CN105543373B

CN105543373B - 乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法

Info

Publication number: CN105543373B
Application number: CN201610036218.1A
Authority: CN
Inventors: 叶敏; 宋玮; 冯金; 季帅; 乔雪; 王瑛
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2016-01-20
Filing date: 2016-01-20
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2036-01-20
Also published as: CN105543373A

Abstract

本发明公开了一种乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草及其杂交品种的快速鉴定方法，包括如下步骤：1）提取样品DNA；2）用甘草ITS特异性引物扩增样品ITS序列；3）确定ITS序列5’端起第159位和第383‑385位的碱基：如果159位为C，383‑385位为TGC，则鉴定为乌拉尔甘草；如果159位为C和T共存，383‑385位为TGC和CAA共存，则鉴定为杂交品种；如果159位为T，383‑385位为CAA，则进行步骤4）；4）PCR扩增样品的ndhC‑trnV转录间隔区序列；5）确定ndhC‑trnV转录间隔区序列5’端起第487位的碱基：如果487位为A，则鉴定为光果甘草；如果487位碱基为T，则鉴定为胀果甘草。本发明能够对甘草的原植物、药材、种子和种苗等进行准确鉴定，有效解决甘草的品种鉴定、育种栽培以及种质资源开发利用等问题。

Description

乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法

技术领域

本发明属于中药材品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草以及乌拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交后产生的样本进行准确鉴定和区分。

背景技术

甘草作为最广泛使用的药用植物之一，在中国、美国、英国、欧洲、日本药典中均有收载。2015版《中国药典》同时收载乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(G. glabra L.)、胀果甘草(G. inflata Bat.)的干燥根和根茎作为甘草药材的来源，我国主产品种为乌拉尔甘草。但不同品种的甘草在不同国家和地区的分布具有差异，例如，在美国和欧洲部分地区，光果甘草是最主要的药用品种。

甘草的传统形态学鉴定方法主要依赖于植物的地上部分特征，难以对甘草药材、饮片以及各种加工品进行品种鉴定。显微鉴定方面，药材横切面的射线形态虽可作为甘草品种区分的依据之一，但存在样品前处理困难、判别标准难以量化等问题，也无法对深加工的药材饮片或粉末进行鉴定。化学成分方面，甘草的成分十分复杂，通过药材指纹图谱分析也较难实现同属植物不同种的准确区分和鉴定。

DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种生物身份识别系统，从而实现对物种的快速准确鉴定。Kenji等曾对不同品种甘草的ITS序列进行扩增和分析比对，发现胀果甘草和光果甘草的ITS序列完全相同，同时与乌拉尔甘草的ITS序列在4个碱基位点存在差异（Biol. Pharm. Bull. 2007, 30, 1497—1502）。因此， ITS序列中的SNP（single nucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性）位点可用于乌拉尔甘草的鉴定。但文献（J. Nat. Prod.,2015, 78, 2007–2022）及本研究团队的实验结果（图1）均表明，在进行甘草样品的ITS序列扩增时，Kenji等所使用的ITS通用引物ITS4/5的扩增成功率和扩增效率较低，因此尚需通过设计甘草ITS专属引物来提高PCR的准确性。此外，胀果甘草和光果甘草尚无较好的分子鉴定方法。Kenji等筛选了叶绿体基因中的4个不同片段，仅trnH-psbA转录间隔区序列仅能对大约80%的胀果甘草和光果甘草进行区分，仍有20%左右的样品无法通过目前已知的SNP位点进行区分和鉴定（Biol. Pharm. Bull. 2007, 30, 1497—1502）。因此，对于三个重要的甘草药用品种，目前尚缺乏准确、高效的分子鉴定方法。

本发明设计了用于甘草ITS序列扩增的特异性引物，继而对甘草中多个叶绿体DNA片段进行了扩增和筛选，最终将甘草ITS序列和ndhC-trnV转录间隔区序列的SNP位点相结合，建立了对乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草三个近缘物种及其杂交品种进行快速品种鉴定的方法，有利于实现甘草的种苗培育、药材和饮片生产的规范化。

发明内容

本发明第一个目的在于提供乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的鉴定用SNP标记。

本发明第二个目的在于提供甘草鉴定用SNP标记在不同品种甘草鉴定中的应用。

本发明第三个目的在于提供不同品种甘草的快速分子鉴定方法和流程。

本发明提供的乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种的鉴定用SNP位点，其核苷酸序列如SEQ ID No.1/2（ITS序列）和SEQ ID No.3/4（ndhC-trnV转录间隔区序列）所示，自ITS序列的5’端起第159位为C或T，第383-385位为TGC或CAA；自ndhC-trnV转录间隔区序列的5’端起第487位为A或T。

本发明提供的SNP位点可用于鉴定乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种：如果ITS序列5’端起第159位为C，且第383-385位为TGC，则鉴定为乌拉尔甘草；如果ITS序列5’端起第159位为T，第383-385位为CAA，且ndhC-trnV转录间隔区序列5’端起第487位为A，则鉴定为光果甘草；如果ITS序列5’端起第159位为T，第383-385位为CAA，且ndhC-trnV转录间隔区序列5’端起第487位为T，则鉴定为胀果甘草。如果ITS序列5’端起第159位同时存在C和T，383-385位同时存在TGC和CAA，则鉴定为乌拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交后产生的杂交品种。

本发明提供的乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的鉴定方法，包括以下步骤：

1）以合适的方法提取样品DNA；

2）以待测样品DNA为模板，通过PCR反应扩增ITS序列；

3）对扩增产物进行测序，确定ITS序列的5’端起第159位和第383-385位的碱基。共有三种可能情况：情况一，如果ITS序列的5’端起第159位碱基为C，383-385位的碱基为TGC，则样品鉴定为乌拉尔甘草，鉴定结束；情况二，如果ITS序列的5’端起第159位碱基为C和T共存，383-385位的碱基为TGC和CAA共存，则样品鉴定为杂交品种，鉴定结束；情况三，如果ITS序列的5’端起第159位碱基为T，383-385位的碱基为CAA，则进行步骤4）；

4）以待测样品DNA为模板，通过PCR反应扩增ndhC-trnV转录间隔区序列；

5）对扩增产物进行测序，确定ndhC-trnV转录间隔区序列的5’端起第487位的碱基。测序结果共有两种可能情况：情况一，如果ndhC-trnV转录间隔区序列的5’端起第487位碱基为A，则样品鉴定为光果甘草，鉴定结束；情况二，如果5’端起第487位碱基为T，则样品鉴定为胀果甘草，鉴定结束。

通过以上五个步骤，可实现乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种的区分和鉴定。其中，杂交品种特指乌拉尔甘草与胀果甘草杂交后形成的后代，或乌拉尔甘草与光果甘草杂交后形成的后代。

本发明的独创性在于，一是设计了甘草ITS序列特异性引物，用于甘草属植物ITS序列的高效扩增；二是首次发现叶绿体DNA中位于ndhC-trnV转录间隔区的一个全新SNP位点，可用于胀果甘草和光果甘草的区分。将ITS序列与ndhC-trnV转录间隔区序列相结合，可进行三个品种的准确鉴定。

附图说明

图1中a为使用ITS通用引物（ITS 4/5）对甘草ITS序列进行扩增后的电泳结果，图1中b为使用本发明所设计的甘草ITS特异性引物对甘草ITS序列进行扩增后的电泳结果。对比可见，通用引物ITS4/5对甘草ITS序列的扩增错误率高（图1，a），而甘草ITS特异性引物可显著提高甘草ITS序列的扩增成功率和扩增效率（图1，b）。

图2为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的ITS序列的SNP碱基情况图。

图3为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的ITS序列比对结果。

图4为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的ndhC-trnV转录间隔区序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用以对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、野生甘草样本的品种鉴定。

1）从国内甘草的多个主要产区，收集野生甘草样本56份（均为干燥根），样品具体信息如表1所示。用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取样品的总DNA，具体步骤如下：

① 取药材粉末50mg于1.5mL EP管中，加入液氮和少量石英砂，用研磨棒充分研磨；

② 向研磨后的药材粉末中加入700μL65℃预热的缓冲液GP1(含0.5%巯基乙醇），迅速混匀，65℃水浴40min；

③ 加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5 min；

④ 将水相转入一新离心管中，加入700μL缓冲液GP2，混匀；

⑤ 将液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃去废液；

⑥ 向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白液GD，12000rpm离心30 s，弃废液；

⑦ 加入600μL漂洗液GW，12000rpm离心30 s，弃废液；

⑧重复步骤⑦；

⑨ 将吸附柱CB3放回废液收集管中，12000rpm离心2min，并将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底晾干残余的漂洗液；

⑩ 将吸附柱CB3转入一个新的离心管中，向吸附膜的中空部位悬空滴加50μLddH2O，室温下放置3 min，12000 rpm离心2min，得样品的总DNA溶液，-20°C储存备用。

2）PCR扩增

引物序列为：ITS-F, GAAGGATCATTGTCGATGCC; ITS-R, GCGTTCAAAGACGCCTATTGG;ndhC-trnV-F, AGACCATTCCAATGCCCCCTTTCGCC; ndhC-trnV-R, GTTCGAGTCCGTATAGCCCTA。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，并分别用无菌去离子水溶解并稀释至10 μM。

PCR反应体系：包含模板DNA 0.5 μL，正向及反向引物各1 μL，TransStart KDPlus DNA 聚合酶0.4 μL， TransStart KD Plus Buffer 4 μL，dNTPs (2.5 mM) 0.4 μL，加无菌去离子水补齐至20 μL。PCR反应程序：94°C预变性3 min，然后进行35个循环：94°C变性30 s，56°C复性30 s，68°C延伸1 min 15 s，循环结束后68°C延伸10 min，4°C保存。

PCR反应结束后，取反应产物5μL用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上进行检测（图1）。

3）测序

电泳检测后剩余的PCR反应产物直接由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，各样品均采用正向和反向测序，然后将正反向测序结果进行拼接，以保证测序的准确性。

4）序列比对

使用BioEdit和DNAMAN软件进行测序结果的分析和序列比对。在ITS序列中存在四个品种特异性SNP位点。乌拉尔甘草ITS序列的5’端起第159位为C，第383-385位为TGC；胀果甘草和光果甘草ITS序列的5’端起第159位为T，第383-385位为CAA；对于乌拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交后产生的样品，SNP位点则同时存在以上两种碱基（图2，3）。在ndhC-trnV序列中可获得一个品种特异性SNP位点，光果甘草的5’端起第487位碱基为A，胀果甘草的5’端起第487位碱基为T（图4）。以上来源于两段DNA条形码的五个SNP位点可特异性地用于乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和杂交品种的鉴定。

表1 野生甘草样本的品种鉴定

实施例2、甘草饮片的品种鉴定。

实验方法基本同实施例1，所不同的是样品由野生甘草样本换为市售甘草饮片，其中包括甘草饮片生品31批，炮制品（蜜炙）2批。将甘草饮片在液氮下研磨提取DNA，并进行PCR扩增和序列分析。甘草饮片信息和品种鉴定结果如表3所示。结果表明，该方法可对甘草商品饮片的来源品种进行区分和鉴定。在扩增得到的ITS序列中均可以检测到上述4个SNP位点，在ndhC-trnV转录间隔区可以检测到1个SNP位点。据此得到每批样品的鉴定结果。根据测定结果，我国市售甘草药材和饮片的原植物来源以乌拉尔甘草为主。

表2 甘草饮片的品种鉴定

实施例3、甘草种子及幼苗的品种鉴定。

实验方法基本同实施例1，所不同的是样品由甘草干燥根换为甘草种子和刚发芽的甘草幼苗。结果表明，该方法可对甘草种子及幼苗进行品种鉴定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110>北京大学

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<213>乌拉尔甘草ITS序列

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<212>DNA

<213>胀果甘草和光果甘草ITS序列

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<212>DNA

<213>乌拉尔甘草和光果甘草ndhC-trnV转录间隔区序列

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TTAGGATAAGCACGAAGATCAAAGCTTCTATAAATACGGATACCCCCAATACATCAAAACTCATTGCCCATGGGTAAAGAAAAACCGTTTCAACATCAAAAACAACAAAAACTAGAGCAAACATATAATAACGGATTTGAAATTGTAACCAAGCATCACCTATTGGTTCTATTCCGGATTCATAACTCGAAAGTTTTTCTGGCCCTTTGCTAATCGGAGCTAAAATTCCAGAAATTAGAAATGCCAAAATTGGAATAAAGATCGATATTATTAGAAATGCCCAAAAAATATCATATTCATAAAGCAAAAACATAAATGTACTCCTATGAATGTGGAAAAGATATCGAATTAGTATTAATTCTTAGTCGATTTGAATGGAAATTCAATTCAAATTATTAGATTCATATTCATTAATCTAAATAGAAATGCTTTGTATTAAGTTTACATTATTTCTACAAAAATTGAGACTAGTATACGAGTATACTTATATTAATCTTATTCTATCGAATAGTAATATATTTTAATATTCAAATAGAATTTTATTTATTCTTTCTACTACTACTAAAAGTATTTATACTAGTAGTATTACTAATATTTATAGTAGTACTATTACTAATAGTATTAGTAATATGGAGTATTTACTAGTATATAGTACTATATAGATTATATATAGTACTATATACTAGTAAACTAAATATAAGATATTAGTAATATAAGATATTATTAACGATTAGATACTAAATAGGAGTAGTATCCGTAGGAATATTAGG

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<212>DNA

<213>胀果甘草ndhC-trnV转录间隔区序列

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TTAGGATAAGCACGAAGATCAAAGCTTCTATAAATACGGATACCCCCAATACATCAAAACTCATTGCCCATGGGTAAAGAAAAACCGTTTCAACATCAAAAACAACAAAAACTAGAGCAAACATATAATAACGGATTTGAAATTGTAACCAAGCATCACCTATTGGTTCTATTCCGGATTCATAACTCGAAAGTTTTTCTGGCCCTTTGCTAATCGGAGCTAAAATTCCAGAAATTAGAAATGCCAAAATTGGAATAAAGATCGATATTATTAGAAATGCCCAAAAAATATCATATTCATAAAGCAAAAACATAAATGTACTCCTATGAATGTGGAAAAGATATCGAATTAGTATTAATTCTTAGTCGATTTGAATGGAAATTCAATTCAAATTATTAGATTCATATTCATTAATCTAAATAGAAATGCTTTGTATTAAGTTTACATTATTTCTACAAAAATTGAGACTAGTATACGAGTATACTTTTATTAATCTTATTCTATCGAATAGTAATATATTTTAATATTCAAATAGAATTTTATTTATTCTTTCTACTACTACTAAAAGTATTTATACTAGTAGTATTACTAATATTTATAGTAGTACTATTACTAATAGTATTAGTAATATGGAGTATTTACTAGTATATAGTACTATATAGATTATATATAGTACTATATACTAGTAAACTAAATATAAGATATTAGTAATATAAGATATTATTAACGATTAGATACTAAATAGGAGTAGTATCCGTAGGAATATTAGG

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GAAGGATCATTGTCGATGCC

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GTTCGAGTCCGTATAGCCCTA

Claims

1. ndhC-trnV转录间隔区序列中的SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）位点在鉴定胀果甘草、光果甘草中的应用，其特征在于：在ITS序列自5’端起第159位为T且第383-385位为CAA的前提下，ndhC-trnV转录间隔区序列自5’端起第487位为A时样品鉴定为光果甘草，自5’端起第487位为T时样品鉴定为胀果甘草；其中所述ITS序列为SEQID No.1/2、所述ndhC-trnV转录间隔区序列为SEQ ID No.3/4。

2.ndhC-trnV转录间隔区序列中的SNP位点在鉴定乌拉尔甘草与胀果甘草的杂交样品中的应用，其特征在于：在ITS序列自5’端起第159位为T和C共存，且第383-385位为CAA和TGC共存的前提下，ndhC-trnV转录间隔区序列自5’端起第487位为T时，样品鉴定为乌拉尔甘草与胀果甘草的杂交样品；其中所述ITS序列为SEQ ID No.1/2、所述ndhC-trnV转录间隔区序列为SEQ ID No.3/4。

3.胀果甘草、光果甘草、乌拉尔甘草与胀果甘草的杂交样品的鉴定方法，包括以下步骤：

1)以合适的方法提取待测样品DNA；

2)以待测样品DNA为模板，通过PCR扩增ITS序列和ndhC-trnV转录间隔区序列，其中所述ITS序列为SEQ ID No.1/2、所述ndhC-trnV转录间隔区序列为SEQ ID No.3/4；

3)对两段扩增产物分别进行测序分析：当ITS序列自5’端起第159位为T、第383-385位CAA，且ndhC-trnV转录间隔区序列自5’端起第487位碱基为A时，样品鉴定为光果甘草，鉴定结束；当ITS序列自5’端起第159位为T、第383-385位CAA，且ndhC-trnV转录间隔区序列自5’端起第487位碱基为T时，样品鉴定为胀果甘草，鉴定结束；当ITS序列自5’端起第159位为T和C共存、第383-385位CAA和TGC共存，且ndhC-trnV转录间隔区序列自5’端起第487位为T时，样品鉴定为乌拉尔甘草与胀果甘草的杂交样品，鉴定结束。