CN107760796A

CN107760796A - 一种快速鉴定刺槐多倍体的ssr分子标记引物

Info

Publication number: CN107760796A
Application number: CN201711047706.3A
Authority: CN
Inventors: 毛秀红; 荀守华; 王翠艳; 张元帅; 李双云; 李红静; 杨庆山; 孙百友; 闫少波
Original assignee: Feixian County State-Owned Daqingshan Forest Farm; People's Government Of Lan Cun Town Jimo; Shandong Academy of Forestry
Current assignee: Feixian County State-Owned Daqingshan Forest Farm; People's Government Of Lan Cun Town Jimo; Shandong Academy of Forestry
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2018-03-06

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定刺槐多倍体的SSR分子标记引物，所述引物碱基序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明实现了从分子水平快速鉴别刺槐多倍体植株，可以不受季节、植物发育时期和生长环境的影响，为刺槐多倍体的快速鉴定、新品种保护、遗传多样性分析评价和遗传育种等研究提供了参考和依据。本发明示例的引物，在343个刺槐无性系中多倍体检出率高达85.42％，充分说明该SSR引物的高效性和适用性，也从分子水平验证了自然界确实存在许多发生自然变异的刺槐多倍体。

Description

一种快速鉴定刺槐多倍体的SSR分子标记引物

技术领域

本发明涉及SSR分子标记技术领域，具体涉及刺槐SSR分子标记引物，还涉及所述引物在刺槐多倍体鉴定中的应用。

背景技术

刺槐(Robinia pseudoacacia L.)为豆科(Leguminosae)刺槐属(Robinia)阔叶乔木，耐干旱、耐瘠薄、耐轻度盐碱、抗污染能力强、自然更新能力强，是荒山造林和水土保持先锋树种，具有很高的观赏、蜜源和饲用价值。刺槐木材坚韧、抗冲击、耐腐朽、耐水湿，是重要的建筑、矿柱、车辆、造船用材；刺槐木材热值高，燃烧速度慢，是优质薪炭材和优良生物质能源树种。刺槐原产北美，世界范围的引种驯化始于1601年，巴黎植物园主任罗宝将刺槐引进法国，成为第一个从北美引进欧洲的林木树种，以后逐渐被其它国家和地区引种，如前苏联、瑞士、意大利、德国、奥地利、匈牙利、前捷克斯洛伐克、前南斯拉夫、罗马尼亚、中东、日本、韩国和中国，以及南美、非洲和澳大利亚(凯莱斯台舍，1993)。中国的刺槐引种驯化始于清光绪年间(1877～1878)，中国官员张鲁生自日本引入，定植于南京龙蟠里薛庐做观赏用。1897年由德国人引入山东省青岛市郊造林，(陈一山，2005)。新中国成立前后20年，我国又从日本、美国和朝鲜分别引进了几批刺槐种源，种植在我国辽东、甘肃天水、湖南长沙和华北等地(顾万春等，1991)。由于刺槐对气候条件、土壤条件有广泛的适应性，因此自1949年以来，栽培范围逐步扩大至北纬23°～46°，东经124°～86°的27个省(市、自治区)，广布于辽宁铁岭以南，内蒙古呼和浩特、包头、宁夏、银川，南至福州，东至台湾、江苏、浙江沿海，西北至新疆石河子、伊宁、阿克苏、叶城、青海西宁，西南至四川雅安、云南昆明(中国树木志，1985)，逐渐演化成我国的乡土树种。

多倍体植物在自然界非常常见，通常具有生长速度快、生物产量高、抗逆性强等特征。北京林业大学1997年从韩国引入我国的饲料型四倍体刺槐K1–K5，是由人工诱导二倍体刺槐体细胞加倍而育成。目前国内外尚没有其他发现或者培育四倍体刺槐的报道。刺槐作为世界引种最为成功的三大树种之一，本课题组推测刺槐必然存在许多发生自然变异的多倍体。目前比较常用的鉴定植物多倍体的方法主要有植株形态学鉴定法、染色体计数法(核型分析)和流式细胞仪法，其中形态学鉴定法最直观，最粗放，但是鉴定的准确度不高，仅能作为初步鉴定多倍体的主要方法；染色体计数法的鉴定结果最为经典、可靠，但是对植物的取材部位和细胞所处的时期要求很高，而且操作过程繁琐、工作量大；流式细胞仪法(FCM)虽然能够快速鉴别植株的染色体倍性水平，但是样品准备时间不宜超过20分钟，否则DNA峰值位置会发生偏移，从而影响测定结果，而且测定费用很高。所以急需发明一种简便、快速、高效的鉴定多倍体植物的方法。近年来韩国辉(2012)在利用EST-SSR对柑橘多倍体进行遗传分析后，认为SSR分子标记可以作为不同倍性植株染色体倍性确认的一个参考；贾会霞等(2015)在对24份杨树种质进行SSR指纹图谱构建时发现，中怀1号、森海1号、森海2号、青杨和中林46杨5份种质均扩增出3个不同等位基因位点，FCM检测结果证实这5份种质均为三倍体，所以得出结论，SSR标记能够准确地反映植物的倍性。

然而，目前国内外尚无利用荧光SSR标记技术对刺槐多倍体进行快速鉴定的方法，也没有能够快速鉴定刺槐多倍体的高效SSR引物。

发明内容

鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本申请期望提供一种使用SSR分子标记鉴定刺槐多倍体的刺槐SSR分子标记引物。

本申请还提供了上述刺槐SSR分子标记引物在刺槐多倍体鉴定中的应用。

为了实现上述目的本发明通过以下技术方案实现：

一种刺槐SSR分子标记引物，碱基序列如下：

上游引物：5‘ACTGTTGGCTATGTCCCCTG’3(如：SEQIDNO.1)，下游引物：5‘GCGAATCTTGACAGCAAACA’3(如：SEQIDNO.2)。

所述的刺槐SSR分子标记引物在鉴定刺槐多倍体中的应用。

所述的应用，包括以下的步骤：

(1)刺槐基因组DNA的提取；

(2)使用上述的刺槐SSR分子标记引物对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增；

(3)用毛细管电泳检测步骤(2)扩增的PCR产物等位基因数目；

(4)根据每对SSR引物的带型结果，组合形成刺槐无性系的SSR指纹图谱，当刺槐指纹图谱中有位点出现三个以上(包括3个)等位基因时，即为多倍体。

优选的：所述步骤(2)中PCR扩增程序采用：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，14个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。

优选的：所述步骤(2)中PCR扩增采用10μL体系：DNA(20ng·μL^-1)0.5μL，灭菌去离子水4.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，正反引物各0.1μL。

优选的：所述步骤(3)中毛细管电泳检测的步骤为：取步骤(2)的PCR扩增产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。

优选的：所述检测为用毛细管电泳仪ABI3730XL检测，所述检测的参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。

所述的刺槐SSR分子标记引物在刺槐多倍体鉴定或辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明实现了从分子水平快速鉴别刺槐多倍体植株，可以不受季节、植物发育时期和生长环境的影响，为刺槐多倍体的快速鉴定、新品种保护、遗传多样性分析评价和遗传育种等研究提供了参考和依据。

本发明示例的引物，刺槐多倍体检出率高达85.42％，充分说明该SSR引物高效性和适用性，也从分子水平验证了自然界确实存在许多发生自然变异的刺槐多倍体。

本发明示例的引物，检测结果重复性好，多态性高，能快速、准确、高效的完成刺槐品种或者无性系多倍体鉴定。

附图说明

图1为本发明实施例示例的SSR引物RP13的部分PCR扩增产物毛细管电泳图。

具体实施方式

为了更好的了解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一

快速鉴定刺槐多倍体的SSR分子标记引物通过以下步骤获得：

(1)刺槐总RNA的提取与转录组测序

利用Trizol试剂提取刺槐总RNA。试验中所用枪头、研钵、小勺等均用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理4h，接着高温高压灭菌1h。然后按照Trizol试剂的使用方法提取总RNA。使用1.0％的非变性琼脂糖凝胶电泳粗略检测所提取RNA的完整性；使用仪器Nanodrop(IMPLEN,CA,USA)检测所提RNA纯度和浓度(OD 260/230比值；OD 260/280比值)；利用Agilent 2100(Agilent Technologies,CA,USA)检测RNA完整性。

RNA样品检测合格后，为保证得到高质量转录组数据，还要经过建库、库检等程序。

具体步骤介绍如下：

①使用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。

②使用片段化缓冲液把mRNA打断成小片段，然后以mRNA为模板，合成一链cDNA，接着加入缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶I和RNase H合成双链cDNA。最后使用AMPure XP磁珠纯化双链cDNA。

③将纯化的双链cDNA进行末端修复、加A尾并连接接头。

④使用AMPure XP磁珠选择大小片段，接着PCR扩增，用磁珠再次纯化PCR产物，建立文库。

⑤使用Qubit2.0初步检测文库质量，稀释文库。接着使用Agilent2100检测插入片段大小，合格后，使用定量PCR检测文库的有效浓度，使文库质量达到要求。然后按照有效浓度将合格的文库pooling至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina高通量测序平台(HiSeqPE150)开始测序。测序质量评估合格后，使用Trinity软件拼接clean reads，使用Cap3软件组装获得Unigenes库。其中Trinity和Cap3使用软件默认的参数。

2.SSR位点开发

对刺槐的Unigenes库利用MISA程序使用默认参数进行SSR位点搜索；使用MISA软件(1.0版，默认参数)搜索SSR，标准为：含有1、2、3、4、5、6核苷酸的最少重复次数分别为12、7、5、4、3和3次。

3.SSR引物设计

利用软件Primer 3.0设计刺槐SSR引物，设置SSR位点侧翼序列长度≥50bp。引物设计参数标准为：(1)退火温度(Tm)在59～61℃，最佳60℃，上下游引物Tm相差≤3℃；(2)PCR扩增产物大小100～300bp，150bp最佳，引物长度18～23bp，20bp最佳；(3)GC含量40％～60％，50％最佳；(4)避免出现复合型SSR、引物二聚体和二级结构。

4.引物筛选

对用于指纹图谱构建的18对引物在343个无性系中的筛选结果显示(见表1)，18对引物在384个样品中均能得到三个及以上等位基因，但是其中只有RP13的多倍体检出率最高，达85.42％；其次是rops16,多倍体检出率为37.32％；排在第三名的是Rply02，多倍体检出率为21.28；其余引物的多倍体检出率均小于3.2％。所以通过表1可以看出引物RP13是鉴定刺槐植株是否是多倍体的高效分子标记。RP13扩增的部分图谱如图1所示。

表1利用18对引物检测343个刺槐无性系得到3个以上等位基因统计表

实施例二

1、试验样品

本实验以从韩国引进的5个四倍体刺槐无性系为供试材料。分别为K1(TetraploidR.pseudoacacia K1)、K2(Tetraploid R.pseudoacacia K2)、K3(TetraploidR.pseudoacacia K3)、K4(Tetraploid R.pseudoacacia K4)、K5(TetraploidR.pseudoacacia K5)。

材料采集自山东省费县大青山林场。

2016年5月，采集幼嫩叶片，硅胶干燥，备用。

2、基因组DNA的提取：

取幼嫩的刺槐无性系叶片，采用英芮诚生化科技(上海)有限公司植物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(货号PTED-6030)按照使用说明进行提取。

3、利用SSR引物进行PCR扩增：

以步骤2提取的刺槐总DNA样品为模板，采用如下两对引物进行SSR-PCR扩增，可以使用FAM、HEX、ROX或TAMRA其中任意两种荧光对引物进行标记，

引物RP13：上游：5‘ACTGTTGGCTATGTCCCCTG’3(如：SEQIDNO.1)

下游：5‘GCGAATCTTGACAGCAAACA’3(如：SEQIDNO.2)；

引物rops16：上游：5‘AACCCTAAAAGCCTCGTTATC’3(如：SEQIDNO.3)

下游：5‘TGGCATTTTTTGGAAGACACC’3(如：SEQIDNO.4)；

上述荧光SSR-PCR采用10μL体系：DNA(20ng·μL^-1)0.5μL，灭菌去离子水4.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，正反引物各0.1μL。

上述荧光引物PCR扩增程序采用：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，14个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。

4、毛细管电泳上机检测

用毛细管电泳仪ABI3730XL检测PCR产物等位基因数目。取PCR产物各0.3μL、分子量内标(生产商ABI)0.5μL和去离子甲酰胺(生产商ABI)9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。基因分析仪生产厂家是ABI公司，型号3730xlDNAanalyzer，所用参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。

5、SSR指纹图谱构建及多倍体鉴定：采用Genemarker2.2.0软件进行数据整理分析，根据每对SSR引物的带型结果，组合形成每个无性系的SSR指纹图谱，只要指纹图谱中有一个位点出现三个以上(包括3个)等位基因，就可以从分子水平鉴定该刺槐植株是多倍体。上述两对SSR引物组合构建的指纹图谱见表2。

表2：两对荧光SSR引物组合构建的指纹图谱

结果表明：利用本发明提供的SSR引物RP13即可轻松从分子水平验证无性系K1-K5确实是多倍体，引物RP13对应的SSR位点在刺槐无性系中部分指纹带型见图1。这些引物的试验结果重复性好，多态性高，能快速、准确、高效的完成刺槐品种或者无性系多倍体鉴定。

另外，本实验室在利用引物RP13构建343个刺槐品种或无性系(大部分是从种子实生苗中选育出的优株)指纹图谱时，发现其中293个无性系在该位点有三至六个等位基因，仅利用这一对引物的多倍体检出率就高达85.42％，充分说明该SSR引物RP13的高效性和适用性，从分子水平验证了自然界确实存在许多发生自然变异的刺槐多倍体。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省林业科学研究院

即墨市蓝村镇人民政府

费县国有大青山林场

<120> 一种快速鉴定刺槐多倍体的SSR分子标记引物

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actgttggct atgtcccctg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgaatcttg acagcaaaca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaccctaaaa gcctcgttat c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggcattttt tggaagacac c 21

Claims

1.一种刺槐SSR分子标记引物，其特征是：碱基序列如下：

2.权利要求1所述的刺槐SSR分子标记引物在鉴定刺槐多倍体中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征是：包括以下的步骤：

(1)刺槐基因组DNA的提取；

(2)使用权利要求1所述的刺槐SSR分子标记引物对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增；

(3)用毛细管电泳检测步骤(2)扩增的PCR产物等位基因数目；

4.如权利要求3所述的应用，其特征是：所述步骤(2)中PCR扩增程序采用：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，每个循环降低0.5℃，72℃延伸40s，14个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。

5.如权利要求3所述的应用，其特征是：所述步骤(2)中PCR扩增采用10μL体系：DNA(20ng·μL^-1)0.5μL，灭菌去离子水4.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，正反引物各0.1μL。

6.如权利要求3所述的应用，其特征是：所述步骤(3)中毛细管电泳检测的步骤为：取步骤(2)的PCR扩增产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。

7.如权利要求3所述的应用，其特征是：所述检测为用毛细管电泳仪ABI3730XL检测，所述检测的参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。

8.权利要求1所述的刺槐SSR分子标记引物在刺槐多倍体鉴定或辅助育种中的应用。