CN117210609B - 一种鉴别白花竹叶兰的引物对、试剂盒和鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴别白花竹叶兰的引物对、试剂盒和鉴别方法，涉及基因工程技术领域，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过对竹叶兰DFR基因CDS序列第330bp后的序列设计引物，并对基因组DNA进行检测，开发了竹叶兰花色关联的分子标记，可用于白花竹叶兰的鉴定，并成功将白花竹叶兰与其他粉色系和紫色系的竹叶兰区分开，为竹叶兰的分子标记辅助选择提供了一个新的引物对。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种鉴别白花竹叶兰的引物对、试剂盒和鉴别方法。
背景技术
竹叶兰是兰科竹叶兰属多年生的草本植物，分布于我国的福建、广东、广西、贵州、海南、湖南、四川、台湾、西藏、云南，以及印度、柬埔寨、缅甸、印度尼西亚、马来西亚、新加坡等南亚和东南亚国家。竹叶兰有较高的药用价值，是傣族“雅解片”的主要药材来源，具有清热解毒、消炎利尿、祛风活络的功能；同时竹叶兰也具有较高的观赏价值，其植株清新雅致，花朵秀丽，全年可多次开花，花期长，适应性强，在马来西亚、新加坡等地被大力开发成为一种新花卉作物广泛用于园林绿化。因竹叶兰地生、喜阳的特性，可直接种植于露天的地上，近年来我国也开始将其作为地被植物可应用于高档的园林景观，种植于公园、庭院、别墅小区及兰花专类观赏园，或作为盆栽可置于案头、阳台、庭院等。
花色是竹叶兰的重要观赏性状，直接影响其商业价值。目前竹叶兰有紫色、淡紫色、粉红、淡粉和白色等多种花色，市场上的种苗多以淡紫色和粉色为主，白色花较少。前人对竹叶兰的研究主要集中于其药用成分与药理活性方面，也克隆了调控竹叶兰开花的关键FT基因，而有关竹叶兰花色则研究甚少，也未见与竹叶兰花色关联的分子标记的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鉴别白花竹叶兰的引物对、试剂盒和鉴别方法，采用本发明提供的引物对能够鉴别出白花竹叶兰。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种鉴别白花竹叶兰的引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种鉴别白花竹叶兰的方法，包括以下步骤：
1)提取竹叶兰的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，经上述技术方案所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当缺失393bp的条带，且出现500bp和950bp两条带时，所述竹叶兰为白花竹叶兰。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的程序为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃15s，35个循环；72℃5min。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的体系每20μl为：基因组DNA2μl、2×Rapid TaqMaster Mix 10μl、浓度为10μM的上游引物1μl、浓度为10μM的下游引物1μl和ddH2O 6μl。
优选的，所述步骤2)琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量百分含量为1％。
本发明还提供了一种鉴别白花竹叶兰的试剂盒，其特征在于，包括上述技术方案所述的引物对。
本发明的有益效果为：
本发明通过对竹叶兰DFR基因CDS序列第330bp后的序列设计引物，并对基因组DNA进行检测，开发了竹叶兰花色关联的分子标记，可用于白花竹叶兰的鉴定，并成功将白花竹叶兰与其他粉色系和紫色系的竹叶兰区分开，为竹叶兰的分子标记辅助选择提供了一个新的引物对。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为紫花竹叶兰(上排)和白花竹叶兰(下排)花朵的3个发育时期图，标尺为1厘米；
图2紫花竹叶兰和白花竹叶兰DFR基因的RT-qPCR验证结果；
图3三种不同质量百分含量的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中(a)1％琼脂糖凝胶，(b)1.5％琼脂糖凝胶,(c)1.8％琼脂糖凝胶；
图4引物对16份不同花色竹叶兰的鉴定结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴别白花竹叶兰的引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：
SEQ ID No.1：5’-TACGTGGCTGTATTGGGGTG-3’；
SEQ ID No.2：5’-TGATCCCTCACAACGCAAATTC-3’。
在本发明中，所述引物对的设计思路为：
紫花竹叶兰和白花竹叶兰的DFR基因CDS序列如下：
紫花竹叶兰DFR基因的CDS序列SEQ ID No.3：
ATGAAAGAAGAAAAAATGGCGGGAGAGGGAAAGGGTGGGAAGAATGAGAAGAAGGGTCCAGTAGTGGTGACTGGAGCCGGTGGTTACGTGGGTTCATGGCTGGTGATGAAGCTTCTTCAACAGGGTTATGAGGTCAGAGCTACAGTCAGAGATCCAACAAATCGTAAAAAAGTGAAGCCGTTGTTGGATCTCCCGCGCTCTAAGGAACTGCTCAGCATTTGGAAAGCAGACCTAGATGACATCCAAGGGACCTTCGATGAGGTGATACGTGGCTGTATTGGGGTGTTCCACGTCGCCACTCCCATGAATTTTGAATCCGAAGACCCTGAGAATGAAGTGATCAAACCGGCAGTCAACGGTTTATTGGACATCTTGAGGTCTTGCAAAAAGGCCGGCAGTGTGAAGCGAGTGGTATTCACATCTTCCGCAGGAACAGTCAATATGGAGGAACACCCAAAAGCGGTGTATGATGAGGCCTCATGGAGTGACGTCGACTTTGTCAGGCGTGTCAAGATGACCGGTTGGATGTACTTCGCATCAAAAACACTTGCTGAGAAGGCTGCTTGGGAGTTTGTCAAGGATAATGACATGCATTTCATAACCATCATTCCAACTTTGGTGGTGGGTTCCTTCATAACATCTGAAATGCCACCGAGTATGATCACTGCATTATCATTAATTACAGGAAATGAAGCCCATTACTCAATAATAAAGCAAGGTCAATTTGTTCATTTAGATGACTTATGTGATGCTCACATTTTCCTTTTTGAGCATCCCAAAGCCGACGGTAGATACATTTGCTCTTCCGATGACGCAACAATTTATGACTTAGCAAAAATGATGAAGAAAAGATATGCCACATATGCCATTCCTCAGAAGTTTAAGGGAATTGATCCAAATATTAAGAGTGTAAGCTTCTCTTCTAAGAAGTTGATGGAGCTTGGGTTTAAGTATAAGCACACCATGGAGGAGATGTTTGATGATGCAATTAAGACCAGCAGGGCTAAGAAGCTCATACCACTCAGCACAGAGGAAATAGCCTTAGCTGCTGAGAAATTTGCATAA。
白花竹叶兰DFR基因的CDS序列SEQ ID No.4：
ATGAAAGAAGAAAAAATGGCGGGAGAGGGAAAGGGTGGGAAGAATGAGAAGAAGGGTCCAGTAGTGGTGACTGGAGCCGGTGGTTACGTGGGTTCATGGCTGGTGATGAAGCTTCTTCAACAGGGTTATGAGGTCAGAGCTACAGTCAGAGATCCAACAAATCGTAAAAAAGTGAAGCCGTTGTTGGATCTCCCGCGCTCTAAGGAACTGCTCAGCATTTGGAAAGCAGACCTAGATGACATCCAAGGGACCTTCGATGAGGTGATACGTGGCTGTATTGGGGTGTTCCACGTCGCCACTCCCATGAATTTTGAATCCGAAGACCCTGAGTTTATCCA。
经进一步分析，白花竹叶兰DFR基因的CDS序列由于在330bp后有大片段插入序列而导致DFR基因功能缺失，可利用紫花竹叶兰DFR基因330bp后的CDS序列设计并筛选合适的引物，具有成本低、操作简单、准确性高等优点。
本发明还提供了一种鉴别白花竹叶兰的方法，包括以下步骤：
1)提取竹叶兰的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，经上述技术方案所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当缺失393bp的条带，且出现500bp和950bp两条带时，所述竹叶兰为白花竹叶兰。
本发明提取竹叶兰的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，经上述技术方案所述的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。
本发明对提取竹叶兰的基因组DNA的方法没有特殊限定，采用常规提取试剂盒提取即可。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃15s，35个循环；72℃5min。在本发明中，所述PCR扩增的体系每20μl优选为：基因组DNA2μl、2×Rapid Taq MasterMix 10μl、浓度为10μM的上游引物1μl、浓度为10μM的下游引物1μl和ddH2O 6μl。
本发明将得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当缺失393bp目的条带，且出现约500bp和950bp两条带时，所述兰花为白花竹叶兰。在本发明中，所述琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量百分含量优选为1％。
本发明还提供了一种鉴别白花竹叶兰的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物对。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)以紫花竹叶兰和白花竹叶兰的花朵为材料，将花朵分为花苞期(S1)、显色期(S2)和盛开期(S3)三个时期(图1)，分别将两种花色竹叶兰的3个时期的花朵样品，按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)的方法提取RNA。
(2)将RNA样品送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行转录组测序，并进行比较分析和基因功能注释，然后筛选与花青素生物合成相关的差异基因。
(3)依据步骤(2)获得的花青素生物合成基因DFR的转录本序列，设计RT-qPCR定量引物，引物的核酸序列如下所示。
DFR-q-F SEQ ID No.5：5’-GGCTGTATTGGGGTGTTCCA-3’；
DFR-q-R SEQ ID No.6：5’-ATAAACCGTTGACTGCCGGT-3’。
(4)以步骤1的RNA为模板，采用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)反转录成cDNA。
(5)用步骤(2)中的引物，利用TaqPro Universal SYBR qPCRMasterMix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)试剂盒进行RT-qPCR分析，以β-actin为内参基因。结果如图2所示，发现DFR基因仅在紫花竹叶兰的3个时期中表达，而在白花竹叶兰的3个时期中均不表达。DFR基因是花青素合成过程中的重要结构基因，在DFR基因在白花竹叶兰中不表达，说明DFR基因与其白色花的形成密切相关。
实施例2
(1)以实施例1步骤(3)中的DFR基因的转录本序列为模板，设计引物扩增竹叶兰DFR基因的全长CDS序列，扩增引物的核酸序列如下所示：
DFR-CDS-F SEQ ID No.7：5’-CCTCCAGTGTGTGAGCTGAA-3’；
DFR-CDS-R SEQ ID No.8：5’-AAGCCATAAGTAAAAGCCCACT-3’。
(2)以实施例1步骤(4)中的cDNA为模板，按照本实施例步骤(1)中的引物进行PCR扩增，反应产物胶回收纯化，利用5min TM TA/Blunt-Zero Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)连接克隆载体，转化感受态大肠杆菌，获得阳性单克隆。
(3)单克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果用SnapGene软件进行比对，发现紫花竹叶兰中含有正常且完整的DFR基因序列，而白花竹叶兰的DFR基因的CDS序列仅有330bp能与紫花竹叶兰DFR基因的CDS序列比对上，其后的序列则完全比对不上。DFR编码区的序列缺失导致白花竹叶兰的DFR基因失去功能，从而不能合成花青素。其中，紫花竹叶兰和白花竹叶兰的DFR基因CDS序列如下：
紫花竹叶兰DFR基因的CDS序列：
ATGAAAGAAGAAAAAATGGCGGGAGAGGGAAAGGGTGGGAAGAATGAGAAGAAGGGTCCAGTAGTGGTGACTGGAGCCGGTGGTTACGTGGGTTCATGGCTGGTGATGAAGCTTCTTCAACAGGGTTATGAGGTCAGAGCTACAGTCAGAGATCCAACAAATCGTAAAAAAGTGAAGCCGTTGTTGGATCTCCCGCGCTCTAAGGAACTGCTCAGCATTTGGAAAGCAGACCTAGATGACATCCAAGGGACCTTCGATGAGGTGATACGTGGCTGTATTGGGGTGTTCCACGTCGCCACTCCCATGAATTTTGAATCCGAAGACCCTGAGAATGAAGTGATCAAACCGGCAGTCAACGGTTTATTGGACATCTTGAGGTCTTGCAAAAAGGCCGGCAGTGTGAAGCGAGTGGTATTCACATCTTCCGCAGGAACAGTCAATATGGAGGAACACCCAAAAGCGGTGTATGATGAGGCCTCATGGAGTGACGTCGACTTTGTCAGGCGTGTCAAGATGACCGGTTGGATGTACTTCGCATCAAAAACACTTGCTGAGAAGGCTGCTTGGGAGTTTGTCAAGGATAATGACATGCATTTCATAACCATCATTCCAACTTTGGTGGTGGGTTCCTTCATAACATCTGAAATGCCACCGAGTATGATCACTGCATTATCATTAATTACAGGAAATGAAGCCCATTACTCAATAATAAAGCAAGGTCAATTTGTTCATTTAGATGACTTATGTGATGCTCACATTTTCCTTTTTGAGCATCCCAAAGCCGACGGTAGATACATTTGCTCTTCCGATGACGCAACAATTTATGACTTAGCAAAAATGATGAAGAAAAGATATGCCACATATGCCATTCCTCAGAAGTTTAAGGGAATTGATCCAAATATTAAGAGTGTAAGCTTCTCTTCTAAGAAGTTGATGGAGCTTGGGTTTAAGTATAAGCACACCATGGAGGAGATGTTTGATGATGCAATTAAGACCAGCAGGGCTAAGAAGCTCATACCACTCAGCACAGAGGAAATAGCCTTAGCTGCTGAGAAATTTGCATAA。
白花竹叶兰DFR基因的CDS序列：
ATGAAAGAAGAAAAAATGGCGGGAGAGGGAAAGGGTGGGAAGAATGAGAAGAAGGGTCCAGTAGTGGTGACTGGAGCCGGTGGTTACGTGGGTTCATGGCTGGTGATGAAGCTTCTTCAACAGGGTTATGAGGTCAGAGCTACAGTCAGAGATCCAACAAATCGTAAAAAAGTGAAGCCGTTGTTGGATCTCCCGCGCTCTAAGGAACTGCTCAGCATTTGGAAAGCAGACCTAGATGACATCCAAGGGACCTTCGATGAGGTGATACGTGGCTGTATTGGGGTGTTCCACGTCGCCACTCCCATGAATTTTGAATCCGAAGACCCTGAGTTTATCCA。
经进一步分析，白花竹叶兰DFR基因的CDS序列由于在330bp后有大片段插入序列而导致DFR基因功能缺失，可利用紫花竹叶兰DFR基因330bp后的CDS序列设计并筛选合适的引物，并直接提取待测样品基因组DNA来检测竹叶兰品种、无性系或单株的花色，具有成本低、操作简单、准确性高等优点。
实施例3
(1)以16份正在开花的竹叶兰植株为验证的样品材料，其中1、2号植株为白色花，3-7号植株为淡粉色花，8、9号植株为粉色花，10-16号植株为紫色花。剪取它们的新鲜叶片，利用多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA。
(2)依据实施例2中DFR基因CDS序列330bp后的序列，设计引物扩增竹叶兰DFR基因片段，其中扩增的引物的核酸序列如下所示：
引物1 5’-TACGTGGCTGTATTGGGGTG-3’
引物2 5’-TGATCCCTCACAACGCAAATTC-3’
(3)采用引物1和引物2扩增上述16份竹叶兰DNA样品的DFR基因片段，其中Tag酶购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，按照说明书进行，PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增条件为：95℃3min,(95℃15s，55℃15s，72℃15s)×35个循环，72℃5min。
表1PCR扩增体系
| DNA | 2μL |
| 2×RapidTaqMasterMix | 10μL |
| 引物1(10μM) | 1μL |
| 引物2(10μM) | 1μL |
| 无菌水 | 6μL |
(4)随机选取1、2、8、10和11号共5个不同花色样品的PCR扩增产物，分别进行质量百分含量为1％、1.5％和1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。由图3可以看出，编号为M的泳道对应Marker，编号为1和2的泳道分别对应1、2号白花竹叶兰植株，编号为3、4、5的泳道分别对应8、10和11号粉色花和紫色花竹叶兰植株。3种浓度的琼脂糖凝胶电泳都能将白花竹叶兰与其他花色竹叶兰区分开，效果差异不大，但由于1％的浓度成本更低，且电泳速度更快，所以优选1％浓度的琼脂糖凝胶。
(5)将16份样品扩增获得的PCR产物直接进行质量百分含量为1％琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。由图4可以看出，编号1-2号泳道对应1-2号白花竹叶兰植株，编号3-16泳道对应3-16号淡粉色花、粉色花和紫色花的竹叶兰，淡粉色、粉色和紫色花的竹叶兰都有大小为393bp目的条带，而2个白花竹叶兰没有393bp目的条带，而存在约500bp和950bp的两条带。该引物对能够将白花竹叶兰与其他花色的竹叶兰区分开，可作为鉴别白花竹叶兰的有效的分子标记。
本发明通过对竹叶兰DFR基因CDS序列第330bp后的序列设计引物，并对基因组DNA进行检测，开发了竹叶兰花色关联的分子标记，可用于白花竹叶兰的鉴定，并成功将白花竹叶兰与其他粉色系和紫色系的竹叶兰区分开，为竹叶兰的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种鉴别白花竹叶兰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取竹叶兰的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，经引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述竹叶兰的DFR基因CDS序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当缺失393bp的条带，且出现两条带时，所述竹叶兰为白花竹叶兰。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的程序为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃15s，35个循环；72℃5min。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的体系每20μl为：基因组DNA2μl、
2×Rapid TaqMasterMix 10μl、浓度为10μM的上游引物1μl、浓度为10μM的下游引物1μl和ddH2O 6μl。
4.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2)琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量百分含量为1％。
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| CN101668420A (zh) * | 2007-04-26 | 2010-03-10 | 石原产业株式会社 | 花色改变了的蝴蝶兰属植物的制造方法 |
| CN104388569A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-03-04 | 贵阳中医学院 | 一组pcr鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法 |
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