CN108384885B - 一种香樟ssr引物组合及其品种鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香樟SSR引物组合物及其品种鉴定方法，用于香樟品种的快速分子检测与鉴定，属于植物新品种分子鉴定领域。本发明设计了4对SSR引物，并利用它们成功构建了11个香樟品种指纹图谱，可快速、准确地区分各香樟品种。本发明基于4对SSR引物，进行一次PCR扩增反应，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，利用引物组合法，可直接根据产物的片段进行判断。本发明可直接应用于香樟不同品种的分子鉴定，具有很好的实用性。
Description
技术领域
本发明属于植物新品种鉴定技术领域，涉及一种香樟SSR引物组合物及其品种检测方法，专用于不同香樟品种的分子检测和鉴定。
背景技术
香樟(Cinnamomum camphora)是樟科樟属的常绿阔叶大乔木，是国家II级重点保护植物。香樟生长迅速，树冠开展，树形美观，可作绿化行道树，或栽植为园景树。樟籽含有丰富的油脂，可以直接应用于化妆品中；叶片含有的樟油，可用来提炼樟脑或制成化学原料；木材具有耐腐蚀、密度高、带有浓郁香气的特质，是制作家具和木材雕刻艺术品上佳材料，深受人们的青睐。同时，除具有材性优良、冠型优美等特点外，叶片中富含的次生代谢物具有一定药用价值，故香樟是我国珍贵用材树种和经济树种。香樟“赣彤”为江西省科学院生物资源研究所选育的红杆香樟，主要表现为茎杆全年为红色，且叶色随着季节产生变化；“霞光”为浙江宁波市林业局林特种苗繁育中心的红叶樟树，春天时叶片外红里白，夏天时变成外白里红。
简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)，又称为微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸串联重复数次组成的核苷酸序列。其长度一般在100bp以下，广泛分布于植物基因组内，而重复次数的不同及重复程度的不完全则赋予SSR位点丰富的多态性。同时，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富等优点，是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传结构、不同品种分子鉴定的理想工具。然而，SSR标记在香樟品种分类和鉴定方面的应用尚未见报道，故现需建立一种快速、准确鉴定香樟品种的分子手段，以更好的保护和利用香樟品种资源。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种香樟SSR分子检测引物组合物，克服以往香樟品种鉴定方法存在的缺陷，提供准确可靠、易于操作、灵敏度高的分子检测方法。本发明的另一目的是提供一种使用香樟品种分子检测引物组合物快速检测香樟品种方法，该方法可以直接应用于生产实践，对于香樟苗木的鉴定具有十分重要的意义。
技术方案：为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种香樟品种分子鉴定引物组合物，由4对引物组成，其引物序列如下表所示：
应用所述的香樟品种分子检测引物组合物构建香樟品种指纹代码，所获得的11个香樟品种对应指纹代码如下表所示：
一种应用所述的引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA
2)使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依次对待测香樟样本进行PCR扩增；
3)PCR产物则利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测，依据扩增产物的有无和大小进行判读，对照品种指纹代码，鉴定待测样品的品种。
步骤1)中，利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒完成待测样品DNA提取。
步骤2)中，10μL PCR扩增反应体系包括：1μ10×Buffer；0.75mM MgCl2；0.025mMdNTPs；1U Taq DNA聚合酶；0.4μM SSR引物和30ng DNA模板。
步骤2)中，PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm 58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。
步骤3)中，依据待测样品PCR产物判读情况，对照品种指纹代码，鉴定待测样品。
所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，香樟品种共计为11个，分别为：赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的优势：
1)结果高度准确、可靠：本发明所用香樟材料来自江西，为香樟的主要生产区，并利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100％准确，为检测结果提供了高度的可靠性。
2)操作简便快速：本方法提取样本DNA后，进行PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳后即可以判断结果，一般整个检测过程可在6个小时内完成。
3)取材方便、实用价值明显：本方法采样方便，叶片、芽、花等组织或器官均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点、取样部位等因素的限制。
4)通过对香樟苗木进行分子鉴定可以避免苗木生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于香樟不同品种的苗木生产与销售具有十分重要的经济效益。
附图说明
图1是第1对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号；
图2是第2对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号；
图3是第3对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号；
图4是第4对SSR引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
采用Illumina HiSeq 2500测序平台，对香樟叶片DNA进行测序得到香樟转录组序列，利用MISA软件对所得序列进行SSR位点的寻找，随机挑选100个SSR位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，有74对引物能够稳定扩增。从香樟品种材料中随机选取6个个体对可稳定扩增的74对SSR引物进行多态性检测，最后获得了21对转录组SSR多态引物；随后，从中选取多态性表现良好，且条带清晰的7对SSR引物，11个香樟品种进行PCR扩增。应用POPGENE进行相关遗传参数计算，依据PIC值(多态性信息含量)、Shannon多样性指数以及Na值，最终选择4对扩增稳定、多态性好、重复性高的引物进行排列组合，构建指纹代码。该4对SSR引物即为本发明的香樟分子检测引物组合物，其引物序列及最佳退火温度如表1所示。
表1香樟品种分子检测引物
实施例2
应用实施例1的香樟品种分子检测引物组合物构建香樟品种指纹代码，简要构建过程如下：
1)PCR扩增及产物检测：利用实施例1筛选出的4对多态性SSR引物对11个香樟品种进行PCR扩增。所得产物利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测。10μL反应体系中包括：1μ10×Buffer；0.75mM MgCl2；0.025mM dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；0.4μM SSR引物和30ng DNA模板。PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm 58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。
2)数据处理：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果读取采用大写英文字母表示，同一对引物而言，对不同模版的扩增产物会因其片段大小的不同而在电泳过程中表现为迁移速度的不同，在相同时间内，移动到同一位置的若干条带便认为是同一个等位基因。依据条带大小从大到小依次用字母A、B、C、D等表示。
图1、2、3、4分别为本实施例中的4对SSR引物利用相同模板进行扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图。各泳道从左往右依次分别为赣彤1号、赣彤2号、赣彤3号、赣彤4号、赣彤5号、赣彤6号、赣彤7号、赣彤8号、霞光1号、霞光2号、霞光3号。根据凝胶电泳图中SSR分型结果，对所有基因型进行判读，并转换成指纹代码。
3)指纹代码构建：该4对SSR引物即为本发明的香樟品种分子检测引物组合物，其引物序列及最佳退火温度如表1所示；所构建11个香樟品种指纹代码如表2所示。
表211个香樟品种对应的SSR指纹代码
注：代码中数字为引物序号，对应于表1相同序号所示序列，同一数字后相同字母代表同一等位基因。
实施例3
应用实施例1香樟品种分子检测引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，包括以下步骤：
1)待测香樟品种的DNA提取，利用上海生工生物工程股份有限公司的Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒完成。
2)按照如下的PCR反应体系和反应程序据表1的引物顺序依次进行PCR扩增，直至完成鉴定。
PCR的反应体系10μL，包括模板DNA 0.6μL(30ng)、10×Buffer 1μL、2.5mM dNTPs0.1μL(TAKARA公司)、25mM MgCl20.3μL、10μM F-primer 0.4μL(南京金斯瑞生物科技有限公司)、10μM R-primer 0.4μL(南京金斯瑞生物科技有限公司)、Taq酶0.2μL(TAKARA公司)、ddH2O7μL；
PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm 58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存；所用PCR仪APPLIEDBIOSYSTEMS GeneAmp PCR system 9700。
3)对PCR产物加5μL溴酚蓝缓冲液，上样量为1μL，进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(500mL 8％丙烯酰胺含尿素210g，甲叉1g，丙烯酰胺39g，10×TBE50mL)，120V电压下电泳120min，所用电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYCZ-30A型垂直电泳仪。
4)电泳完成后进行固定染色，固定10min(固定液10％乙醇，0.5％乙酸)，ddH2O漂洗2次每次2min；再用0.15％硝酸银染色7min，ddH2O漂洗2次每次2min，最后显影(1.5％氢氧化钠，0.00756％四硼酸钠，1％甲醛)至条带清晰，然后对扩增产物进行大小判断，并拍照记录。
5)根据不同样品在凝胶电泳图上呈现出的结果，转制成指纹代码，用于后续鉴定。
选择10个香樟样品(3个已知品种和7个香樟古树)，进行鉴定验证，具体鉴定结果如表3所示。
表3 10个香樟样品鉴定结果
| 样品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 鉴定结果 |
| 赣彤1号 | BD | AD | AA | AA | 赣彤1号 |
| 霞光1号 | AB | DD | AA | BB | 霞光1号 |
| 霞光2号 | BC | DD | AA | AA | 霞光2号 |
| 香樟古树1 | BC | AD | AA | AB | 可以区分 |
| 香樟古树2 | AD | AB | AA | AB | 可以区分 |
| 香樟古树3 | BD | DD | BB | AA | 可以区分 |
| 香樟古树4 | AD | AD | AA | AA | 可以区分 |
| 香樟古树5 | DD | AA | AA | AB | 可以区分 |
| 香樟古树6 | BB | AD | AA | AA | 可以区分 |
| 香樟古树7 | AB | BD | AA | AB | 可以区分 |
可见，本发明中的引物组合物可准确鉴定出霞光和赣彤品种，同时，仅需前2对引物便可将7个香樟古树相互区分开。
实施例4
从实施例1中开发的多态性良好，条带清晰的SSR引物中挑出剩余的3对引物，具体引物信息如表4所示，对11个品种进行鉴定，鉴定方法同实施例3。
表4剩余3对引物信息
鉴定结果表5所示，选取的3对引物无法将各品种区分开来，无法完成鉴定工作。
表5利用剩下的3对引物对11个品种的鉴定结果
| 品种名称 | Cc_eSSR5 | Cc_eSSR6 | Cc_eSSR7 |
| 赣彤1号 | BB | AB | |
| 赣彤2号 | BB | BB | AB |
| 赣彤3号 | BB | BB | AA |
| 赣彤4号 | BB | BB | AB |
| 赣彤5号 | BB | BB | AB |
| 赣彤6号 | BB | BB | AB |
| 赣彤7号 | EE | AB | AB |
| 赣彤8号 | DE | BB | BB |
| 霞光1号 | DE | AB | AB |
| 霞光2号 | DE | BB | BB |
| 霞光3号 | AC | BB | BB |
Claims (6)
1.一种香樟品种分子鉴定引物组合物，其特征在于，由4对引物组成，其引物序列如下表所示：
。
2.一种应用权利要求1所述的引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测样品DNA；
2）使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依次对待测香樟样本进行PCR扩增；
3）PCR产物则利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测，依据扩增产物的有无和大小进行判读，对照品种指纹代码，鉴定待测样品的品种。
3.根据权利要求2所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，步骤1）中，利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒完成待测样品DNA提取。
4.根据权利要求2所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，步骤2）中，10µL PCR扩增反应体系包括：1µ 10×Buffer；0.75mM MgCl2；0.025mM dNTPs；1U TaqDNA聚合酶；0.4μM SSR引物和30ng DNA模板。
5.根据权利要求2所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，步骤2）中，PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳Tm 58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。
6.根据权利要求2所述的应用引物组合物快速鉴定香樟品种的方法，其特征在于，步骤3）中，依据待测样品PCR产物判读情况，对照品种指纹代码，鉴定待测样品。
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