CN111549161A - 一种利用丹参est-ssr标记鉴定唇形科药用植物方法 - Google Patents

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Abstract

由于缺乏合适的分子标记，绝大多数唇形科药用植物的鉴别研究几乎是空白。本发明利用从丹参中开发的EST‑SSR引物，以白花丹参、紫花丹参、甘西鼠尾草、云南鼠尾草、新疆鼠尾草、一串红、紫苏、黄芩、薄荷、益母草、桔梗为材料，检测了丹参EST‑SSR引物在唇形科各属间的通用性并进行了聚类分析。通用性检测结果显示丹参引物对各试材均有效扩增，并且可以为唇形科药用植物研究提供新的EST‑SSR标记和鉴定参考。

Description

一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法。
背景技术
由于缺乏合适的分子标记，绝大多数唇形科药用植物的鉴别研究几乎是空白。
表达序列标签(Expressed Sequence Tags EST)是通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行大规模测序所获得的5’或3’端序列，长度一般在150-500bp。根据表达序列标签而建立的简单序列重复(Simple Sequence Repeat, SSR)标记称为 EST-SSR，与传统基因组来源的简单重复序列标记相比，这种新型 SSR 标记正逐渐显现其独特的优越性，作为基因的一部分，EST-SSR侧翼序列在物种之间高度保守，能为功能基因提供“绝对”标记，并且具有开发成本低、物种间通用性高等优点，被广泛应用于遗传多样性分析、分子标记辅助选择以及种质鉴定等领域。
药用植物丹参的遗传研究基础较好,目前NCBI 中注册的丹参转录组数据和EST数据丰富，并有EST-SSR标记开发的报道，这些数据信息都为应用分子标记技术进行丹参提供了理论基础和技术支持。与丹参同属同科的药用植物较多，且不乏大宗药材如紫苏、黄芩、薄荷等，但这些药用植物与丹参相比，所能利用的EST序列相对较少。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法 。
我们设计开发并检测了设计开发了51对丹参EST-SSR引物, 检测这些引物其在其它一些唇形科药用植物中的扩增情况，筛选到2对引物可以将10种唇形科药用植物以及桔梗进行区分鉴定。
本发明采用以下技术方案：
.本专利提供了一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法：取适量幼嫩叶片提前DNA，利用一对或多对在唇形科药用植物中具有通用性的丹参EST-SSR引物进行PCR，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，53~60℃复性40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7 min；用DL2000 DNA Marker作对照，用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳条件：1×TBE缓冲液和100V的电压电泳分离2h30min，银染后观察并照相；在特定的EST-SSR位点上，统计各引物的扩增条带特征，鉴定唇形科药用植物。
优选的，所述在唇形科药用植物中具有通用性的丹参EST-SSR引物为48对引物中的一对或多对（见表1中前48对），所述48对引物其核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.96所示
优选的，所述在唇形科药用植物中具有通用性的丹参EST-SSR引物核苷酸序列为以下两对：
EST-SSR-39-F:5' GACCGTTAGATTGCCCAGAA 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.77所示；
EST-SSR-39-R:5' TGCAGTAATCTTCGGCTCCT 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.78所示；
EST-SSR-48-F:5' CTGCTCTAAGGCCAAAGGTG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.95所示；
EST-SSR-48-R:5' TATGGAGGTGCACGTAGTCG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.96所示。
本专利提供的方法可以鉴定唇形科药用植物包括白花丹参、甘西鼠尾草、云南鼠尾草、新疆鼠尾草、一串红、紫苏、黄芩、薄荷、益母草。
本专利提供的方法可以鉴定唇形科药用植物和唇形科外药用植物桔梗。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法，该新颖有效，填补了唇形科植物的分子生物学鉴定的空白，为唇形科植物鉴定提供了新型的方法。该方法也可以在科外部分植物中推广应用。
附图说明
图1是EST-SSR引物在唇形科药用植物中PCR扩增结果；其中M是DL 2000 marker，1-11分别白花丹参、紫花丹参、一串红、甘西鼠尾草、云南鼠尾草、新疆鼠尾草、紫苏、黄芩、薄荷、益母草、桔梗。
图2是基于EST-SSR的唇形科药用植物的聚类图。
图3是11个材料的EST-SSR-39扩增产物电泳图谱；其中M是DL 2000 marker; 1-11分别为不同供试材料从左到右为：白花丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba, 紫花丹参 S. miltiorrhiza Bunge, 甘西鼠尾草 S. przewalskii Maxim., 云南鼠尾草, S. yunnanensis C.H.Wright; 新疆鼠尾草, S. deserta Schang.; 一串红, S.splendensvar.Nana; 紫苏, Perilla frutescens (L.) Britt.; 黄芩, Scutellaria baicalensisGeorg.; 薄荷, Mentha haplocalyx Briq. 益母草, Leonurus Artemisia (Lour.) S.Y.桔梗, Platycodon grandiflorum (Jacp.) A.DC。
图4是EST-SSR-48引物在唇形科药用植物中PCR扩增结果；其中M是DL 2000marker; 1-11分别为不同供试材料从左到右为：白花丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba, 紫花丹参 S. miltiorrhiza Bunge, 甘西鼠尾草 S. przewalskii Maxim.,云南鼠尾草, S. yunnanensis C.H.Wright; 新疆鼠尾草, S. deserta Schang.; 一串红, S.splendens var.Nana; 紫苏, Perilla frutescens (L.) Britt.; 黄芩,Scutellaria baicalensis Georg.; 薄荷, Mentha haplocalyx Briq. 益母草,Leonurus Artemisia (Lour.) S.Y. 桔梗, Platycodon grandiflorum (Jacp.) A.DC。
具体实施方式
实施例1 丹参EST-SSR标记的通用性研究试验
No.1材料与方法
No.1.1试材及取样
本试验所用的材料包括：唇形科鼠尾草属药用植物紫花丹参 S. miltiorrhizaBunge,白花丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba,甘西鼠尾草 S. przewalskii Maxim., 云南鼠尾草, S. yunnanensis C.H.Wright; 新疆鼠尾草, S. desertaSchang.; 一串红, S.splendens var.Nana; 紫苏, Perilla frutescens (L.) Britt.;黄芩, Scutellaria baicalensis Georg.; 薄荷, Mentha haplocalyx Briq. 益母草,Leonurus Artemisia (Lour.) S.Y.,以及唇形科外药用植物桔梗（Platycodon grandiflorum (Jacp.) A.DC）共11种药用植物。材料种植在山东农业大学药用植物园，由王建华教授鉴定。每个材料取适量幼嫩叶片（约一到两片），低温下带回实验室，冷冻于 -20℃冰箱中备用。
No.1.2方法
No.1.2.1 DNA的提取
采用TIANGEN植物基因组DNA试剂盒快速提取法提取DNA，-20℃提取备用。
No.1.2.2 EST-SSR PCR反应程序
根据NCBI公共数据库（http://www.ncbi.nlm.gov/sites/entrez）公布的丹参EST序列和克隆序列开发EST-SSR引物51对(见表1，引物编号SEQ ID No.1-SEQ ID No.102)，由上海生工生物工程有限公司合成。扩增反应在BIO-RAD型基因扩增仪上进行。丹参的EST-SSRPCR反应优化体系如下，在总体积15μl的反应体系中，PCR Magic Mix 7.5μl(Tiandz)；上下游引物（2.5μmol/L）各1μl；DNA（20ng/μl） 1μl，双蒸水4.5μl。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸7 min，1个循环。4℃保存备用。用DL2000 DNA Marker作对照，用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：1× TBE缓冲液和120V的电压电泳分离2h，采用硝酸银染色法染色，后用Canon S3 IS数码相机照相观察。
表 1 丹参EST-SSR引物
引物名称 正向引物序列(5 ’→3’) 编号 反向引物序列(5’→3’) 编号
EST-SSR-1 F:CAGGTGGAAAATGCTGGAGT SEQ ID No.1 R:AATATTCATGGCTCGGCTTG SEQ ID No.2
EST-SSR-2 F:TGAATTGGCTGAGAAGAGTGAG SEQ ID No.3 R:AACGAATGGCATAGGTCACTG SEQ ID No.4
EST-SSR-3 F:ACCCCACCGTTCTCTCTTCT SEQ ID No.5 R:CTTGGAATGGATGGTACGAA SEQ ID No.6
EST-SSR-4 F:CGAAAGTCTAGCTCTGCCACT SEQ ID No.7 R:ATGGTGGGGGAATGTGACTA SEQ ID No.8
EST-SSR-5 F:CATGTATTCTGGCCTTCACG SEQ ID No.9 R:TGGAGCTTCAGCTATTTGAGTG SEQ ID No.10
EST-SSR-6 F:ATCCATCCCCAGTCTTTGCT SEQ ID No.11 R:GGATTGGGATGGAGGGAATA SEQ ID No.12
EST-SSR-7 F:TGGCCATTTGAAGGAGAAAC SEQ ID No.13 R:TCGCACGTACGAGCATACTA SEQ ID No.14
EST-SSR-8 F:CGCTGCCCTTATACAATGCT SEQ ID No.15 R:TCCCCCTCACAAAACCATTA SEQ ID No.16
EST-SSR-9 F:CACCGAATTGGGTAGCAATC SEQ ID No.17 R:GAAGAGGTTGGATGGTTGGA SEQ ID No.18
EST-SSR-10 F:AGGGACGGAGTGGAGTAATAA SEQ ID No.19 R:GATTCCATTTGCCCATTGTG SEQ ID No.20
EST-SSR-11 F:GCTGAATCGTCGCATCATAA SEQ ID No.21 R:TGCTTGACGTAGCTGGAATG SEQ ID No.22
EST-SSR-12 F:AGGATGAAACATCGTTGTGC SEQ ID No.23 R:CAAGTCAGTGCTGCACCAAA SEQ ID No.24
EST-SSR-13 F:GGCTCTTTAGGCAACACTCAA SEQ ID No.25 R:AACTGCCCCGTATAGCATTG SEQ ID No.26
EST-SSR-14 F:AAGCTTAGTGAGGCTTCTGTGA SEQ ID No.27 R:ATATTGCAGGTGGGGACAAC SEQ ID No.28
EST-SSR-15 F:GCGCAATGACATAAATCTCACC SEQ ID No.29 R:GTGTATTGGCCAAGCGGTAA SEQ ID No.30
EST-SSR-16 F:ACATTCGCTTGGATGTCCTC SEQ ID No.31 R:TGGCCCTTTGTCTTTTTGAG SEQ ID No.32
EST-SSR-17 F:AGGCCAAAATTGATGGGACA SEQ ID No.33 R:TTTTGTGAGACGGAGGGAGT SEQ ID No.34
EST-SSR-18 F:AAGGGGGACTTGGTGAACA SEQ ID No.35 R:CCGGAGATGAAAGTTTTGGA SEQ ID No.36
EST-SSR-19 F:CCCGAGCCTTTTGTTAAACC SEQ ID No.37 R:GGTGGTGTGTATGTGATGAGG SEQ ID No.38
EST-SSR-20 F:TCGTCCGATTACAAATGTCC SEQ ID No.39 R:TGTTCGCGATCCCTAACTATG SEQ ID No.40
EST-SSR-21 F:TGGGTTTTGGCTCTCTTGAT SEQ ID No.41 R:TCCCGCTCCCCTAAAGTATC SEQ ID No.42
EST-SSR-22 F:GCCATGCATCCTCTAATTCC SEQ ID No.43 R:CGAGGTCATTGAATGGGATA SEQ ID No.44
EST-SSR-23 F:ATAGGTGGTGGGCATGTACG SEQ ID No.45 R:TGGCAACTTTTAGTGGGACA SEQ ID No.46
EST-SSR-24 F:ACGGTGAGCCGTTACAATTC SEQ ID No.47 R:TTTCAGCTTACTGGCGGTTA SEQ ID No.48
EST-SSR-25 F:TGGCTCGAACAACACAAATG SEQ ID No.49 R:AACTCATTCCGAAGGTCGAA SEQ ID No.50
EST-SSR-26 F:CGGTAGATGGTTTGTTGTCG SEQ ID No.51 R:ACAAATCCACGCACACAAGA SEQ ID No.52
EST-SSR-27 F:AGCTGCCAACTTCTTCTTCTAC SEQ ID No.53 R:CACTTTAATTTGGGCACGAG SEQ ID No.54
EST-SSR-28 F:GAATGACCCCCTTCTTCCAT SEQ ID No.55 R:ATCAGCGCTGTGCACTACAT SEQ ID No.56
EST-SSR-29 F:GTTCGAAGTTGGCCAAAAAG SEQ ID No.57 R:AAATGGAACTCGATGGTTGG SEQ ID No.58
EST-SSR-30 F:CGCATCACATAACGGGAATA SEQ ID No.59 R:GCCTCAAGCCCATTCACTAA SEQ ID No.60
EST-SSR-31 F:TCATGCATATGCGATTAGCC SEQ ID No.61 R:ATATGGGACATTCGGAGTGG SEQ ID No.62
EST-SSR-32 F:CACGGGATGCAAATGCTAGT SEQ ID No.63 R:GGTCCTTTACGACATCTCCAA SEQ ID No.64
EST-SSR-33 F:GCGTTTAATTGCACCGTTGT SEQ ID No.65 R:CCTGCGCTAAATCTAGACGGTA SEQ ID No.66
EST-SSR-34 F:TCCAGTGAAGCCAAGCAAAT SEQ ID No.67 R:GGCTACCATGAGAGCACATCT SEQ ID No.68
EST-SSR-35 F:TGCTGGAAAGAAGCTAGCAG SEQ ID No.69 R:ATTTTGCTCCCTCCAGGATT SEQ ID No.70
EST-SSR-36 F:TTCGAACTCACGACCATGAA SEQ ID No.71 R:TCACCACTCCCAATACACTCA SEQ ID No.72
EST-SSR-37 F:CACACAACACTTGTCGTGGAC SEQ ID No.73 R:AAGTCCATTCCTATGCTCTGC SEQ ID No.74
EST-SSR-38 F:GAAAATGAAGGGGCAAGTCA SEQ ID No.75 R:GACCTCTCCATCCTCCAACA SEQ ID No.76
EST-SSR-39 F:GACCGTTAGATTGCCCAGAA SEQ ID No.77 R:TGCAGTAATCTTCGGCTCCT SEQ ID No.78
EST-SSR-40 F:CTTCAGCACCCTCATTCGAT SEQ ID No.79 R:TACGATCCCCACAGATCCAT SEQ ID No.80
EST-SSR-41 F:TGAGATCGAGCGAAGGAAAT SEQ ID No.81 R:CCGCCAAGATGAAGAAAGAA SEQ ID No.82
EST-SSR-42 F:AAATCCGCGTTCAGTCGAT SEQ ID No.83 R:GCCGGAACATGTCAAATACC SEQ ID No.84
EST-SSR-43 F:GGTTAAACTCACGCCCTTCA SEQ ID No.85 R:GGCGATTCAACCCATGTTAC SEQ ID No.86
EST-SSR-44 F:ATGCAACCTGCTGCTTCATA SEQ ID No.87 R:GGCAAACTTTTGAGGGACAA SEQ ID No.88
EST-SSR-45 F:ATCAAAGGCCCAATATGACC SEQ ID No.89 R:GAAAGAAAGCCCACGACAAA SEQ ID No.90
EST-SSR-46 F:TACTGATCGATCCCGTTTCC SEQ ID No.91 R:ATCTTCGCGGGTTCACTCTA SEQ ID No.92
EST-SSR-47 F:CAGGTGGAAAATGCTGGAGT SEQ ID No.93 R:GACATGGAGTAACCATGCAAAG SEQ ID No.94
EST-SSR-48 F:CTGCTCTAAGGCCAAAGGTG SEQ ID No.95 R:TATGGAGGTGCACGTAGTCG SEQ ID No.96
EST-SSR-49 F:GTGCATTTCTTTTACTGGGCTCAT SEQ ID No.97 R:ATTTGGGACAACTCTCACACACAC SEQ ID No.98
EST-SSR-50 F:GAATCGAGTAAGGAGAGAGAGGGC SEQ ID No.99 R:GTACACCAACGATATTATCCCCCA SEQ ID No.100
EST-SSR-51 F:CCAATTTACTCACCACAGCCTCTT SEQ ID No.101 R:ATGCAGCCACGTAGGATAGAGTTT SEQ ID No.102
No.1.2.3 数据分析
在特定的EST-SSR位点上，测定每一供试样品的等位位点组成。统计有效扩增引物数、各引物的出带数。电泳资料采用0、1二维数据矩阵的方法录入电脑，有带记录为1，无带记为0。数据分析采用NTSYSpc-2.10e（Exeter Software, Setauket, N.Y.）软件。计算Nei遗传距离和遗传相似系数，采用非加权算术平均聚类法（UPGMA）进行参试唇形科药用植物的聚类分析。
No.2结果与分析
No.2.1 丹参EST-SSR引物通用性检测
51对EST-SSR引物对丹参和9种唇形科药用植物进行标记的通用性检测，结果显示有48个引物对（94.1%）在丹参中有扩增产物。48对丹参EST-SSR引物在9种药用植物中扩增率明显不同，在甘西鼠尾草、云南鼠尾草、新疆鼠尾草、一串红、紫苏、黄芩、薄荷、益母草和桔梗中的扩增引物数和有效扩增率分别是28（58.3%）、33（68.8%）、29（60.4%）、17（35.4%）、22（45.8%）、9（18.8%）、20（41.7%）、13（27.1%）、30（62.5%），在唇形科植物的平均有效扩增率为44.5%，表明丹参EST-SSR引物在唇形科药用植物中具有较高的通用性。9种药用植物中在3种鼠尾草的扩增成功率高于其它植物种类，其中云南鼠尾草最高达到68.8%，而在黄芩中的扩增成功率最低仅为18.8%，反映出引物对不同试材的通用性存在差异。
No.2.2 引物扩增差异性分析
丹参EST-SSR引物的扩增位点数存在差异性，表1中前48对引物在丹参中的扩增条带数为136条，每个引物平均位点2.83个,鼠尾草属药用植物中的扩增位点数和引物平均扩增带数高于属外药用植物，反映了该标记序列在丹参近缘药用植物中保守性更强，通用性更大。但科外植物桔梗，扩增位点数达到63条，平均扩增带数高达2.10（表2）。
表2 丹参EST-SSR引物在9种唇形科药用植物中通用性检测结果
Figure 633480DEST_PATH_IMAGE002
No.2.3 基于EST-SSR的亲缘关系分析
利用48对引物在9种试材上的扩增结果，计算Nei遗传距离，结果显示科外植物桔梗与其它药用植物间的遗传距离最大，鼠尾草属内各药用植物间的遗传距离较小。利用 NTSYS-PC 软件，使用 UPGMA 法构建了聚类树（图2）。在遗传距离为1.9水平可分为两大类：Ⅰ类包括白花丹参、云南鼠尾草、丹参、甘西鼠尾草4个材料，该类在遗传距离处1.5处又可分为两个亚类，亚类Ⅰ包括白花丹参、云南鼠尾草和丹参，亚类Ⅱ包括甘西鼠尾草；Ⅱ类包括一串红、薄荷、新疆鼠尾草、紫苏、黄芩和桔梗6个材料，该类可进一步分为两个亚类， 亚类Ⅰ由一串红、薄荷、新疆鼠尾草、紫苏、黄芩组成，亚类Ⅱ为桔梗。
No.2.4 利用EST-SSR鉴定唇形科药用植物的分析
EST-SSR位点在属内种间，甚至在科内属间具有保守性。近年来研究表明,根据特定物种EST开发的SSR引物，在其近缘物种和亲缘关系较远的物种中有扩增产物。但不同植物上开发的EST-SSR 标记的通用性不同。本研究利用丹参EST-SSR引物在唇形科药用植物的通用性进行了检测，该标记在丹参近缘种鼠尾草属内的通用性为55.7%，在唇形科植物上的平均有效扩增率为44.5%，说明丹参 EST-SSR 虽然在唇形科植物上有较好的通用性，但对近缘物种有更高的通用性，利用EST-SSR鉴定唇形科药用植物需要进一步筛选。
通用性研究结果证实了基于 EST 的 SSR 引物在物种之间的高保守性，这启示我们利用大宗药材已开发的大量的 EST-SSR 标记，在 EST 数据库中数量较少的物种具有良好的前景。另外，丹参EST-SSR在桔梗科桔梗属植物桔梗上的有效引物达到了62.5％，这为科外植物EST-SSR标记研究带来新的启发。
虽然EST-SSR 标记的开发仅限于 EST 序列数据库早已存在的物种，但对于一个特定物种，若缺乏相关的序列资料，源于其他种的 EST-SSR 标记也将是有效和可用的标记资源，可有效替代重新开发标记，为其它物种的相关标记研究提供了一个新的途径。这种新型 SSR 标记正逐渐应用于植物遗传图谱构建、遗传多样性分析、功能基因定位和比较作图等研究。本研究利用48对丹参EST-SSR引物对9种唇形科药用植物进行了分类研究，结果显示丹参与近缘种的亲缘关系较近，聚为一类，其它非鼠尾草属植物与丹参亲缘关系较远，科外植物桔梗最远，其分类结果与植物分类结果基本一致，进一步验证了该标记在其它植物上的有效应用，为其它药用植物的进一步利用奠定了基础。
实施例2 利用丹参EST-SSR标记鉴定10种唇形科药用植物试验
在实施例1筛选的48对EST-SSR标记中，选择2对差异性比较大的丹参EST-SSR标记，进行10种唇形科药用植物鉴定试验。
No.1 材料与方法
No.1.1材料
11种药用植物材料均采自山东农业大学药用植物园，所属科属及相关信息见表3。
表3 11个药用植物供试材料及其科属
Figure 87333DEST_PATH_IMAGE004
No.1.2方法
No.1.2.1 DNA的提取
每个材料取适量幼嫩叶片（约一到两片），液氮速冻后，采用TIANGEN植物基因组DNA试剂盒快速提取法提取DNA，-20℃贮存备用。
No.1.2.2 EST-SSR引物试剂盒
根据实施例1的通用性和特异性结果，同时考虑GC含量、退火温度、引物长度、次级结构等参数，选择2对引物，有关这些引物的具体情况参见表4。PCR反应体系如下，在总体积15μl的反应体系中，PCR Magic Mix 7.5μl(Tiandz)；上下游引物（2.5μmol/L）各1μl；DNA（20ng/μl） 1μl。
表4 2对丹参EST引物
Figure 316320DEST_PATH_IMAGE006
No.1.2.2 PCR反应程序
扩增反应在BIO-RAD型基因扩增仪上进行。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，53~60℃复性40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7 min。用DL2000 DNA Marker作对照，用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：1× TBE缓冲液和100V的电压电泳分离2h30min，银染后观察并照相。
No.1.2.3 数据分析
在特定的EST-SSR位点上，统计有效扩增引物数、各引物的出带数，电泳资料采用0、1二维数据矩阵的方法录入电脑，有带记录为1，无带记为0。数据分析采用NTSYSpc-2.10e（Exeter Software, Setauket, N.Y.）软件计算Nei遗传距离和遗传相似系数，采用非加权算术平均聚类法（UPGMA）进行聚类分析。
No.2结果与分析
No.2.1 丹参EST-SSR引物扩增产物检测
2对EST-SSR引物对11种供试材料进行扩增效率的检测（图3和图4），结果显示这2个引物对在丹参中均有扩增产物 ，同时也可以看到材料2、4、6、8、9的扩增结果与其它材料（1、3、5、7、10、11）的扩增结果明显不同，因而可以将这些材料鉴定出来。而在引物EST-SSR-45这个引物的扩增结果中，1、2、3、5、7、9、11的扩增结果明显不同于其它材料的扩增结果。因此利用这两对引物即可以将10种唇形科药用植物以及桔梗进行区分鉴定。
综合实施例1和实施例2，可以看出丹参EST-SSR标记在唇形科药用植物中具有通用性，我们选择其中具有特异性的标记，可以用于鉴定唇形科药用植物。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法
<160> 102
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtggaaa atgctggagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatattcatg gctcggcttg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaattggct gagaagagtg ag 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacgaatggc ataggtcact g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accccaccgt tctctcttct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttggaatgg atggtacgaa 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgaaagtcta gctctgccac t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggtggggg aatgtgacta 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catgtattct ggccttcacg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggagcttca gctatttgag tg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atccatcccc agtctttgct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggattgggat ggagggaata 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggccatttg aaggagaaac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgcacgtac gagcatacta 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgctgccctt atacaatgct 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccccctcac aaaaccatta 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caccgaattg ggtagcaatc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaagaggttg gatggttgga 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agggacggag tggagtaata a 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gattccattt gcccattgtg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctgaatcgt cgcatcataa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcttgacgt agctggaatg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aggatgaaac atcgttgtgc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caagtcagtg ctgcaccaaa 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggctctttag gcaacactca a 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aactgccccg tatagcattg 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aagcttagtg aggcttctgt ga 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atattgcagg tggggacaac 20
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgcaatgac ataaatctca cc 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgtattggc caagcggtaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acattcgctt ggatgtcctc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tggccctttg tctttttgag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aggccaaaat tgatgggaca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttttgtgaga cggagggagt 20
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aagggggact tggtgaaca 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccggagatga aagttttgga 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cccgagcctt ttgttaaacc 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggtggtgtgt atgtgatgag g 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcgtccgatt acaaatgtcc 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgttcgcgat ccctaactat g 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgggttttgg ctctcttgat 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcccgctccc ctaaagtatc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gccatgcatc ctctaattcc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgaggtcatt gaatgggata 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ataggtggtg ggcatgtacg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tggcaacttt tagtgggaca 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acggtgagcc gttacaattc 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tttcagctta ctggcggtta 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tggctcgaac aacacaaatg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aactcattcc gaaggtcgaa 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cggtagatgg tttgttgtcg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acaaatccac gcacacaaga 20
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
agctgccaac ttcttcttct ac 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cactttaatt tgggcacgag 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gaatgacccc cttcttccat 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
atcagcgctg tgcactacat 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gttcgaagtt ggccaaaaag 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aaatggaact cgatggttgg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cgcatcacat aacgggaata 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gcctcaagcc cattcactaa 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tcatgcatat gcgattagcc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atatgggaca ttcggagtgg 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cacgggatgc aaatgctagt 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggtcctttac gacatctcca a 21
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gcgtttaatt gcaccgttgt 20
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cctgcgctaa atctagacgg ta 22
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tccagtgaag ccaagcaaat 20
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggctaccatg agagcacatc t 21
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
tgctggaaag aagctagcag 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
attttgctcc ctccaggatt 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ttcgaactca cgaccatgaa 20
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tcaccactcc caatacactc a 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cacacaacac ttgtcgtgga c 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
aagtccattc ctatgctctg c 21
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gaaaatgaag gggcaagtca 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gacctctcca tcctccaaca 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gaccgttaga ttgcccagaa 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tgcagtaatc ttcggctcct 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cttcagcacc ctcattcgat 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tacgatcccc acagatccat 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tgagatcgag cgaaggaaat 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ccgccaagat gaagaaagaa 20
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
aaatccgcgt tcagtcgat 19
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gccggaacat gtcaaatacc 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ggttaaactc acgcccttca 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ggcgattcaa cccatgttac 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
atgcaacctg ctgcttcata 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ggcaaacttt tgagggacaa 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
atcaaaggcc caatatgacc 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gaaagaaagc ccacgacaaa 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tactgatcga tcccgtttcc 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
atcttcgcgg gttcactcta 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
caggtggaaa atgctggagt 20
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gacatggagt aaccatgcaa ag 22
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ctgctctaag gccaaaggtg 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tatggaggtg cacgtagtcg 20
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gtgcatttct tttactgggc tcat 24
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
atttgggaca actctcacac acac 24
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gaatcgagta aggagagaga gggc 24
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gtacaccaac gatattatcc ccca 24
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ccaatttact caccacagcc tctt 24
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
atgcagccac gtaggataga gttt 24

Claims (5)

1.一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法，其特征在于：取适量幼嫩叶片提前DNA，利用一对或多对在唇形科药用植物中具有通用性的丹参EST-SSR引物进行PCR，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，53~60℃复性40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7 min；用DL2000 DNA Marker作对照，用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳条件：1×TBE缓冲液和100V的电压电泳分离2h30min，银染后观察并照相；在特定的EST-SSR位点上，统计各引物的扩增条带特征，鉴定唇形科药用植物。
2.根据权利要求1所述的一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法，其特征在于：所述在唇形科药用植物中具有通用性的丹参EST-SSR引物为48对引物中的一对或多对，所述48对引物其核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.96所示。
3.根据权利要求1所述的一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法，其特征在于：所述在唇形科药用植物中具有通用性的丹参EST-SSR引物核苷酸序列为以下两对：
EST-SSR-39-F:5' GACCGTTAGATTGCCCAGAA 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.77所示；
EST-SSR-39-R:5' TGCAGTAATCTTCGGCTCCT 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.78所示；
EST-SSR-48-F:5' CTGCTCTAAGGCCAAAGGTG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.95所示；
EST-SSR-48-R:5' TATGGAGGTGCACGTAGTCG 3'，其核苷酸序列如SEQ ID No.96所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法，其特征在于：所述唇形科药用植物包括白花丹参、甘西鼠尾草、云南鼠尾草、新疆鼠尾草、一串红、紫苏、黄芩、薄荷、益母草。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的一种利用丹参EST-SSR标记鉴定唇形科药用植物方法，其特征在于：该方法在鉴定唇形科药用植物和唇形科外药用植物桔梗中的应用。
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