，本发明的本发明的中药植物基因组提取方法对14白及样本的基因组PCR验证的电泳结果，结果表面提取的基因组的纯度很高。
表六：白及样本的基因组PCR验证引物
表七：PCR程序
配制1.5％的琼脂糖凝胶(胶中已加入核酸凝胶染色剂Gel Red)；将供试品与对照正品药材PCR扩增产物5μL、溴酚蓝指示剂1μL混合。DNA分子量标记上样量均为6μL(亮带150ng；其他75ng)。150V恒压电泳，待溴酚蓝指示条带电泳至凝胶2/3处，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。
实施例2本发明的试剂盒的组成
配制一
沉淀液：1％CTAB，1％PVP-40，8mmol/L EDTA，1％β-巯基乙醇，80 mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；
第一缓冲液：0.5％SDS，80mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，0.5％PVP，40mmol/L EDTA-Na2，pH＝8.0；
第二缓冲液：Proteinase K 15mg/mL，RNA酶溶液5mg/mL；
第三缓冲液：2mmol/L醋酸钾，pH＝6.7；
第四缓冲液：80％无水乙醇，0.2mmol/L醋酸钠，pH＝5.2；
洗脱缓冲液：5mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/LEDTA-Na2，pH＝8.0。
配制二
沉淀液：5％CTAB，4％PVP-40，12mmol/L EDTA，10％β-巯基乙醇， 80-120mmol/LTris-HCl，pH＝8.0；
第一缓冲液：2.5％SDS，120mmol/L Tris-HCl，600mmol/L NaCl，2.5％PVP，60mmol/L EDTA-Na2，pH＝8.0；
第二缓冲液：Proteinase K 25mg/mL，RNA酶溶液15mg/mL；
第三缓冲液：2-6mmol/L醋酸钾，pH＝6.7；或其浓缩液
第四缓冲液：90％无水乙醇，0.5mmol/L醋酸钠，pH＝5.2；
洗脱缓冲液：25mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA-Na2，pH＝8.0。
配制三
沉淀液：3％CTAB，3％PVP-40，10mmol/L EDTA，5％β-巯基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；
第一缓冲液：1％SDS，100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，1.5％PVP， 50mmol/L EDTA-Na2，pH＝8.0；
第二缓冲液：Proteinase K 20mg/mL，RNA酶溶液10mg/mL；
第三缓冲液：2-6mmol/L醋酸钾，pH＝6.7；或其浓缩液
第四缓冲液：85％无水乙醇，0.3mmol/L醋酸钠，pH＝5.2；
洗脱缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，1.5mmol/LEDTA-Na2，pH＝8.0。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种中药植物基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂盒包括：
沉淀液：2% CTAB，2% PVP-40， 10 mmol/L EDTA，1%β-巯基乙醇，pH＝8.0 的100 mmol/L Tris-HCl；
第一缓冲液：2% SDS，pH =8.0的100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，2% PVP， pH =8.0的50 mmol/L EDTA-Na2；
第二缓冲液：7.5μl的20mg/mL Proteinase K，6μl的10mg/mL RNA酶溶液；
第三缓冲液：5mol/L 醋酸钾，pH =6.7；
第四缓冲液：90%无水乙醇，10%的0.3 mmol/L醋酸钠，pH =5.2；洗脱缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA-Na2，pH= 8.0；
所述试剂盒还包括：漂洗液，其配置为75%乙醇。
2.权利要求1所述的中药植物基因组DNA提取试剂盒在提取中药植物基因组中的应用。
3.一种提取中药植物基因组DNA的方法，其包括以下步骤：
步骤A：取干燥的中药植物，粉碎成粉末并过60目筛；
步骤B：按照重量体积比加入1：5-20的权利要求1所述中药植物基因组DNA提取试剂盒的沉淀液；
步骤C：振荡混匀，60-70℃水浴15-25min，离心弃上清，将沉淀加入沉淀液振荡混匀，60-70℃水浴8-15min，离心，弃上清；
步骤D：将沉淀加入第一缓冲液和第二缓冲液振荡混匀，60-70℃水浴8-15min；
步骤F：加入第三缓冲液，冰浴3-10min，离心取上清；
步骤G：将上清加入第四缓冲液混匀，加入吸附柱，离心，弃滤液；
步骤F：用漂洗液对吸附柱漂洗，离心，弃滤液；
步骤G：用洗脱缓冲液洗脱吸附柱，离心，收集含有基因组的溶液；
其中，
第一缓冲液：2% SDS，pH =8.0的100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，2% PVP， pH =8.0的50 mmol/L EDTA-Na2；
第二缓冲液：7.5μl的20mg/mL Proteinase K，6μl的10mg/mL RNA酶溶液；
第三缓冲液：5mol/L 醋酸钾，pH =6.7；
第四缓冲液：90%无水乙醇，10%的0.3 mmol/L醋酸钠，pH =5.2；洗脱缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA-Na2，pH= 8.0；
若所述沉淀液、第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液、第四缓冲液以及洗脱缓冲液为其浓缩液时，稀释至工作浓度使用。
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