CN112342314B - 一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的snp分子标记物及其方法与应用 - Google Patents
一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的snp分子标记物及其方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种鉴别内蒙古杭锦旗产甘草的SNP分子标记物其方法与应用，所述分子标记物包括20个SNP分子标记，所述20个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.20所示。本发明的鉴别内蒙古杭锦旗产甘草的SNP分子标记物及其方法与应用，采用基因组学技术，在甘草基因组层面获得SNP标记，能够快速准确确定所检测的甘草产地是否为内蒙古杭锦旗产地。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物及其方法与应用。
背景技术
甘草是一种大宗常用的中药材，其以根入药，味甘，平，有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。主治脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒等症，缓解药物毒性、烈性。甘草有“十方九草”一说，在中药各复方中出现最为频繁，主要为调和诸药的作用。甘草的主产区有内蒙古、新疆、甘肃、宁夏等地，东北地区也有少量分布。不同产地的甘草药材质量和功效存在差异，且不同产地甘草的种子、药材等价格存在显著差异。
甘草产地的鉴别一直是甘草物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。当前甘草产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强。
而对于甘草道地产区的内蒙古杭锦旗地区，如何将其生产的甘草与其他地区生产的甘草进行区分，是中药鉴别人员急需解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物及其方法与应用。
一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物，所述分子标记包括20个SNP分子标记，所述20个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.20所示。
进一步地，所述20个SNP位点的碱基如下所示。
一种利用内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物鉴别甘草产地的方法，所述方法包括以下步骤：
获取待测样本DNA；
对检测合格的待测样本DNA进行建库测序，获得样本DNA测序数据；
对所述样本DNA测序数据进行质控，获得样本DNA质控数据；
将所述样本DNA质控数据与参考序列进行比对、去重以及SNP检测得到待测样本SNP基因；
将相同染色体位置处的所述待测样本SNP基因与内蒙古杭锦旗产甘草的SNP分子标记进行比对，判断是否有19-20个所述待测样本SNP基因与所述内蒙古杭锦旗产甘草的SNP分子标记相同：
若有，则判断待测样本为内蒙古杭锦旗产地甘草；若没有则待测样本为非内蒙古杭锦旗产地甘草。
进一步地，所述样本DNA的测序采用高通量测序。
进一步地，所述对所述样本DNA测序数据进行质控包括：
对所述样本DNA测序数据的原始reads进行过滤；
所述过滤规则包括：
去掉接头序列；
去掉序列中N的数量小于等于序列长度2%的reads；
去掉测序质量低于20的碱基数量超过序列长度的40%的reads。
进一步地，所述将所述样本DNA质控数据与参考序列进行比对、去重后，进行SNP检测得到待测样本SNP基因包括：
以甘草在公共数据库中的基因组作为参考序列，利用比对软件进行序列比对，获得bam文件；
利用排序软件对所述bam文件进行排序，并移除重复序列；
利用基因分型软件处理排序去重之后的bam文件，获得待测样本初步SNP基因型；
利用“QUAL>100 && FS<10 && MQ>40”参数降低所述样本初步SNP基因型的错误率，得到所述待测样本SNP基因型。
本发明还包括一种利用上述SNP分子标记物在鉴别内蒙古杭锦旗产甘草中的应用。
本发明还包括一种含上述的SNP分子标记物的基因芯片或试剂盒。
本发明的鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物及其方法与应用，采用基因组学技术，在甘草基因组层面获得SNP标记，能够快速准确确定所检测的甘草产地是否为内蒙古杭锦旗产地。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书和权利要求书中所指出的结构来实现和获得。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
甘草SNP分子标记的获取：
1.DNA提取
本实验运用了mCTAB法（modified CTAB method）对甘草叶片材料进行了DNA提取。具体提取步骤如下：
(1) 取甘草新鲜植物叶片100 mg放入2.0 mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，将新鲜叶片浸入液氮中冻存1 min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状备用；
(2) 在研磨好的材料中加入1.5mL buffer A (0.1M Tris-HCl pH 8.0；5mMEDTA；0.25 M NaCl；1%PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，其间将沉淀下的粉末重新均质混合3~10次。10000×g离心后，弃掉上清液；
(3) 重复步骤(2)一次，在沉淀中加入800 μL预热的2% CTAB(0.1M Tris-HClpH8.0；1.4M NaCl；25mM EDTA；2%(w/v) CTAB；0.2%(v/v) β-巯基乙醇；1% PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65℃水浴锅中保存1.5-2h，其间要颠倒均质溶液2~8次；
(4) 10000×g室温离心后，将上清液小心倒入一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI（氯仿：异戊醇=24:1(v/v )）溶液，在颠倒摇床上混合10 min；
(5) 10000×g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI溶液，在颠倒摇床上混合10 min；
(6) 10000×g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的1.5 mL离心管中加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20℃冰箱保存1小时以上；
(7) 取出冰箱中的离心管，10000×g离心，弃去上清液，倒置于干燥纸上尽量控干液滴，加入100μL的RNase 溶液(100 mg/L)，37℃保存0.5 h；
(8) 在离心管中依次加入150μL ddH2O，50μL 5M NaCl和700μL无水乙醇，充分混合后10000×g离心，弃去上清，在纸上倒干；
(9) 加入600μL 70 %乙醇，弹底混合后离心，弃上清，重复一遍；
(10) 真空干燥掉乙醇，加100 μL TE溶解DNA，并根据Nanodrop测定将样本DNA浓度并稀释至50 ng/µL。
2.建库测序
将上步检测合格的DNA样本随机打断成350bp的片段，采用华大自研试剂盒进行建库。库检合格后，根据文库的有效浓度和实际产出需求进行BGI-SEQ高通量测序，获得DNA测序原始数据。DNA高通量测序可以采用任何高通量测序平台，除上述BGI-SEQ平台外，还可以采用Illumina，SOLiD，Pacbio，ONT（Oxford Nanopore Technologies）平台等。
3.测序数据质控
测序得到的原始reads包含接头序列，低质量和包含N的reads。为了保证信息分析质量，必须对原始reads进行过滤。过滤规则包括：
A．去掉接头序列；
B．去掉序列中N的数量小于等于序列长度2%的reads；
C．去掉测序质量（MQ）低于20的碱基数量超过序列长度的40%的reads。
4.序列比对
以甘草在NCBI公共数据库中的基因组作为参考序列，利用BWA软件进行序列比对，比对参数为mem-t8-M-R。比对获得的bam文件利用Samtools软件进行排序，并移除重复序列。
5.SNP检测
得到bam文件后，利用GATK软件获得个体的SNP基因型。为了降低SNP检测的错误率，采用以下参数对SNP进行筛选“QUAL>100 && FS<10 && MQ>40”。经过筛选分析后，获得与内蒙古杭锦旗片区甘草关联的SNP分子标记20个，如表1所示。
表1
6.筛选比对
检测各个待检测样本基于20个SNP位点的基因型。如果所有待测样本均满足如下20个位点的95%检测标准，待测样本为内蒙古杭锦旗片区甘草。即满足1-20个SNP位点中的任意19-20个，即为内蒙古杭锦旗片区甘草。
采用SNP分子标记进行内蒙古杭锦旗片区甘草鉴定：
实施例1
样本信息：分别采集（NMGC101，NMGC102，NMG201，NMGC202），新疆（XJGC101，XJGC102，XJGC201，XJGC202，XJGC301，XJGC302，XJGC303，XJGC401，XJGC402，XJGC403），甘肃（GSGC101，GSGC102，GSGC201，GSGC202）地区的甘草。样本的具体信息见表2。
鉴定步骤：
1. 样本DNA提取
运用了mCTAB法（modified CTAB method）对各样本甘草叶片材料进行了DNA提取。具体提取步骤如下：
(1) 取新鲜植物叶片100 mg放入2.0 mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，新鲜叶片浸入液氮中冻存1 min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状备用；
(2) 在研磨好的材料中加入1.5 mL buffer A (0.1 M Tris-HCl pH 8.0; 5 mMEDTA; 0.25 M NaCl; 1 % PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，其间将沉淀下的粉末重新均质混合几次。10000×g离心后，弃掉上清液；
(3) 重复步骤(2)一次，在沉淀中加入800 μL预热的2% CTAB(0.1 M Tris-HCl pH8.0; 1.4 M NaCl; 25 mM EDTA; 2 % (w/v) CTAB; 0.2 %, (v/v ) β-巯基乙醇； 1 %PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65 ℃ 水浴锅中保存1.5-2 h.其间要颠倒均质溶液若干次；
(4) 10000×g室温离心后，将上清液小心倒入一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI（氯仿：异戊醇=24:1(v/v )）溶液，在颠倒摇床上混合10 min；
(5) 10000×g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的2.0 mL离心管中，加入等体积CI溶液，在颠倒摇床上混合10 min；
(6) 10000×g离心后，以移液枪小心吸取上层水相清液至一个新的1.5 mL离心管中加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20 ℃冰箱保存1小时以上；
(7) 取出冰箱中的离心管，10000×g离心，弃去上清液，倒置于干燥纸上尽量控干液滴，加入100 μL的RNase 溶液(100 mg/L)，37 ℃保存0.5 h；
(8) 在离心管中依次加入150 μL ddH2O, 50 μL 5 M NaCl和700 μL无水乙醇，充分混合后10000×g离心，弃去上清，在纸上倒干；
(9) 加入600 μL 70 %乙醇，弹底混合后离心，弃上清，重复一遍；
(10) 真空干燥掉乙醇，加100 μL TE溶解DNA，并根据Nanodrop测定将样本DNA浓度并稀释至50 ng/µL。
2.样本建库测序
检测合格的DNA样本随机打断成350bp的片段，采用华大自研试剂盒进行建库。库检合格后，根据文库的有效浓度和实际产出需求进行BGI -SEQ高通量测序，获得DNA测序原始数据。DNA高通量测序可以采用任何高通量测序平台，除上述BGI-SEQ平台外，还可以采用Illumina,SOLiD, Pacbio，ONT（Oxford Nanopore Technologies）平台等。
3.测序数据质控
测序得到的原始reads包含接头序列，低质量和包含N的reads。为了保证信息分析质量，必须对原始reads进行过滤。过滤规则包括：
A．去掉接头序列；
B．去掉序列中N的数量小于等于序列长度2%的reads；
C．去掉测序质量（MQ）低于20的碱基数量超过序列长度的40%的reads。
4.样本序列比对。
以甘草在NCBI公共数据库中的基因组作为参考序列，利用BWA软件进行序列比对，比对参数为mem -t 8 -M -R。比对获得的bam文件利用Samtools软件进行排序，并移除重复序列。
5.SNP检测。
得到bam文件后，利用GATK软件获得个体的SNP基因型。为了降低SNP检测的错误率，我们用以下参数对SNP进行筛选”QUAL>100 && FS<10 && MQ>40”，获得各待检测样本的SNP位点。
6.筛选比对，得到内蒙古杭锦旗甘草特有的SNP
将内蒙古杭锦旗片区甘草与内蒙古其他片区甘草，新疆片区甘草，甘肃片区甘草的基因组SNP信息进行比对，筛选出仅在内蒙古杭锦旗甘草中出现的SNP，即为内蒙古杭锦旗甘草特有的SNP位点，与表1相同。
待测样本相同位置处的核苷酸与表1中SNP信息相比，低于19个核苷酸与表1中SNP信息不一致，待测甘草群体为候选的非内蒙古杭锦旗片区甘草。
实施例2
样本信息：分别采集内蒙古（NMGC103,NMGC203）、新疆（XJGC103,XJGC203）、甘肃（GSGC103, GSGC203）地区的甘草。样本的具体信息见表2。
表2 样本的具体信息
通过实施列1中表1 SNP位点来鉴定内蒙古杭锦旗片区甘草和其他地区甘草，参照实施例1中SNP位点信息获取方法，获取各样本在相同位置的SNP位点信息。
将各样本相同位置处的SNP基因与表1内蒙古杭锦旗甘草SNP基因进行对比，对比结果如表3所示。
表3 SNP基因型鉴定结果
注：M代表CA杂合子。单一一个A或C或G或T代表纯合子。
通过表3的鉴定结果可知，样本NMGC103和NMGC203基因与表1内蒙古杭锦旗甘草SNP基因完全相同，而其他样本相同基因个数低于19个，说明NMGC103和NMGC203样本为内蒙古杭锦旗产地，而其他样本为非内蒙古杭锦旗产地。
通过内蒙古杭锦旗片区甘草特有的20个SNP基因及应用该基因进行内蒙古杭锦旗甘草产地鉴定的方法，将本发明的内蒙古杭锦旗片区甘草20个SNP基因与待测甘草相同位置处的SNP基因进行对比，确定满足任意19-20个内蒙古杭锦旗片区甘草SNP位点的待测样本为内蒙古杭锦旗片区甘草。本发明的内蒙古杭锦旗产甘草鉴定方法简单快速，结果准确，能够有效鉴别非内蒙古杭锦旗产地的甘草。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国中药有限公司
深圳华大基因科技服务有限公司
国药种业有限公司
<120> 一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物及其方法与应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
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Claims (7)
1.一种鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物，其特征在于，所述分子标记物包括20个SNP分子标记，所述20个SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.20所示，用于鉴定内蒙古杭锦旗甘草的 20个SNP分子标记的碱基分别位于SEQ ID NO.1~SEQ IDNO.20序列的第6位置处，20个SNP位点的碱基如下所示：
2.一种利用权利要求1所述的鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记物鉴别甘草产地的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
获取待测样本DNA；
对检测合格的待测样本DNA进行建库测序，获得样本DNA测序数据；
对所述样本DNA测序数据进行质控，获得样本DNA质控数据；
以甘草在NCBI公共数据库中的基因组作为参考序列，将所述样本DNA质控数据与参考序列进行比对、去重后，进行SNP检测得到待测样本SNP基因；
将相同基因组位置处的所述待测样本SNP基因与所述鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记进行比对，判断是否有19-20个所述待测样品的SNP基因与所述鉴别内蒙古杭锦旗甘草的SNP分子标记相同：
若有，则判断待测样品为内蒙古杭锦旗产地甘草；若没有，则待测样本为非内蒙古杭锦旗产地甘草。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样本DNA的测序采用高通量测序。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对所述样本DNA测序数据进行质控包括：
对所述样本DNA测序数据的原始reads进行过滤；
所述过滤规则包括：
去掉接头序列；
去掉序列中N的数量小于等于序列长度2%的reads；
去掉测序质量低于20的碱基数量超过序列长度的40%的reads。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将所述样本DNA质控数据与参考序列进行比对、去重后，进行SNP检测得到待测样本SNP基因：
以甘草在NCBI公共数据库中的基因组作为参考序列，利用比对软件进行序列比对，获得bam文件；
利用排序软件对所述bam文件进行排序，并移除重复序列；
利用基因分型软件处理排序去重之后的bam文件，获得待测样本初步SNP基因型；
利用“QUAL>100 && FS<10 && MQ>40”参数降低所述样本初步SNP基因型的错误率，得到所述待测样本SNP基因型。
6.一种利用权利要求1的SNP分子标记物在鉴别内蒙古杭锦旗产甘草中的应用。
7.一种含权利要求1所述的SNP分子标记物的基因芯片或试剂盒。
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