CN109609681B

CN109609681B - 一种基于叶绿体基因组序列的火炬松个体鉴定方法

Info

Publication number: CN109609681B
Application number: CN201910049659.9A
Authority: CN
Inventors: 黄少伟; 刘天颐; 蒋开彬; 毛积鹏; 何紫迪; 陈杰湖; 刘纯鑫
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2039-01-18
Also published as: CN109609681A

Abstract

本发明公开了一种基于叶绿体基因组序列的火炬松个体鉴定方法，检测待测样本的叶绿体基因组的分子标记。利用存在于21个火炬松种质间的21个叶绿体基因组SNP特异性位点，实现了对不同个体的区分，并能够以此鉴定其父系祖先。本发明首先发现火炬松叶绿体基因组序列的多态性，发现了叶绿体基因组可以作为种群亲缘关系鉴定。通过对叶绿体基因组序列差异区段的比较，获得能够用于筛选鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的鉴定的分子标记，并进一步获得检测分子标记的特异性PCR扩增引物，从而实现了利用PCR扩增技术对群体进行快速鉴定，在火炬松育种领域会发挥中大的作用。

Description

一种基于叶绿体基因组序列的火炬松个体鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，更具体地，涉及一种基于叶绿体基因组序列的火炬松个体鉴定方法。

背景技术

火炬松是一种原产北美东南部的高大乔木，目前在我国多地引种种植。其具有生长快、适应能力强、干型通直无节，侧枝较细、自然整枝能力强、材质好、松脂产量高等特点，已经被许多国家和地区广泛引种栽培。

火炬松遗传改良离不开种质资源，建立育种群体是保护种质资源的重要形式，是火炬松遗传改良的重要内容。火炬松遗传改良遵循的是多世代轮回选择的模式。在育种进程中，为了短期内获得高的遗传增益，必须提高选择强度；而随着世代和育种轮回的推进，在选择压力下，群体的遗传基础不可避免地逐步变窄，遗传多样性水平逐步下降，选择强度越大，遗传多样性水平下降越快，最终导致群体内亲缘关系普遍存在，近郊衰退严重，损害长期增益。育种工作者通过科学的群体管理，既获得较高的短期增益，又能满足长期育种的需要。群体管理的核心内容就是个体间遗传关系的管理和调控，需要从交配设计、选择方式、选择强度等方面着手进行。

目前，在火炬松高世代实际育种中，为了全面了解杂交组合的效应和避免群体内亲缘关系过快增加，采用完全谱系交配设计和人工控制授粉，这样不仅杂交组合多，而且耗时耗力、投入大。为了解决高世代育种面临的问题，可以通过混合花粉授粉的方法获得半同胞子代，根据子代测定的结果筛选出优良单株，继而利用分子标记鉴定拟选优树的父本来源，保证入选优树亲本来源清晰，从而控制育种群体的亲缘关系。

目前普遍利用基因组分子标记鉴定后代的父本来源，但是松树核基因组不仅体量大，而且重复序列多，在有性繁殖过程中基因发生重组，针对核基因组进行的亲本鉴定有很大难度。松树叶绿体基因组相对核基因组有许多优势。首先，叶绿体基因组包含适量的遗传信息，为比较研究提供了一个相对适中的数据基础；其次，叶绿体DNA的核苷酸变异率适中，在应用上很有价值；除此以外，叶绿体基因组DNA序列较小，便于测序；这为鉴定优树的亲本提供了十分有利的条件。火炬松基因组大小约为22Gb，基因组中包含大量重复序列。重复序列的存在导致PCR扩增的特异性明显降低，绝大部份的分子标记扩增都需要设计巢式PCR引物进行扩增，特异性低，实验复杂。

叶绿体是绿色植物细胞中半自主的细胞器，有独立的基因组，基因组主要为环状双链分子。以往的研究发现，松属树种的叶绿体基因组属于父系遗传，但是在结构上极其高度保守。一直以来，叶绿体基因组序列主要是用于分类、进化和基因工程方面的研究，只限于物种水平的研究。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于叶绿体基因组序列的火炬松个体鉴定方法。

本发明的第一个发明目的是提供一种鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的方法。

本发明的第二个发明目的是提供火炬松叶绿体基因组的分子标记在鉴定火炬松个体的父本来源中的应用。

本发明的第三个发明目的是提供一个鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的分子标记组合。

本发明的第四个发明目的是提供所述分子标记组合在鉴定火炬松个体的种质或父系祖先中的应用。

本发明的第五个发明目的是提供一个鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的引物组合。

本发明的第六个发明目的是提供所述引物组合在鉴定火炬松的种质或父系祖先、或检测所述分子标记组合，或鉴定火炬松的种质或父系祖先试剂盒中的应用。

本发明的第七个发明目的是提供一个鉴定火炬松的种质或父系祖先的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的方法，检测待测样本的叶绿体基因组的分子标记。

优选地，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种，所述分子标记为叶绿体基因组上的21个分子标记中的一个或几个，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基。

“中国森林植物种质资源信息系统”的网址为：www.fgr.cn。

优选的，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448个碱基的T/G突变、第29449个碱基的T/G突变、第37238个碱基的T/A突变、第37239个碱基的T/A突变、第37240个碱基的T/A突变、第39801个碱基的A/G突变、第97585个碱基的T/G突变、第100523个碱基的G/T突变、第100730个碱基的A/G突变、第100732个碱基的G/T突变、第101076个碱基的T/G突变、第101085个碱基的T/G突变、第101103个碱基的T/G突变、第101112个碱基的T/G突变、第101121个碱基的T/G突变、第101130个碱基的T/G突变、第101139个碱基的G/T突变、第101157个碱基的T/G突变、第101166个碱基的T/G突变、第104944个碱基的G/A突变和第105020个碱基的T/C突变。

优选地，按照GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基的顺序，

以“火炬松武32”作为父系祖先的后代或“火炬松武32”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、T、A、G、T、T、T、T、T、T、G、T、T、G和T；

以“火炬松P043”作为父系祖先的后代或“火炬松P043”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、G、G、T、T、G和T；

以“火炬松P040”作为父系祖先的后代或“火炬松P040”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、T、T、T、T、G和T；

以“火炬松P051”作为父系祖先的后代或“火炬松P051”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、T、A、G、T、T、G、T、T、T、G、T、T、G和T；

以“火炬松W26”作为父系祖先的后代或“火炬松W26”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、G、T、T、T、G、T、G、G和T；

以“火炬松W16”作为父系祖先的后代或“火炬松W16”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、G、T、G、T、T、T、T、G和T；

以“火炬松W11”作为父系祖先的后代或“火炬松W11”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、G、G、A、G、T、T、T、T、T、T、T、T、T、A和T；

以“火炬松Q6”作为父系祖先的后代或“火炬松Q6”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、A、A、A、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、T、G、T、T、G和C；

以“火炬松Q13”作为父系祖先的后代或“火炬松Q13”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、G、T、T、T、G和T；

以“火炬松N3”作为父系祖先的后代或“火炬松N3”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、A、A、A、A、T、T、A、G、T、T、T、T、T、T、G、T、T、G和C；

以“火炬松G16”作为父系祖先的后代或“火炬松G16”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、A、A、A、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、T、G、T、T、G和T；

以“火炬松G10”作为父系祖先的后代或“火炬松G10”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、G、T、T、T、G、T、T、G和T；

以“火炬松G01”作为父系祖先的后代或“火炬松G01”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、T、G、T、T、T、T、T、G、T、G、T、T、G和T；

以“火炬松A279”作为父系祖先的后代或“火炬松A279”的21个分子标记的碱基依次为：G、T、T、T、T、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、T、T、T、T、A和T；

以“火炬松A270”作为父系祖先的后代或“火炬松A270”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、G、T、G、A、G、T、T、T、T、T、T、G、G、T、G和T；

以“火炬松A262”作为父系祖先的后代或“火炬松A262”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、A、A、A、A、T、G、A、G、T、T、T、T、T、T、T、G、T、G和C；

以“火炬松A259”作为父系祖先的后代或“火炬松A259”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、A、A、A、A、T、G、A、G、T、T、G、T、T、T、T、T、T、G和T；

以“火炬松A201”作为父系祖先的后代或“火炬松A201”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、G、T、T、G、T、T、T、T、G、T、T、G和T；

以“火炬松24”作为父系祖先的后代或“火炬松24”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、T、T、T、A、T、G、A、G、G、G、G、G、T、G、G、T、T、G和T；

以“火炬松18”作为父系祖先的后代或“火炬松18”的21个分子标记的碱基依次为：T、G、T、T、T、A、T、T、A、G、T、T、T、T、T、T、T、T、T、G和T；

以“火炬松13”作为父系祖先的后代或“火炬松13”的21个分子标记的碱基依次为：T、T、A、A、A、A、T、G、A、G、T、T、T、G、G、T、G、T、T、G和T；

火炬松叶绿体基因组的分子标记在鉴定火炬松个体的父本来源中的应用也属于本发明的保护范围、

本发明还要求保护一个鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的分子标记组合，包括叶绿体基因组上的21个分子标记中的一个或几个，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。

以上所述分子标记组合在鉴定火炬松个体的种质或父系祖先中的应用，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。

一个鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的引物组合，能够扩增以上所述分子标记组合，优选地，所述能够扩增以上所述分子标记组合包括核苷酸序列如SEQ NO ID：1～20所述引物一条或几条。

以上所述引物组合在鉴定火炬松的种质或父系祖先、或检测以上所述分子标记组合，或鉴定火炬松的种质或父系祖先试剂盒中的应用，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。

一个鉴定火炬松的种质或父系祖先的试剂盒，包括所述引物组合，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。

一种叶绿体基因组的分子标记的筛选鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的试剂盒：

一、组成

核苷酸序列如SEQ NO ID：1～20所述引物，2×Taq Master Mix，ddH₂O。

二、使用方法

(1)提取待测样本叶绿体DNA；

(2)使用核苷酸序列如SEQ NO ID：1～20所述引物对样本叶绿体DNA进行PCR扩增，

其中，PCR反应体系如下：

扩增突变位点的PCR程序：94℃预变性4分钟，94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸3分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环35次，最后再72℃充分延伸10分钟。

(3)PCR产物检测

利用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，根据判断是否为目的条带。

(4)Sanger测序

采用ABI 3730XL测序仪对PCR产物进行测序。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

利用存在于21个火炬松种质间的21个叶绿体基因组SNP特异性位点，实现了对不同个体的区分，并能够以此鉴定其父系祖先。本发明首先发现火炬松叶绿体基因组序列的多态性，发现了叶绿体基因组可以作为种群亲缘关系鉴定。通过对叶绿体基因组序列差异区段的比较，获得能够用于筛选鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的鉴定的分子标记，并进一步获得检测分子标记的特异性PCR扩增引物，从而实现了利用PCR扩增技术对群体进行快速鉴定，在火炬松育种领域会发挥中大的作用。

具体实施方式

下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1叶绿体基因组的分子标记的筛选

一、实验方法

(1)叶绿体DNA的提取

1、叶绿体的提取

①取松针约10g洗净擦干于4℃冰箱中黑暗处理24～48h。

②将黑暗处理过的针叶剪成大概1cm左右置入匀浆机，加入6倍体积预冷(4℃)bufferA，使叶片完全被浸没。低速下匀浆4次，每次10秒左右，然后中速匀浆2次，每次10秒左右，若匀浆不充分则继续重复以上步骤，待匀浆充分后用纱布过滤浆液至一洁净烧杯中，收集滤液，弃滤渣；将滤液分装到50mL离心管中，4℃下2500rpm离心6min，弃上清。

③向沉淀中加30mL Buffer B，充分悬浮沉淀，4℃下3000rpm离心6min，弃上清。

④向沉淀中加30mL Buffer C，充分悬浮沉淀，4℃下3000rpm离心6min，弃上清。

⑤向沉淀中加15mL Buffer D，充分悬浮沉淀，4℃下3000rpm离心6min，弃上清；得到的沉淀为叶绿体粗沉淀，用干净的牙签沾取微量沉淀，可在OLYMPUSBX43F荧光显微镜下观察叶绿体的形态与完整性。

2、叶绿体DNA的提取

①向上述沉淀中加入20mL已预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液，于65℃恒温水浴锅中裂解细胞40min，期间上下颠倒离心管若干次。

②加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻颠倒若干次充分混匀，4℃下10000rpm离心10min。

③把上清移入新的离心管中，然后加入等体积的氯仿继续抽提，轻轻颠倒若干次充分混匀,4℃下10000rpm离心10min。

④取上清，加入0.7倍体积的异丙醇和0.1倍体积的3mol/LNaAc，颠倒若干次充分混匀，放入-20℃冰箱中静置过夜沉淀DNA。

⑤4℃下10000rpm离心30min，弃上清，此时的沉淀为DNA粗沉淀，用70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，无水乙醇洗涤一次，自然风干，加入400μLTE溶解DNA。

⑥加入20μLRNase I于DNA溶解液中，轻轻混匀后在37℃金属浴lh酶解RNA，再加入4μL蛋白酶K于37℃金属浴30min。

⑦利用天根Dp320试剂盒纯化所得DNA溶解液。

3、相关试剂的配置：

Buffer A：50mol/L Tris,25mmol/L EDTA,1.25mol/L NaCl,0.25mol/L BSA,pH＝3.6；高温高压灭菌，4℃保存。

Buffer B:50mol/L Tris,25mmol/L EDTA,1.25mol/L NaCl,1mmol/L DTT,0.1％牛血清蛋白(使用前加)，pH＝8.0；高温高压灭菌，4℃保存。

Buffer C:150mmol/LNaCl,100mmol/L EDTA,pH＝8.0；高温高压灭菌，4℃保存。

Buffer D:50mol/LTris,25mmol/L EDTA,pH＝8.0；高温高压灭菌，4℃保存。

1mol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液：用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09gDTT，经过滤除菌后分装成小份于-20℃保存。

1％牛血清蛋白(100mL)：称取1gBSA，加水定容至100mL，过滤除菌，4℃保存。

2×CTAB(200mL)：CTAB 4g,NaCl 16.364g,1M Tris-HCl(pH＝8.0)20mL,0.5MEDTA(pH＝8.0)8mL,加水定容至200mL；高温高压灭菌，室温保存。

5×TBE电泳缓冲液：0.45mol/LTris-硼酸，0.01mol/L EDTA；4℃保存。

6×Loading Buffer：0.25％(w/v)溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液；4℃保存。

酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)；避免光照氧化，现配现用。

3MNaAc(500mL)：123.04g无水乙酸钠，醋酸调pH至5.2，定容至500mL；高温高压灭菌，4℃保存。

(二)高通量测序

1、文库构建

将在“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”和“火炬松13”的21个火炬松种质的DNA溶液根据DNA量等量混合，混合后的DNA溶液使用DNA超声片段化技术，将检验合格的DNA序列打断成约500bp大小的片段。经末端修复后,在修复产物3’末端加上A碱基，再连接上Adaptor测序接头，回收纯化连接有Adaptor接头的目的片段，PCR扩增后完成文库构建。经检验合格的文库采用Hiseq2500/Hiseq4000/Miseq/NovaSeq/XTen等高通量测序平台进行高通量测序。

2、高通量测序

DNA测序采用Illumina的Hiseq2500/Hiseq4000/Miseq/NovaSeq/XTen等高通量测序平台进行，为实现高质量的基因组序列测序和组装，对已构建的双末端文库进行PairEnd双末端测序，测序读长为双端150bp。要求测序Q20(质量值在20以上的碱基所占的比例，即碱基测序错误率在1％以下)指标达到90％以上，Q30(质量值在30以上的碱基所占的比例，即碱基测序错误率在0.1％以下)指标达到85％以上。

3、质量检测

为保证后续分析的可靠性，对测序数据进行必要的检测和数据筛选，检测的内容包括：测序数据量、测序数据质量、GC比例分布、测序正确率等；同时基于检测结果，对数据进行筛选，筛选的标准为：去除含有N或含有3个以上碱基质量值低于20的测序序列。

4、序列比对与变异检测

序列比对分析采用短片段测序比对软件bwa(版本：0.7.12-r1039)，将经过质量筛选后的双末端测序reads比对到火炬松叶绿体基因组(NCBI登录号：NC_021440.1)，比对采用align比对方法，比对采用默认参数，比对文件产生后，使用bwa软件的sampe方法定位测序数据在叶绿体基因组上的位置。根据测序数据比对结果，采用samtools的sort分析方法，对比对结果进行排序整理。并使用mpileup方法，分析检测序列比对结果中，叶绿体基因组中的单碱基突变(SNP)，短片段插入缺失突变(Indel)和简单串联重复突变(SSR)。

(三)高频突变区筛选

高频突变位点的筛选根据SNP和Indel位点在叶绿体基因组中的位置分布，以在一对PCR引物中扩增出多个SNP或Indel为筛选方向，以实现在尽量少的PCR反应中扩增出尽量多的分子标记为目标，从54个突变位点中选择21个突变位点用于分子标记。

二、实验结果

通过使用mpileup方法，初步得到54个突变位点(表1)。

表1:

(注：Corrdiante：突变所在位置；Ref：参考基因组的碱基类型；SNV/Indels：突变的类型，包括SNV和Indel；Rate：突变类型所占的比例；Gene：所在的基因区或基因间隔区。)

经过进一步筛选，得到21个在这21个火炬松种质中特异性好的的突变位点。使用PCR引物检测了这21个火炬松种植的样品，共检测出21个SNP差异位点，检测出的位点与高通量测序检测位点一致，根据差异位点显示，可以区分不同的个体。

具体基因型如表2所示。

表2：

(pos表示位点所在叶绿体基因组的位置；SNP为该位点参考)

实施例2对特定SNP位点设计引物

一、实验方法

根据表2的突变位点的分布信息，对检测到SNP位点的叶绿体基因组序列区段设为候选区段，对候选区段进行PCR引物设计。

二、实验结果

根据引物扩增的特异性和扩增效率，得到扩增表2的突变位点的引物，引物见表3。

表3：

实施例3一种叶绿体基因组的分子标记的筛选鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的试剂盒

一、组成

二、使用方法

(1)提取待测样本叶绿体DNA；

(2)使用核苷酸序列如SEQ NO ID：1～20所述引物对样本叶绿体DNA进行PCR扩增，扩增仪：苏州东胜兴业科学仪器有限公司ETC811PCR扩增仪，

其中，PCR反应体系如下：

(3)PCR产物检测

利用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条带与Marker对比，根据大小初步判断是否为目的条带。

(4)Sanger测序

采用ABI 3730XL测序仪对PCR产物进行测序。测序引物为PCR扩增所用引物。

实施例4鉴定火炬松个体的种质

一、实验方法

按照实施例3中的试剂盒检测22个火炬松样品，以Illumina高通量测序作为对照，检测表2中的突变位点。

其中，所有样本的父系祖先均属于在“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”的22个火炬松种质。

二.实验结果

结果如表4所示。

结果显示检测到突变位点与高通量测序检测位点一致，因此本方法可靠、准确。

序列表

<120> 一种基于叶绿体基因组序列的火炬松个体鉴定方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atagctcgag atttgatctc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccattagata cattcaccag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttcatattc cggattaggg tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcttagcat ctgtcattct gg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgagtttat tcttacccag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atctccttat gctccgtctc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcccgtatt aacaagactg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attcctgcca aagataagag 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtttgagga taggtgaata tgag 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagtttctaa tccaagggtc gt 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacgttacag atacgatctc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gattcgaaat tctctacgac 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcaatggagt ttcaggatat gg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatgaatagt ctcttccgtg 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttgtccaac agatttcttg ag 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagacctata cttaaagctc ca 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttggcgatga attaacgatt gg 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcagatcaca tttgctcctc 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcaaggaata cccatctttc tg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atagaggaaa ctagtgatcg ag 22

Claims

1.一种鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的方法，其特征在于，检测待测样本的叶绿体基因组的分子标记，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种，所述分子标记为叶绿体基因组上的21个分子标记，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基的顺序，

3.火炬松叶绿体基因组的分子标记在鉴定火炬松个体的父本来源中的应用，其特征在于，所述父本来源“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种，所述分子标记为叶绿体基因组上的21个分子标记，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基。

4.一个鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的分子标记组合的检测试剂，其特征在于，包括叶绿体基因组上的21个分子标记，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基。

5.权利要求4所述分子标记组合的检测试剂在鉴定火炬松个体的种质或父系祖先中的应用，其特征在于，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。

6.一个鉴定火炬松个体的种质或父系祖先的引物组合，其特征在于，能够扩增以下分子标记组合：叶绿体基因组上的21个分子标记，所述21个分子标记为GenBank登录号NC_021440.1的序列上的第29448、29449、37238、37239、37240、39801、97585、100523、100730、100732、101076、101085、101103、101112、101121、101130、101139、101157、101166、104944和105020个碱基。

7.根据权利要求6所述的引物组合，其特征在于，所述能够扩增所述分子标记组合包括核苷酸序列如SEQ NO ID：1～20所述引物。

8.权利要求7所述引物组合在鉴定火炬松的种质或父系祖先、或检测权利要求5中所述分子标记组合、或在制备鉴定火炬松的种质或父系祖先的试剂盒中的应用，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。

9.一个鉴定火炬松的种质或父系祖先的试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述引物组合，所述种质或父系祖先为“中国森林植物种质资源信息系统”中“种质中文名”为“火炬松武32”、“火炬松P043”、“火炬松P040”、“火炬松P051”、“火炬松W26”、“火炬松W16”、“火炬松W11”、“火炬松Q6”、“火炬松Q13”、“火炬松N3”、“火炬松G16”、“火炬松G10”、“火炬松G01”、“火炬松A279”、“火炬松A270”、“火炬松A262”、“火炬松A259”、“火炬松A201”、“火炬松24”、“火炬松18”或“火炬松13”中的一种或几种。