CN107557362B - 一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法 - Google Patents
一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法。本发明根据马尾松叶绿体基因组设计获得16对cpSSR引物，进一步从中筛选出差异较为稳定、多态性好的7对引物，并利用它们成功构建了8种松树近缘种的指纹图谱及系统进化树。本发明基于7对cpSSR引物，进行一次PCR扩增反应，并利用毛细管电泳技术对PCR产物进行分析，可准确鉴定8种松树近缘种树，具有高效、准确、方便、不易受环境影响的特点。本发明所述的多态性引物及其鉴定方法能够反映8种松树细胞质基因组的遗传信息，可用于8种松树近缘种的鉴定以及亲缘关系鉴定等研究。
Description
技术领域
本发明属于林木分子生物学技术领域，特别涉及马尾松叶绿体微卫星分子标记(cpS SR)的多态性引物及其在8个松树近缘种鉴定中的应用。
背景技术
松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物是裸子植物中的重要类群，是世界上分布最广且最具有经济价值的树种之一。在中国，松属植物种类繁多，约有22种，分布范围广泛，在中国的林业生产和生态绿化中发挥着极为重要的作用。此外，中国先后从国外引进了一些重要的松属用材树种，包括火炬松(P.taeda)、湿地松(P.elliottii)、加勒比松(P.caribaea)等等。这些丰富的资源为我国松树遗传育种研究的开展提供了重要的物质基础。
对松树种质资源的准确区分与鉴定是进行良种选育和遗传改良的基础。在传统的松树种质资源鉴定的过程中，均采用松树的细胞核DNA的SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)分子标记法鉴定不同松树树种之间的在分子水平上的差异。SSR又叫微卫星DNA，指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广发分布于基因组的不同位置。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(highperformance c apillary electrophoresis，HPCE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动的新型液相分离技术。它可以满足生命科学领域大分子、小分子分离分析的要求。与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，具有分辨率高(分辨率高达2bp)操作简单、重复性好和易清洗、样品用量少、分析速度快等优点。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：现有技术对松树种质资源区分和亲缘关系鉴定的方法仅针对于松树的细胞核DNA，由于植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，而现有技术中少有记载有针对松树细胞核DNA外的其他物质用于松树的种质资源区分以及亲缘关系鉴定，因此仅采用细胞核DNA鉴定方法并不全面。此外，传统的松树遗传分析技术中，用于检测PCR产物最常用的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该方法要经过电泳、固定、银染、显色、冲洗等步骤，其技术难度较大，实验程序复杂，且在银染过程中要接触到硝酸银等有毒化学试剂，对实验人员安全有一定危害。该方法理论上虽然可以达到5bp的分离率，但实际操作中难以实现，且不能准确读出片段大小，只能人为粗略估计，对长度小于50bp的扩增片段也无法分析。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种马尾松cpSSR多态性引物，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述马尾松cpSSR多态性引物的松树近缘种鉴定方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
马尾松cpSSR多态性引物，包括7对引物，其引物序列如下表所示：
利用所述的马尾松cpSSR多态性引物构建出的松树近缘种的指纹图谱。
所述的指纹图谱，如下表所示：
所述的马尾松cpSSR多态性引物在松树近缘种鉴定中的应用。
所述的应用：所述的松树近缘种有8种，分别为马尾松、黄山松、云南松、油松、白皮松、华山松、湿地松、加勒比松。
所述的应用，包括以下步骤：
1)待测样品DNA提取；
2)利用权利要求1所述的马尾松cpSSR多态性引物进行PCR；
3)对PCR产物进行毛细管电泳，以毛细管电泳结果与权利要求2所述的指纹图谱进行对比，鉴定出结果。
所述的应用，10μL PCR反应体系包括：10×PCR Buffer；0.25mM dNTP；2.5m MMgCl2；0.3mM马尾松cpSSR引物；0.5U Taq DNA聚合酶和50ng DNA模版。
所述的应用，PCR扩增程序为：预变性94℃5min；25循环的94℃30s，退火30s，72℃40s；延伸72℃5min。
有益效果：本发明实施例提供的技术方案带来的由于叶绿体是植物细胞质中特有的细胞器，故叶绿体基因组的序列变异有助于植物细胞质基因型的区分，针对马尾松叶绿体基因组上的DNA序列筛选出来的叶绿体微卫星分子标记，该叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，此外，松树的叶绿体为父性遗传，父性遗传使叶绿体的DNA具有单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，使得叶绿体微卫星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，同时，叶绿体微卫星分子标记主要位于叶绿体基因组的非编码区，而叶绿体DNA的非编码区序列在种内或种群间也存在遗传变异，使得该松树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能够全面地反映松树的遗传信息，使得本发明提供的鉴定松树遗传多样性的方法能够准确、全面地反应松树的遗传多样性，同时，也能够使得发明提供的鉴定松树亲缘关系的方法能够更全面。加上毛细管电泳技术高分辨率的特性，使得利用叶绿体微卫星分子标记鉴定8种松树亲缘关系的方法更加准确可靠。
附图说明
图1是本发明依据7种引物做出的8种松树近缘种的系统进化树图；
图2是依据PowerMarkerversion 3.25数据处理格式做出的部分毛细管电泳数据汇总结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
马尾松叶绿体微卫星分子标记多态性引物(cpSSR)的获得：过程如下：
1)叶绿体微卫星分子标记的多态性引物筛选
从GenBank公共数据库中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载马尾松(P.massioniana)叶绿体基因组序列(MF564195)，利用MicroSAtellite(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/mi sa.hrml)(Thiel T,Michalek W,Varshney R K,etal.Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley(Hordeumvulg are L.).[J].Theoretical&AppliedGenetics,2003,106(3):411-422.)对马尾松叶绿体基因组序列进行分析，筛选叶绿体微卫星分子序列。
2)叶绿体分微卫星分子标记的引物设计
基于上述所获得的叶绿体微卫星分子序列，利用引物设计软件Primer3(https:// sour ceforge.net/projects/primer3/)(Koressaar T,Remm M.Enhancements andmodifications o f primer design program Primer3.[J].Bioinformatics,2007,23(10):1289-91)分析微卫星分子的侧翼序列并进行引物设计。主要参数设置为：引物长18-24bp，引物退火温度50-60℃,前后引物退火温度之差避免超过2℃；GC含量40％-60％；预期产物长100-400bp。避免错配、引物二聚体或发夹结构的出现。设计出16对马尾松cpSSR引物，并在这16对引物中筛选出7对用于本发明的cpSSR多态性引物，如表1所示。
表1马尾松叶绿体微卫星分子标记引物
其中：F代表前引物；R代表后引物。
实施例2
应用实施例1中的7对马尾松cpSSR的构建8种松树近缘种的指纹图谱，用于构建指纹图谱的8种松树的样品信息以及取样数量如表2所示。
表2 8种松树的样品信息以及取样数量
| 树种 | 取样数量 | 采集地点 | 经纬度 |
| 马尾松 | 15 | 福建漳平 | 25°13.78′N,117°32.25′E |
| 黄山松 | 15 | 安徽黄山 | 30°13.23′N,118°10.13′E |
| 云南松 | 15 | 广西南宁 | 22°84.13′N,108°29.32′E |
| 油松 | 15 | 陕西汉中 | 32°83.32′N,106°25.65′E |
| 白皮松 | 15 | 陕西汉中 | 32°83.32′N,106°25.65′E |
| 华山松 | 15 | 陕西汉中 | 32°83.32′N,106°25.65′E |
| 湿地松 | 15 | 福建漳平 | 25°13.78′N,117°32.25′E |
| 加勒比松 | 15 | 福建漳平 | 25°13.78′N,117°32.25′E |
该指纹图谱简要构建过程如下：
1)PCR扩增及产物检测：利用实施例一筛选出的7对马尾松cpSSR多态性引物对8个松树近缘种进行PCR扩增，所得产物进行毛细管电泳。所述PCR扩增体系包括：10×PCRBuffer(10mM Tris-HCl)；0.25mM dNTP；2.5mM MgCl2；0.3mM所述马尾松cpSSR引物；0.5UTaq DNA聚合酶和50ng DNA模版，所述PCR扩增体系的总体积为10μL。所述的PCR扩增程序为：预变性94℃5min；25循环的94℃30s，退火30s，72℃40s；延伸72℃5min；7对引物的退火温度如表1所示。
2)数据处理：对毛细管电泳结果的处理为字母加数字的形式。其中，E为引物cp005的字母编号，F为引物cp006的字母编号，G为引物cp007的字母编号，H为引物c p008的字母编号，I为引物cp009的字母编号，J为引物cp010的字母编号，K为引物c p011的字母编号；数字为PCR扩增条带的长度，单位bp。“-”连接的两个数字表示该引物在此物种中扩增出的片段范围。
3)指纹图谱的构建：根据数据处理结果做出如表3的8种松树近缘种的指纹图谱。
表3 8种松树近缘种的指纹图谱
其中，E为引物cp005的字母编号，F为引物cp006的字母编号，G为引物cp007的字母编号，H为引物cp008的字母编号，I为引物cp009的字母编号，J为引物cp010的字母编号，K为引物cp011的字母编号；数字为PCR扩增条带的长度，单位bp。“-”连接的两个数字表示该引物在此物种中扩增出的片段范围。
实施例3
应用实施例1中7对马尾松cpSSR多态性引物快速鉴定8种松树近缘种的方法，包括以下步骤：
1)利用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取全DNA。
2)按照如下的PCR反应体系和反应程序据表1的引物顺序依次进行PCR扩增，直至完成鉴定。
PCR扩增体系包括：10×PCR Buffer(10mM Tris-HCl)；0.25mM dNTP；2.5mMMgCl2；0.3mM所述马尾松cpSSR引物；0.5U Taq DNA聚合酶和50ng DNA模版，PCR扩增体系的总体积为10μL；
PCR扩增程序为：预变性94℃5min；25循环的94℃30s，退火30s，72℃40s；延伸72℃5min。
3)对PCR扩增产物进行毛细管电泳，按照实施例2中的数据处理方法处理毛细管电泳结果。
5)依据毛细管电泳结果对照不同品种指纹图谱，即可完成鉴定。
实施例4
本发明提供了一种利用实施例1提供的马尾松叶绿体微卫星分子标记的多态性引物鉴定8种松树近缘种亲缘关系的方法，具体如下：
首先，提取样品基因组DNA。样品为本发明实施例2中提供的8个松树近缘种，其中每个树种取样15个个体，并提取样品的DNA。然后，根据实施例1中提供的7对马尾松cpSSR多态性引物和样品的基因组DNA混合进行扩增，得到扩增产物，将该扩增产物进行毛细管电泳。对毛细管电泳数据的处理方式如图2所示，其中code为树种名称，每个树种取样15株实生苗，marker表示引物，由于本发明采用的是叶绿体微卫星分子标记，一对引物在一个个体中所扩增出的条带均为1条，可以将其视为纯合体，记为X/X。，将处理好的毛细管电泳数据导入PowerMarkerversion 3.25(Liu K,Muse S V.PowerMarker:an integrated analysisenvironment for genetic marker analysis.[J].Bi oinformatics,2005,21(9):2128-2129)计算遗传距离矩阵，然后使用MEGA7中的UPGM A算法，构建如图1所示的系统进化树。
基于UPGMA的系统进化树表明，8种松树近缘种可分成三大类，即白皮松组、五针松组和油松组。其中，油松组又可分亚欧派系和北美派系，表明油松组的亲缘关系差异具有明显的地理相关性。
本发明利用马尾松叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进行8种松树近缘种亲缘关系的鉴定，并利用叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，且松树的叶绿体为父性遗传，具有叶绿体DNA的单亲遗传模式、不易发生重组的特点，使得叶绿体微卫星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，进而使得本发明提供的鉴定松树亲缘关系的方法能够全面地反应松树的亲缘关系，也可将叶绿体微卫星分子标记与细胞核DNA分子标记综合运用，能够更进一步全面、准确、客观反映物种细胞质和细胞核内的亲缘关系。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种马尾松cpSSR多态性引物及其松树近缘种的鉴定方法
<130> 100
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttgtcctc ttcctctatt accac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctttattt tcagaactat cgtcc 25
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtaaatgtt ccctccca 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatgcttca atccttcg 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atagttggag tcggcgg 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctggatgtc tttggca 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggggtagaga aaatgcct 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgccgagtt ccttagag 18
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatcccttcc ttttgg 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgctggtta ctctcg 16
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttcaataca aatgatggga gtcg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtcggattc ttcctatctt cttg 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggtcttctt ctttttttca tt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgttgtcatt ttccttccta tt 22
Claims (6)
1.马尾松cpSSR多态性引物，其特征在于：包括7对引物，其引物序列如下表所示：
2.权利要求1所述的马尾松cpSSR多态性引物在松树近缘种鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的松树近缘种分别为马尾松、黄山松、云南松、油松、华山松、湿地松、加勒比松。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测样品DNA提取；
2)利用权利要求1所述的马尾松cpSSR多态性引物进行PCR；
3)对PCR产物进行毛细管电泳，以毛细管电泳结果与指纹图谱进行对比，鉴定出结果；所述的指纹图谱，如下表所示：
其中，E为引物cp005的字母编号，F为引物cp006的字母编号，G为引物cp007的字母编号，H为引物cp008的字母编号，I为引物cp009的字母编号，J为引物cp010的字母编号，K为引物cp011的字母编号；数字为PCR扩增条带的长度，单位bp；“-”连接的两个数字表示该引物在此物种中扩增出的片段范围。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，10μL PCR反应体系包括：10×PC RBuffer；0.25mM dNTP；2.5mM MgCl2；0.3mM马尾松cpSSR引物；0.5U Taq DNA聚合酶和50ngDNA模版。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增程序为：预变性94℃ 5min；25循环的94℃ 30s，退火30s，72℃ 40s；延伸72℃ 5min。
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Legal Events
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Application publication date: 20180109 Assignee: Nanjing dehetang Biotechnology Co., Ltd Assignor: Nanjing Forestry University Contract record no.: X2019320000335 Denomination of invention: Pinus massoniana cpSSR polymorphism primer and identification method of pine sibling species of primer Granted publication date: 20190823 License type: Common License Record date: 20191206 Application publication date: 20180109 Assignee: Nanjing peptide crystal Biotechnology Co., Ltd Assignor: Nanjing Forestry University Contract record no.: X2019320000336 Denomination of invention: Pinus massoniana cpSSR polymorphism primer and identification method of pine sibling species of primer Granted publication date: 20190823 License type: Common License Record date: 20191206 Application publication date: 20180109 Assignee: Nanjing runke Biotechnology Co., Ltd Assignor: Nanjing Forestry University Contract record no.: X2019320000337 Denomination of invention: Pinus massoniana cpSSR polymorphism primer and identification method of pine sibling species of primer Granted publication date: 20190823 License type: Common License Record date: 20191206 |