CN113684291B - 一种鉴别东北地区黄芩的ssr分子标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴别东北地区黄芩的SSR分子标记引物及方法，方法包括如下步骤：以待鉴定黄芩样本的总DNA为模板，用SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到扩增产物；对扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到扩增产物的分型结果；将扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，得到等位基因矩阵；根据等位基因矩阵，通过GenALEx计算黄芩的遗传多样性数据；基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。本发明应用基因组技术及SSR分子标记技术，利用黄芩基因组设计SSR引物，并通过河北、山西、山东、陕西、内蒙古、辽宁、吉林等地的黄芩样本筛选SSR引物，用于特异性鉴别东北地区黄芩样本，准确度高、稳定性强、易于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种鉴别东北地区黄芩的SSR分子标记引物及方法。
背景技术
黄芩是一种广泛使用的中药材，其以根入药，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。黄芩的临床抗菌性比黄连好，而且不产生抗药性。据相关资料统计，目前市场上70％的中成药都含有黄芩，如常用的中成药清开灵口服液、双黄连颗粒/口服液/冻干粉针、银黄片/银黄颗粒/银黄口服液、小柴胡胶囊/小柴胡片/小柴胡颗粒、龙胆泻肝丸、固经丸等。
黄芩产于河北、辽宁、吉林、内蒙古、山东、山西、陕西等地，不同产地的黄芩药材的药效质量差异较大。药材的“道地性”是由于各个地区生态环境差异导致药材的药效不同，特定的地理气候种植的特定的药材，才能更好地发挥药效，也是道地药材的精髓。
黄芩产地的鉴别一直是黄芩物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。当前黄芩产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种鉴别东北地区黄芩的SSR分子标记引物及方法，解决现有黄芩产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强的技术问题。
本发明通过如下技术方案实现：
本发明的一种鉴别东北地区黄芩的SSR分子标记引物，包括以下引物对：
进一步的，所述引物对的退火温度为55℃-60℃之间，所述引物对的长度在20bp-25bp之间，PCR产物长度在150bp-350bp之间。
利用所述的SSR分子标记引物鉴别东北地区黄芩的方法，具体包括如下步骤：
以待鉴定黄芩样本的总DNA为模板，用所述SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
对所述扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到扩增产物的分型结果；
将所述扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵；
根据所述等位基因矩阵，通过GenALEx计算黄芩在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据；
基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据中的遗传距离，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。
进一步的，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 11.8μL，10×Taq Buffer 2μL，2mMdNTP 2μL，5uM Forward primer 1μL，5uM Reverse primer 1μL，Taq DNA polymerase0.2μL，DNA 2μL。
进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性0.5min，退火0.5min，72℃延伸1min，重复32个循环；72℃延伸10min。
进一步的，利用mCTAB法提取所述待鉴定黄芩样本的总DNA。
进一步的，对所述扩增产物进行毛细管电泳测序分型之前，还包括，将所述扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
进一步的，所述记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵具体包括：以二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵。
进一步的，所述遗传多样性数据包括遗传距离、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO、Shannon's指数。
本发明的技术方案具备如下有益效果：
本发明应用基因组技术及SSR分子标记技术，利用黄芩基因组设计SSR引物，并通过河北、山西、山东、陕西、内蒙古、辽宁、吉林等地的黄芩样本筛选出5对SSR引物，用于特异性鉴别东北地区黄芩样本，准确度高、稳定性强、易于大范围推广应用。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于本发明的SSR分子标记引物构建的不同主产区黄芩样本的UPGMA聚类图。
图2为对未知的黄芩样本基于本发明的SSR分子标记引物在UPGMA聚类图的鉴定结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供利用SSR分子标记引物鉴别东北地区黄芩的方法，具体包括如下步骤：
S1：利用mCTAB法提取所述待鉴定黄芩样本叶片内的总DNA，具体提取步骤如下：
(1)将黄芩样片叶片样本100mg放入2.0mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，浸入液氮中冻存1min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状备用。
(2)在研磨好的材料中加入1.5mL buffer A(0.1M Tris-HCl pH8.0；5mM EDTA；0.25M NaCl；1％PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，其间将沉淀下的粉末重新均质混合两次。10000×g离心后，弃掉上清液，得到第一次沉淀。
(3)将第一次沉淀再次加入1.5mL buffer A(0.1M Tris-HCl pH8.0；5mM EDTA；0.25M NaCl；1％PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，其间将沉淀下的粉末重新均质混合两次。10000×g离心后，弃掉上清液，得到第二次沉淀。
(4)在第二次沉淀中加入800μL预热的2％CTAB(0.1M Tris-HCl pH8.0；1.4MNaCl；25mM EDTA；2％(w/v)CTAB；0.2％,(v/v)β-巯基乙醇；1％PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65℃水浴锅中保存1.5-2h。其间要颠倒均质溶液3-5次，得到第一次混合液。
(5)将第一次混合液进行10000×g室温离心，获取第一次DNA上清液，将第一次DNA上清液小心倒入一个新的2.0mL离心管中，加入等体积CI(氯仿：异戊醇＝24:1(v/v))溶液，在颠倒摇床上混合10min，得到第二次混合液。
(6)将第二次混合液进行10000×g离心，获取第二次DNA上清液，以移液枪小心吸取第二次DNA上清液至一个新的2.0mL离心管中，加入等体积CI溶液，在颠倒摇床上混合10min，得到第三次混合液。
(7)将第三次混合液进行10000×g离心，得到第三次DNA上清液，以移液枪小心吸取第三次DNA上清液至一个新的1.5mL离心管中加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混合后置于-20℃冰箱保存1小时以上，得到第四次混合液。
(8)将盛装第四次混合液的离心管从冰箱中取出，进行10000×g离心，弃去上清液，得到第一次凝固体，将盛装第一次凝固体的离心管倒置于干燥纸上尽量控干液滴，然后加入100μL的RNase溶液(100mg/L)，37℃保存0.5h，得到第五次混合液。
(9)在盛装第五次混合液的离心管中依次加入150μL ddH2O,50μL 5M NaCl和700μL无水乙醇，充分混合后10000×g离心，弃去上清液，得到第二次凝固体，将盛装第二次凝固体的离心管再次倒置于干燥纸上尽量控干液滴，然后加入600μL70％乙醇，弹底混合后离心，弃掉上清液，得到第三次凝固体。
(10)将盛装第三次凝固体的离心管内再次加入600μL70％乙醇，弹底混合后离心，弃掉上清液，得到第四次凝固体。
(11)将盛装第四次凝固体的离心管真空干燥掉乙醇，加100μL TE溶解DNA，并根据Nanodrop测定将样品DNA浓度并稀释至50ng/μL，用于后续的PCR扩增。
其中，黄芩样本叶片的采集信息如下：分别采集河北、东北(以辽宁、吉林地区为例)、内蒙古、山东、山陕(山西和陕西)地区共计5个居群的黄芩各12株、12株、10株、11株、13株。黄芩样本叶片的具体采集信息见表1。
表1
S2：选择鉴别东北地区黄芩的SSR分子标记引物：
从基于全基因组高通量数据筛选出来的一批SSR引物和NCBI中的数据，选择重复单元(碱基序列)碱基数2bp-5bp，重复单元(碱基序列)重复5-10次的25对SSR引物进行预实验。所选择的引物长度在20bp-25bp之间，理论退火温度55℃-60℃之间，PCR产物长度处于150bp-350bp之间。选取了8个黄芩样本进行预实验，从扩增成功率以及多态性(毛细管荧光电泳方式)两个维度进行引物的选择，最终选定5对多态性好，扩增成功率高的SSR引物(sb2，sb16，sb22，sb23，sb26)，如下表2：
表2
上述表2中，F表示正向引物，R表示反向引物。
S3：以上述待鉴定黄芩样本叶片的总DNA为模板，用上述SSR分子标记引物进行PCR扩增，然后得到PCR扩增产物，PCR扩增过程具体如下：
反应体系：双蒸水(ddH2O)11.8μL，10×Taq Buffer 2μL，2mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)2μL，5uM正向引物(Forward primer)1μL，5uM反向引物(Reverse primer)1μL，TaqDNA聚合酶(Taq DNA polymerase)0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL。
反应程序：94℃预变性4min；32个循环的三步PCR(94℃变性0.5min，退火时间0.5min，Sb2、Sb23、Sb26退火温度为55℃，Sb16、Sb22退火温度为54℃，72℃延伸1min)；72℃延伸10min。
S4：将扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压是140V，电泳时间是15分钟，通过长波紫外灯照射凝胶观察是否有条带且片段大小是否合适以确认实验成功。
S5：将PCR产物按照等比例混合，送生工生物工程(上海)股份有限公司(地址：上海市松江区香闵路698号)进行毛细管电泳测序分型，得到PCR扩增产物的分型结果。
S6：将PCR扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵，具体是以“0,1”二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵。
S7：根据上述等位基因矩阵，通过GenALEx计算黄芩在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据；遗传多样性数据包括但不限于遗传距离、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO、Shannon's指数。
各居群的遗传多样性参数如下表3：
表3
其中，Pop是英文population,表示居群，Na＝观测等位基因数，Ne＝有效等位基因数，I＝Shannon's指数，Ho＝观测杂合度，He＝期望杂合度，F(Fixation Index)＝1-(Ho/He)，F(Fixation Index)取值范围为[-1,1]，越接近0表示群体越接近随机杂交，越接近1表示近交越严重或杂合缺失未测到，越接近-1表示存在杂种选择或者远交频繁。
通过表3可知：5个居群有效等位基因为2.704-3.189，Shannon's指数普遍较高，为0.994-1.197，其中辽宁、吉林居群的等位基因均值相对最低，相应的Shannon's指数也较低。同时山西陕西居群的观测杂合度＜期望杂合度，表明该居群可能存在一定的近交现象或者有杂合缺失未检测到的情况。
各居群间的遗传距离如下表4：
表4
通过表4可知：居群间平均遗传距离为0.296，其中居群辽宁、吉林与山东的遗传距离最大为0.497，说明辽宁、吉林、山东居群的种群关系最远，山东与河北的遗传距离最小，为0.192，两居群种群关系最近。
S8：基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据中的遗传距离，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树，如附图1所示。
由图1可知，黄芩样本叶片聚为5个分支，只有辽宁、吉林居群的聚为较纯的一个分支，其他分支都有不同程度的混杂情况，同时也说明5对SSR引物可以较好的对产地为辽宁吉林的黄芩居群进行区分鉴定。根据5对SSR引物多态位点结果，基于遗传距离，若待鉴别黄芩与辽宁、吉林居群聚在一起则表示该黄芩产地为辽宁吉林。
应用案例：从市场上获取了4份产地未知的黄芩样本材料(Sample 1,2,3,4)，通过本实施例上述的5对SSR引物组合鉴定结果为Sample1,3的产区为辽宁吉林，鉴定结果如附图2所示。
需要说明的是，图1和图2中的表示聚类树图的遗传距离标尺，0.7上方的线段长度表示0.7个遗传距离。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 中国中药有限公司
深圳华大基因科技服务有限公司
<120>一种鉴别东北地区黄芩的SSR分子标记引物及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactccttgg gtaacatttc gg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcatgatct cactcgatta ca 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttggagcgg tagtagtcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacaatccat ggcaacaaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtattgac cattgagcca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtcatggga gtatgagcgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtggatgg gaaagaagag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
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<400> 8
gtggtggttt tggaaggaga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtaaaccgcc tgatcgttgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatccgatcc agaagcacat 20
Claims (6)
1.一种鉴别辽宁或吉林地区黄芩的SSR分子标记引物，其特征在于，所述SSR分子标记引物的序列是：
2.利用权利要求1所述的SSR分子标记引物鉴别辽宁或吉林地区黄芩的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
以待鉴定黄芩样本的总DNA为模板，用所述SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
对所述扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到扩增产物的分型结果；
将所述扩增产物的分型结果用GeneMarker 4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵；
根据所述等位基因矩阵，通过GenALEx计算黄芩在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据；
基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据中的遗传距离，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树，若待鉴定黄芩与辽宁和吉林地区的黄芩聚在一起则表示该黄芩产地为辽宁或吉林；
所述记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵具体包括：以二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵；
所述遗传多样性数据包括遗传距离、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO和Shannon's指数。
3.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别辽宁或吉林地区黄芩的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 11.8μL，10×Taq Buffer 2μL，2mM dNTP 2μL，5μMForward primer 1μL，5μM Reverse primer 1μL，Taq DNA polymerase 0.2μL，DNA 2μL。
4.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别辽宁或吉林地区黄芩的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性0.5min，退火0.5min，72℃延伸1min，重复32个循环；72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别辽宁或吉林地区黄芩的方法，其特征在于，利用mCTAB法提取所述待鉴定黄芩样本的总DNA。
6.根据权利要求2所述的SSR分子标记引物鉴别辽宁或吉林地区黄芩的方法，其特征在于，对所述扩增产物进行毛细管电泳测序分型之前，还包括，将所述扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
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| 黄芩基因组SSR分子标记的开发及遗传多样性分析;齐琳洁;龙平;蒋超;袁媛;黄璐琦;;药学学报(第04期);第500-505页 * |
| 黄芩种质资源的ISSR分析;张红瑞;马彦秋;高致明;王文全;;河南农业大学学报(第04期);第380-384页 * |
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