CN111808838B

CN111808838B - 一种樟树芳樟醇合成酶、以及鉴定芳樟醇型樟树的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111808838B
Application number: CN202010891874.6A
Authority: CN
Inventors: 汪信东; 张月婷; 符潮; 邱凤英; 杨海宽; 戴小英; 章挺; 何小三; 李江
Original assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Current assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: CN111808838A

Abstract

本发明涉及樟树芳樟醇合成酶，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。还提供了一种用于鉴定芳樟型樟树的分子标记，以樟树为检测材料、提取待检测樟树基因组DNA；利用WZF01特异性引物以樟树基因组DNA为模板进行PCR扩增，当含有约1200bp扩增目的条带时，判断其为芳樟醇型樟树。本发明提供的WZF01特异性引物追踪芳樟醇型樟树准确率99％以上，准确性高，操作简单，成本低廉的特点且适合苗期鉴定，大大提高了芳樟型樟树的选育效率。

Description

一种樟树芳樟醇合成酶、以及鉴定芳樟醇型樟树的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及樟树化学型快速鉴定的方法，具体涉及一种樟树芳樟醇合成酶、以及鉴定芳樟醇型樟树的分子标记及其应用。

背景技术

樟树(Cinnamomum camphora)为樟科樟属常绿乔木树种，为我国Ⅱ级保护植物，是一种集材用、药用、香精香料、油用、园林观赏和生态文化等于一体的多用途树种，具有较大的开发利用潜力。根据樟树叶精油中所含主成分的不同，可将樟树分为不同的化学型，常见为樟脑型(主成分为樟脑)、芳樟醇型(主成分为芳樟醇)、桉叶油素型(主成分为1,8-桉叶油素)、橙花叔醇型(主成分为异橙花叔醇)和龙脑型(主成分为右旋龙脑)等5种化学型。1968年，Rolf Santesson博士和他的儿子Johan首次提出植物“化学型(chemotype)”概念，将之定义为“群体中个体间不能通过形态学区分的化学特性。不同化学类型樟树表型并无明显区别、不能通过常规的分类学特征进行区分。樟树是我国主要的天然木本精油植物资源之一，具有很高的开发利用价值。不同化学型樟树用途迥异，如从芳樟醇型樟树提取的芳樟醇位居世界香料市场上用途最广的20大成分前列，而从龙脑樟中提取的天然龙脑则为我国传统珍稀中药材。樟树自然群体中，调查发现芳樟醇型樟树比例低于5.00％，如何快速鉴别出芳樟醇型樟树是樟树精油工业原料林建设中遇到首要问题。传统生产上，不同化学类型樟树个体筛选主要依赖于科技人员经验性的“闻香法”，尽管该法操作简单，但准确率因人而异且无科学量化依据。实验室中，鉴别不同化学型樟树则通过气相-质谱联用(GC-MS)开展，结果可靠但程序繁芜且成本较高。另一方面，芳樟醇型樟树后代种子实生苗会产生大量变异、形成不同化学型后代个体，初生1-2年内种苗精油成分一直处于快速波动中、经验性的“闻香法”很难用于芳樟醇型后代个体的早期筛选，实生苗不能应用于大规模良种繁育中，造成了良种更新缓慢，优良基因资源大量流失。

芳樟醇属于单萜类化合物，是植物中现已发现的成千上万种天然萜类化合物之一。现代分子生物学研究表明，植物合成天然萜类化合物种类主要由体内萜类合成酶(Terpene synthases,TPS)基因控制。目前，在其它植物中，如黄花蒿(Artemisia annua)、柠檬留兰香(Mentha citrata)、柠檬香桃(Lemon Myrtle)、罗勒(Ocimum basilicum)、仙女扇(Clarkia breweri)及薰衣草(Lavandula angustifolia)等，控制芳樟醇合成的TPS已被分离克隆，命名为芳樟醇合成酶。植物主要通过TPS基因差异化表达而调控某种萜类化合物含量进而形成特定的化学型。TPS基因是鉴别植物个体化学型的关键靶标基因之一。迄今，控制樟树芳樟醇合成的关键TPS基因之前还未被公开报道。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的技术问题，分离出一种芳樟醇合成酶，基于该合成酶的编码框(ORF)与其启动子区核苷酸序列开发特异引物，可以快速、准确的鉴定出芳樟醇型樟树。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种樟树芳樟醇合成酶，所述芳樟醇合成酶(TPS12)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述樟树芳樟醇合成酶基因的开放阅读框序列为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于鉴定芳樟型樟树的分子标记，所述分子标记(WZF01)引物信息为：

WZF01-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

WZF01-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

另外，本发明还提供了一种用于鉴定芳樟型樟树的分子标记的应用，包含以下步骤：

1)提取待检测不同化学型樟树个体基因组DNA；

2)以各个体基因组DNA为模板、利用WZF01引物进行PCR扩增；

3)当扩增所得目的条带约1200bp左右时，判断其为芳樟型樟树。

进一步地，其中所述的PCR反应体系如下：

所述的PCR程序为:98℃预变性2min：98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明基于樟树多组学和生化实验证据，分离出樟树芳樟醇合成酶(TPS12)，并基于TPS12基因核苷酸序列开发出一对可快速鉴别芳樟醇型樟树的分子标记WZF01，在大样本群体验证实验中准确率达99％以上，准确性高，操作简单，成本低廉的特点且适合苗期鉴定，大大提高了芳樟型樟树的选育效率。该分子标记在樟树品种鉴定、亲缘关系分析、不同化学类型形成机制及芳樟醇型樟树工业原料林培育等方面具有重要的理论指导和应用价值。

附图说明

图1为TPS12基因在樟树五种化学型个体中实时定量(qPCR)表达结果，其中：F代表芳樟醇型个体、N代表樟脑型个体、L代表龙脑型个体、U代表桉叶油素型个体、Y代表橙花叔醇型个体。

图2.为分子标记WZF01扩增五种化学类型樟树的PCR结果；其中，M:DNAMarker(DM2000)；1-3:芳樟对应的PCR结果；4-6:龙脑樟对应的PCR结果；7-9:脑樟对应的PCR结果；10-12:油樟对应的PCR结果；13-15:异樟对应的PCR结果。

图3为分子标记WZF01扩增随机选取的不同化学类型的樟树PCR检测结果；其中，M:DNAMarker(DM2000)，105bp条带为樟树Actin基因扩增片段，1200bp为分子标记WZF01扩增片段。

图4为PCR阳性样品GS-MS检测TIC图。

图5为对照标准品芳樟醇GS-MS图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对于本发明做进一步说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围

实施例一

一、基因TPS12核苷酸序列的获得

(1)分析课题组前期完成樟树5种化学型(樟脑型、芳樟醇型、桉叶油素型、橙花叔醇型和龙脑型)叶组织转录组，获得在芳樟醇型叶组织中特异上调表达的CL5490.Contig1_All，以此为参考，设计特异PCR克隆引物(1F：5’-GGTGCACATGACATCTTTGT-3’，1R:5’-AAGGACTGGAAACTACAAAT-3’)。

(2)使用北京华越洋生物科技有限公司多糖多酚植物RNA提取试剂盒介绍(ZH120)提取芳樟醇型樟树叶组织Total RNA，利用TAKARA公司产试剂盒PrimeScript^TMRT reagentKit with gDNA Eraser(RR047A)纯化并合成cDNA第一链。

(3)PCR法克隆基因，具体PCR反应体系如下：

所述的PCR程序为:95℃预变性3min：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

(4)扩增获得单一条带，切胶回收、链接克隆载体PMD18-T，转化感受态细胞Top10，涂布LB固体培养基(携带氨苄青霉素抗性)，挑选阳性单克隆送至测序，获得长为1934bp基因、其中CDS区长度1908bp,命名为TPS12。

二、分子标记WZF01-F和WZF01-R的获得

(1)以TPS12基因CDS序列作为查询序列，比对樟树基因组，取起始密码子ATG上游2500bp核苷酸序列作为候选启动子区，设计扩增引物(2F：5’-AGCACTCTTGCAAGCCAAGG-3’，2R：5’-CAAACTCATGTTCTTCAAGTAG-3’)。

(2)CTAB法提取5种化学类樟树DNA；所需试剂：氯仿/异戊醇(24:1)；氯仿；75％乙醇；异丙醇；ddH2O；DNA提取液(0.1M Tris-Cl，0.02M EDTA，2％CTAB，1.5M NaCl)；具体步骤如下：

①取樟树叶片约1g，放入用液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，快速研磨成粉状，将研磨好的粉末样品转移到10mL离心管中，加入3ml CTAB，颠倒混匀；放入65℃烘箱30min，每隔10min混匀一次；

②待样品冷却到室温，加入3ml氯仿/异戊醇(24:1)，混匀至完全乳化后，12000rpm离心15min；

③小心吸取上层水相约2ml，转移到新的10mL离心管中；加入3ml氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心15min；小心吸取上层水相约2ml，转移到新的10mL离心管中；

④重复步骤③两次；

⑤加入3ml氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心15min；

⑥小心吸取上层水相约1ml，转移到新的2mL离心管中，加入1ml异丙醇，缓慢颠倒混匀，-20℃沉淀1h；

⑦12000rpm离心20min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，弃上清，10000rpm离心1min，用移液器吸除残余乙醇，室温干燥20min

⑧加300μL ddH₂O溶解，室温静置使沉淀溶解，进行琼脂糖凝胶电泳和分光光度法检测DNA的纯度和浓度，DNA样品保存在-20℃备用。

(3)稀释DNA10倍，取1μL作为模板、PCR扩增TPS12启动子区，具体PCR反应体系如下：

所述的PCR程序为:95℃预变性3min：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

(4)电泳、回收PCR产物、测序；

(5)比对5种化学类型候选启动子区序列，在序列差异处设置上游引物WZF01-F，在TPS12基因CDS区寻找与之搭配的下游引物WZF01-R。

实施例二：TPS12基因在芳樟醇型个体中的表达

(1)设置TPS12基因实时定量PCR引物(3F:5’-AGGACATTCAAGGCATACACA-3’；3R:5’-TCTCATCTGACCTCCCATTC-3’)；设置樟树内参Actin基因实时定量PCR引物(F:5'-CCTCGACACACAGGCGTTAT-3'；R:5'-CCATGCTCGATGGGATATTTCA-3')

(2)于4月份取基因库中已知5种化学类型樟树嫩叶组织各1g，叶组织total RNA提取、纯化与cDNA第一链合成同实施例一；

(3)稀释cDNA50倍、取5μL稀释液作为模板，使用高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒检测TPS12基因在不同化学型叶组织中相对表达量。每个样品重复3次。具体反应体系如下：

qPCR仪为伯乐CFX96 Touch，具体程序为:95℃预变性30s：95℃、10s，60℃、30s，40个循环；添加溶解曲线。

(4)以Actin基因作为内参、实验数据统计采用2^-△△CT方法计算相对表达量。

结果见图1。

实施例三：

于江西省林业科学院樟树基因库中各选取5种化学类型的樟树12株，分别编号1-12，其中1-3为芳樟，4-6为龙脑樟，7-9为脑樟，10-12为油樟，13-15为异樟。

(1)CTAB法提取樟树基因组DNA，具体步骤同实施例一

(2)利用引物WZF01以樟树基因组DNA为模板扩增目的片段，PCR反应体系如下：

PCR程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min(约0.5min/kb)，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

(3)将扩增完成的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照(图2)。

在本实施例中，选取樟树5种化学类型的DNA样品为模板，利用WZF01引物进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。结果表明，WZF01引物只能特异性扩增以芳樟醇型个体基因组DNA为模板的样品。

实施例四：检验引物WZF01追踪芳樟醇型樟树准确性

(1)在本实施例中，为了检测引物WZF01追踪芳樟醇型樟树准确性，随机采集了江西省林业科学院四周芙蓉路、双港大街34棵5～10年生樟树叶片、提取基因组DNA和精油。

(2)采用CTAB法提取DNA，具体步骤同实施例一；

(3)以34株DNA稀释液为模板，WZF01为引物，PCR法扩增检测，具体PCR体系和程序同实施例三，结果见图3；

(4)正戊烷萃取法提取樟树叶精油，具体步骤如下：

①取樟树叶片1g，放入用液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，快速研磨成粉状；

②将研磨好的粉末样品转移到10mL离心管中，加入5ml正戊烷，摇床摇晃5h；

③12000rpm离心30min，取上清到新的2mL离心管中；

④重复步骤(3)一次；过滤、留上清；

(5)通过GC-MS检测精油成分；载气为He，载气流速1.0m L/min，采用分流进样，分流比20:1。气相条件(GC)：进样口温度280℃，升温程序：初始柱温50℃保持2min，3℃/min升温至180℃保持2min，再以8℃/min升温至240℃保持5min，共运行60min。质谱条件(MS)：接口温度260℃，离子源温度180℃，扫描范围(m/z)50-620；结果见图4、5；

图3中105bp条带为樟树Actin基因扩增片段，表明所有检测个体基因组DNA完整；1200bp为分子标记WZF01扩增片段，其中编号为2、4、6、9、10、11、12、15、21、28的10个样品有条带，为PCR阳性植株；GC-MS分析精油成分显示PCR阳性植株叶精油主成分均为芳樟醇、为芳樟醇型樟树，PCR阴性植株叶精油主成分均为非芳樟醇、为其它4种化学型樟树。在本实例中分子标记WZF01追踪芳樟醇型个体准确性100％，特异性地鉴别了芳樟醇型樟树，可为芳樟醇型樟树选育提高帮助。

序列表

<110> 江西省林业科学院

<120> 一种樟树芳樟醇合成酶、以及鉴定芳樟醇型樟树的分子标记及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4249

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 1

agcactcttg caagccaagg acaacaagcg ctacaaaaat ccccaaaaca aaccctaaaa 60

tgggtcaaaa caatgaggga gaagagagag ctttcagtat taaaaatgta gcttctctaa 120

gaccaaaaga acactaatct agaagattag gaagacagct taccaaatgg tgctccaaaa 180

gagcaagaca agctagaaga gggtcttgaa gagatgagat tcctccacaa atggtaccaa 240

taggaagctc ttgaagttgt gaagaagatg atgaagtcca aatagatgtt ggtgcaagtt 300

tgatgatgct tgatgaagga aaagcaagga gaagaaaggg aaaccctagg ctcaaggaaa 360

agttgctgga aaaagagaaa atgagggaga tgggttccct tttataagct acacaagtgg 420

gctccaccat ctagtaacct agttgggctg aaatagtggt tttcgggact tcggatgaaa 480

tcgacgaaga aggaagaaat gatcgtcgaa atatctagtt tctaaaaagt ttatgtttcg 540

cgggtttcgg gattaacact aatttggtac atatttggtg taaaagtact gttttgccct 600

tgaagctaga aaagtcaagt ttcggggttt caaacgggaa cgggatcaac atgaaagttg 660

aaggcaataa cgagaaaaac aaaacggggt aaaatgcaaa tcgagaaaac caagatagaa 720

cctcaagtac acgtaaagcc ataaacaagg aacccccaaa gggccccact aataccaaag 780

gcactcaaaa tccccaaagc tatttcaaag ctattctaaa ctaaaccaaa ccaaagtcca 840

caaaacaaaa caagactaac acgcaactaa ctaagcacta aacgagatta ctcgggtcgg 900

ggtcttacaa caacaactat gatgaaaatt tgcaacttga gataaatttt ataaattata 960

attatgagaa ttttttgata ctgtgatatt tctaacgctg aaaagtcatg tccttttttt 1020

ttcttcttct gaaatcaagt tgtttattct ccccacaaac accgctcagt agagagcaca 1080

gatgatagaa gaggtcaaat ttgtgatata gtaaaggaga tgatagaaga gcatgtatga 1140

cctttacgta atggggtcta cctcagatgt tctacatgcc ctatcatttg aacggccaat 1200

ataattgaat atatgatact taacactttt gcattgtttg aagaccagaa taaaacccag 1260

actggttgtc caaagccatt ggcaagcggc ccttaaaaca tggactaaac ttttttaaca 1320

aaaaaaagag gagatgttct ctatttcttt catgcccagt ctacattgca tattaatgtt 1380

tctgccaatg catctttggc gtaagaggac atcagactac caggtgggtc ccaaatgact 1440

agccccacca tgccactatg caattgaatc tcttgaaatg aaaaaattac ccttttatcc 1500

catcaccttt attctaaatg ggtgaaagca tgtttcatgt ggtgtttaca cctcactgtt 1560

acaaacacgc caaaaagata ggttttcaag tggatattaa cactctccgt caatgggcca 1620

acttaacaag attaagaaca acaacaacaa caacaacaac gagttccatg ccaattgcca 1680

acacattcgc accttagcac gaaacacatg ctcaaggttt gatccttgag tggtgaagca 1740

tcacccatgt aagtactagt ccgaacatag caaaaaaaag taaaaagaaa agaaaaaacc 1800

aaatgtgttt catgagttgg gccatagaca actagggttt tttatggggt ttgggcccag 1860

tccaattttt aacccatagg ccaattctag cccagacctg aactaggcca taagtaccta 1920

gccctagctt tgcccgcata aaataggtta agcctgagcg cggattgatg gtaaatatat 1980

tgttaagaag gtcttaacct agagtttttt ttattgccga tccaaacata cgtaaaataa 2040

ttataaacag tctggaattg gagcaaattc agcgaaaacc taaacgtggt tgaaattaaa 2100

ctcgacgtca aaatctagaa atccaaacct gctccaaacc caagaaaatc atgatcaaac 2160

ccatgtatat ctccattaaa gagaagaaaa ttttgcatcg ttatttcata ggtgttggtc 2220

atatcttgtg gtagaaccac gtatatcttg tgtcgatttt ttcttttttt ttttttggtt 2280

ggatgtcttg tgtcgattga ttgtaaccaa atgtacccct gcaaagatta ggcaggtgca 2340

catgacatct ttgtttcatt ttgtagcatg tgaatttcat ggcgtccaca agcggaacgt 2400

cagcaacagg aagcgactgc tatatataac taccataatt cttctctttc tccaccatgt 2460

tatatctagt tctagctttc tacaatccta cttgaagaac atgagtttga tcattcattc 2520

tcttcctcat tggtctagaa ttccacctag acctcctcaa ctctctcaat ttcaaaactc 2580

atccaagccc aaacctctaa ttccggtagg ccaagtgcaa tgcaacgcgc tccaaatcgc 2640

ccgtcgatca gcaaattatc acccaaacat ttgggacccc caatatattg agtcgctaac 2700

aagtccatat ggaggtgagt gctttgggac tcggcttgag gagttgaaat tcgaagccaa 2760

acggctactc gaagctaccg tagacccatt gtcttggcta gagctcgtcg actcgatcca 2820

acggttaggg gtggcatacc actttgagga tgagatcaaa gaaggccttg atggtgttta 2880

tggggttggc gcccacgtcg gccatgatct ttgcactgcg gcattacagt tccgacttct 2940

tcgacaaaat ggttattgtg ttactccaga cattttcaac aagtttttgg agaaggacag 3000

gacattcaag gcatacacaa gccttgatgc aaaaggcctt ttgagcctat atgaagcatc 3060

atatactatg atgcatggtg aggaagtgtt ggaagacgcc aaagaattta gtgttaagca 3120

tcttaaccgc ttgatgggca acttacagag caatctaaga gagcaagtgc aacatgccct 3180

agaaatgccc ttgcattgga ggatgccaag gctagaagca aagcattgta tagatgtgaa 3240

tgggaggtca gatgagagga atatggtttt actagagctg gcaaggttgg ctttcaattt 3300

cctgcaatcc aagcaccaag aagaactgaa ggagctgtca agatggtgga aagacttggg 3360

tcttgcaaag aagctggaat tttctaggga tcggttggtt gaaaattact tatgggcagt 3420

gggaatcgct cccgagccca agttctccaa ctgcaggaaa gggctcacca aactcatctc 3480

cattttaaca gtgattgatg acatttacga tgtatatgga tcacttgatg aacttgaact 3540

cttcacagaa gctataaaga gatgggacat tgaggctttg gagactctac cagagtacat 3600

gaagatatgt tacttggcac tatttaactt tgttcatgaa gtttcctatg acacactcaa 3660

ggattatggg tggaacatct tacccttcat caaggaagag tgggaaaggc tatgtatgtc 3720

atatttggta gaagcaaaat ggtttggcaa aggcaataag ccaacccttg atgaatattt 3780

gagaaatggt tggatctcag tgggtggccc agtggcgatg gttcacgcct attttctcca 3840

agggcaacca atcgggaagg agtctatcaa ctttttatac aatggatcag agctcattta 3900

ttggtcttcg attgctactc gactcactga tgacttgggc acttctaagg ctgagatgaa 3960

gcgaggagat gtaccaaaag cagtcgagtg ccacatgatc cagacatgtg ggtcccatga 4020

agatgcacga gcgcacataa agggtctagt aagagattgt tggaagaaaa tgaatgagga 4080

atgcttggaa tgcagtcttt ctggtggtta tgtaaaaaca gttttgaaca tggttcgtac 4140

agcccaatgc atctaccaac atggagatgg tattggaact tcgactggag tgacccaaga 4200

tagagtcatc tcactgattt gtgagcccgt tccaagtcag tggccttga 4249

<210> 2

<211> 635

<212> PRT

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 2

Met Thr Ser Leu Phe His Phe Val Ala Cys Glu Phe His Gly Val His

1 5 10 15

Lys Arg Asn Val Ser Asn Arg Lys Arg Leu Leu Tyr Ile Thr Thr Ile

20 25 30

Ile Leu Leu Phe Leu His His Val Ile Ser Ser Ser Ser Phe Leu Gln

35 40 45

Ser Tyr Leu Lys Asn Met Ser Leu Ile Ile His Ser Leu Pro His Trp

50 55 60

Ser Arg Ile Pro Pro Arg Pro Pro Gln Leu Ser Gln Phe Gln Asn Ser

65 70 75 80

Ser Lys Pro Lys Pro Leu Ile Pro Val Gly Gln Val Gln Cys Asn Ala

85 90 95

Leu Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr His Pro Asn Ile Trp Asp

100 105 110

Pro Gln Tyr Ile Glu Ser Leu Thr Ser Pro Tyr Gly Gly Glu Cys Phe

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Glu Glu Leu Lys Phe Glu Ala Lys Arg Leu Leu Glu

130 135 140

Ala Thr Val Asp Pro Leu Ser Trp Leu Glu Leu Val Asp Ser Ile Gln

145 150 155 160

Arg Leu Gly Val Ala Tyr His Phe Glu Asp Glu Ile Lys Glu Gly Leu

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Gly Val Gly Ala His Val Gly His Asp Leu Cys Thr

180 185 190

Ala Ala Leu Gln Phe Arg Leu Leu Arg Gln Asn Gly Tyr Cys Val Thr

195 200 205

Pro Asp Ile Phe Asn Lys Phe Leu Glu Lys Asp Arg Thr Phe Lys Ala

210 215 220

Tyr Thr Ser Leu Asp Ala Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Thr Met Met His Gly Glu Glu Val Leu Glu Asp Ala Lys Glu Phe

245 250 255

Ser Val Lys His Leu Asn Arg Leu Met Gly Asn Leu Gln Ser Asn Leu

260 265 270

Arg Glu Gln Val Gln His Ala Leu Glu Met Pro Leu His Trp Arg Met

275 280 285

Pro Arg Leu Glu Ala Lys His Cys Ile Asp Val Asn Gly Arg Ser Asp

290 295 300

Glu Arg Asn Met Val Leu Leu Glu Leu Ala Arg Leu Ala Phe Asn Phe

305 310 315 320

Leu Gln Ser Lys His Gln Glu Glu Leu Lys Glu Leu Ser Arg Trp Trp

325 330 335

Lys Asp Leu Gly Leu Ala Lys Lys Leu Glu Phe Ser Arg Asp Arg Leu

340 345 350

Val Glu Asn Tyr Leu Trp Ala Val Gly Ile Ala Pro Glu Pro Lys Phe

355 360 365

Ser Asn Cys Arg Lys Gly Leu Thr Lys Leu Ile Ser Ile Leu Thr Val

370 375 380

Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Ser Leu Asp Glu Leu Glu Leu

385 390 395 400

Phe Thr Glu Ala Ile Lys Arg Trp Asp Ile Glu Ala Leu Glu Thr Leu

405 410 415

Pro Glu Tyr Met Lys Ile Cys Tyr Leu Ala Leu Phe Asn Phe Val His

420 425 430

Glu Val Ser Tyr Asp Thr Leu Lys Asp Tyr Gly Trp Asn Ile Leu Pro

435 440 445

Phe Ile Lys Glu Glu Trp Glu Arg Leu Cys Met Ser Tyr Leu Val Glu

450 455 460

Ala Lys Trp Phe Gly Lys Gly Asn Lys Pro Thr Leu Asp Glu Tyr Leu

465 470 475 480

Arg Asn Gly Trp Ile Ser Val Gly Gly Pro Val Ala Met Val His Ala

485 490 495

Tyr Phe Leu Gln Gly Gln Pro Ile Gly Lys Glu Ser Ile Asn Phe Leu

500 505 510

Tyr Asn Gly Ser Glu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Ile Ala Thr Arg Leu

515 520 525

Thr Asp Asp Leu Gly Thr Ser Lys Ala Glu Met Lys Arg Gly Asp Val

530 535 540

Pro Lys Ala Val Glu Cys His Met Ile Gln Thr Cys Gly Ser His Glu

545 550 555 560

Asp Ala Arg Ala His Ile Lys Gly Leu Val Arg Asp Cys Trp Lys Lys

565 570 575

Met Asn Glu Glu Cys Leu Glu Cys Ser Leu Ser Gly Gly Tyr Val Lys

580 585 590

Thr Val Leu Asn Met Val Arg Thr Ala Gln Cys Ile Tyr Gln His Gly

595 600 605

Asp Gly Ile Gly Thr Ser Thr Gly Val Thr Gln Asp Arg Val Ile Ser

610 615 620

Leu Ile Cys Glu Pro Val Pro Ser Gln Trp Pro

625 630 635

<210> 3

<211> 1908

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 3

atgacatctt tgtttcattt tgtagcatgt gaatttcatg gcgtccacaa gcggaacgtc 60

agcaacagga agcgactgct atatataact accataattc ttctctttct ccaccatgtt 120

atatctagtt ctagctttct acaatcctac ttgaagaaca tgagtttgat cattcattct 180

cttcctcatt ggtctagaat tccacctaga cctcctcaac tctctcaatt tcaaaactca 240

tccaagccca aacctctaat tccggtaggc caagtgcaat gcaacgcgct ccaaatcgcc 300

cgtcgatcag caaattatca cccaaacatt tgggaccccc aatatattga gtcgctaaca 360

agtccatatg gaggtgagtg ctttgggact cggcttgagg agttgaaatt cgaagccaaa 420

cggctactcg aagctaccgt agacccattg tcttggctag agctcgtcga ctcgatccaa 480

cggttagggg tggcatacca ctttgaggat gagatcaaag aaggccttga tggtgtttat 540

ggggttggcg cccacgtcgg ccatgatctt tgcactgcgg cattacagtt ccgacttctt 600

cgacaaaatg gttattgtgt tactccagac attttcaaca agtttttgga gaaggacagg 660

acattcaagg catacacaag ccttgatgca aaaggccttt tgagcctata tgaagcatca 720

tatactatga tgcatggtga ggaagtgttg gaagacgcca aagaatttag tgttaagcat 780

cttaaccgct tgatgggcaa cttacagagc aatctaagag agcaagtgca acatgcccta 840

gaaatgccct tgcattggag gatgccaagg ctagaagcaa agcattgtat agatgtgaat 900

gggaggtcag atgagaggaa tatggtttta ctagagctgg caaggttggc tttcaatttc 960

ctgcaatcca agcaccaaga agaactgaag gagctgtcaa gatggtggaa agacttgggt 1020

cttgcaaaga agctggaatt ttctagggat cggttggttg aaaattactt atgggcagtg 1080

ggaatcgctc ccgagcccaa gttctccaac tgcaggaaag ggctcaccaa actcatctcc 1140

attttaacag tgattgatga catttacgat gtatatggat cacttgatga acttgaactc 1200

ttcacagaag ctataaagag atgggacatt gaggctttgg agactctacc agagtacatg 1260

aagatatgtt acttggcact atttaacttt gttcatgaag tttcctatga cacactcaag 1320

gattatgggt ggaacatctt acccttcatc aaggaagagt gggaaaggct atgtatgtca 1380

tatttggtag aagcaaaatg gtttggcaaa ggcaataagc caacccttga tgaatatttg 1440

agaaatggtt ggatctcagt gggtggccca gtggcgatgg ttcacgccta ttttctccaa 1500

gggcaaccaa tcgggaagga gtctatcaac tttttataca atggatcaga gctcatttat 1560

tggtcttcga ttgctactcg actcactgat gacttgggca cttctaaggc tgagatgaag 1620

cgaggagatg taccaaaagc agtcgagtgc cacatgatcc agacatgtgg gtcccatgaa 1680

gatgcacgag cgcacataaa gggtctagta agagattgtt ggaagaaaat gaatgaggaa 1740

tgcttggaat gcagtctttc tggtggttat gtaaaaacag ttttgaacat ggttcgtaca 1800

gcccaatgca tctaccaaca tggagatggt attggaactt cgactggagt gacccaagat 1860

agagtcatct cactgatttg tgagcccgtt ccaagtcagt ggccttga 1908

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 4

ctacattgca tattaatgtt tctgccaa 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 5

gaggaggtct aggtggaatt ctagacca 28

Claims

1.一种樟树芳樟醇合成酶，其特征在于，所述芳樟醇合成酶基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述芳樟醇合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种樟树芳樟醇合成酶，其特征在于，所述芳樟醇合成酶基因的开放阅读框序列为如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

3.一种用于鉴定芳樟型樟树的分子标记，其特征在于，所述分子标记命名为WZF01，其引物信息为WZF01-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

WZF01-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求3所述的一种用于鉴定芳樟型樟树的分子标记的应用，其特征在于，包含以下步骤：

1）提取待检测不同化学型樟树个体基因组DNA；

2）以各个体基因组DNA为模板、利用WZF01引物进行PCR扩增；

3）当扩增所得目的条带约1200 bp左右时，判断其为芳樟型樟树。

5.根据权利要求4所述的一种用于鉴定芳樟型樟树的分子标记的应用，其特征在于，所述的PCR反应体系如下：

2×Green Taq Mix 10 μL

WZF01-F（10 µM） 1 μL

WZF01-R（10 µM） 1 μL

模板DNA 5 μL

加ddH₂O to 20 μL

所述的PCR程序为: 98℃预变性2 min：98℃变性10 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。