CN110923304B

CN110923304B - 一种用于鉴别银杏性别的分子标记、引物对和方法

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Publication number: CN110923304B
Application number: CN201911204191.2A
Authority: CN
Inventors: 赵云鹏; 顾凯杰; 孙悦; 范广益; 张睿
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110923304A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别银杏性别的分子标记，所述的分子标记为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。引物对GbSD1和GbSD2、GbSD3和GbSD4为银杏雄性个体专一性核酸分子探针。采用常规PCR方法，使用引物对1进行扩增，扩增产物有617bp条带，或使用引物对2进行扩增，扩增产物有531bp条带，则为雄性；否则为雌性。本发明提供的引物对为银杏雄性个体专一性分子探针，仅需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，若样品中有PCR扩增带，则为阳性反应，判断为雄性个体，反之无PCR扩增带，则为阴性反应，判断为雌性个体；方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短。

Description

一种用于鉴别银杏性别的分子标记、引物对和方法

技术领域

本发明属于分子生物学方法鉴定植物性别的技术领域，具体涉及一种用于鉴别银杏性别的分子标记、引物对和方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)，银杏科银杏属落叶乔木，著名的“活化石”物种，具有重要的食用药用、景观绿化、文化艺术及科学研究价值，在国内外具有悠久和广泛的栽培应用历史。

银杏是雌雄异株植物，雌雄个体的生物学和生态学性状有明显差异。银杏雌株于每年10–11月种子成熟，结实量大，是传统食物白果的来源。然而，银杏在城市中作为行道树、景观树广泛栽培，雌株大量成熟落地的种子、具有腐蚀性的外种皮及其臭味大大影响了城市景观，增加了城市环境卫生成本，所以景观绿化更偏好雄株。因此，植株性别鉴定一直是银杏苗木生产和栽培应用的一项重要需求。

性别鉴别的传统形态学方法需要根据银杏的球花形态加以区分，但是银杏个体寿命长，性成熟时间久，种苗需要约20年才能开球花，时效性无法满足应用需求。因此在营养期甚至幼苗期进行银杏性别的早期鉴定成为关键技术瓶颈。

目前，国内外很多学者已从雌雄株生理生化差异、同工酶图谱、染色体组型、遗传标记等方面进行了不同角度和水平的探索。Jiang等人(2003)，Identification of a sex-associated RAPD marker in Gingko biloba，Acta Botanica Sinica，2003，45:742-747，报道了可以区分银杏雌株和雄株的随机扩增多态性DNA(RAPD)遗传方面。专利CN103374568A中涉及区分银杏雌株和雄株的分子标记，具体而言，涉及银杏性别鉴定方法，该方法与使用随机引物相比较具有增加的稳定性、并相对于显性标记提供有限的信息，是改善的，该方法同时使用银杏雄株特异性SCAR-GBM引物以及本领域已开发的线粒体DNA的现有atp1引物，执行多重PCR，其中所述SCAR-GBM引物是基于显示出鉴定银杏雄株的遗传性质的RAPD片段的序列开发。

但由于性染色体和性别决定区域信息不详以及RAPD技术的影响因素多，实验稳定性和重复性差。因此，上述方法对银杏性别鉴定的特异性、重复性和效率尚存不足。

基于Zhao等人(2019)，Resequencing 545ginkgo genomes across the worldreveals the evolutionary history of the living fossil.Nature Communications，2019，1-10，已发表的银杏群体重测序数据，得到了421株雌雄银杏的全基因组单核苷酸多态性数据，并首次公开了银杏雌性个体的全基因组序列。随后又通过全基因组关联分析等手段推断银杏的决定系统为XY型，为设计高特异性、高重复性和高效率的银杏性别鉴别分子探针提供了基础。

发明内容

针对现有技术中银杏性染色体和性别决定区域信息不详的问题，本发明提供了一种用于鉴定银杏性别的核苷酸序列、分子探针和方法，以实现对银杏性别的快速鉴别，提高银杏性别鉴别的特异性、重复性和效率。

一种用于鉴别银杏性别的分子标记，所述分子标记来源于银杏2号染色体的一段核苷酸序列，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的用于鉴别银杏性别的核苷酸序列来源于银杏的2号染色体，基于130株雄性和291株雌性银杏的全基因组关联分析(GWAS)确定了银杏性别决定的高关联区域2号染色体上的5Mb区域(380429859bp-384967462bp)，确定了2号染色体为可能的性染色体，推断银杏性别决定系统为XY型。通过单管长片段(stLFR)法测序得到一株雄性个体的reads，将其与前述研究得到的雌性参考基因组进行比对得到了一系列未比对上的reads，使用这些reads组装出的2.7Mb长的可能雄性2号染色体(或称Y染色体)特有区域。该区域能将其与银杏雌性个体区别开。因此，可根据此特异性区域设计合成专一性的核酸分子探针，建立快速、准确鉴定银杏性别的分子生物学方法。

一种用于鉴别银杏性别的引物对，所述引物对为以下任意一对：

引物对1：

上游引物GbSD1：5’-tcaagacacataaaaacgcaatg-3’，

下游引物GbSD2：5’-ggtgcattcaacattgtacacc-3’；

引物对2：

上游引物GbSD3：5’-gcttgcggacatccaatag-3’，

下游引物GbSD4：5’-ttcgtttgtttatggtgcattc-3’。

本发明用于鉴别银杏性别的引物对是以银杏雄性个体特异性核苷酸序列为基础的专一性核酸分子探针，利用BatchPrimer3软件设计得出。该银杏雄性性别专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与银杏雄性个体专一性反应，但不与银杏雌性个体的DNA发生反应。

一种鉴别银杏性别的方法，包括如下步骤：

(1)提取银杏基因组DNA；

(2)以步骤(1)银杏基因组DNA作为PCR检测模板，使用如权利要求3所述引物对进行PCR扩增；

(3)电泳检测扩增产物，如果使用引物对1进行扩增，扩增产物有617bp条带，或使用引物对2进行扩增，扩增产物有531bp条带，则为雄性；否则为雌性。

采用PCR方法，利用GbSD1和GbSD2的引物对为PCR引物，核苷酸序列SEQ ID NO.1为目的片段，进行PCR扩增，或者利用GbSD3和GbSD4的引物对为PCR引物，核苷酸序列SEQ IDNO.2为目的片段，进行PCR扩增。通过PCR方法可以快速、准确地鉴别银杏雄性个体，而且样品用量少。

为提高PCR扩增效率，优选的，PCR扩增条件为：

98℃预变性3min；

98℃变性10s，48～60℃退火10s，72℃延伸10～20s，共35个循环；

72℃延伸2min。

为提高银杏雄性个体鉴别的准确度，优选的，银杏基因组DNA的提取样本选择干燥银杏叶片，避开黄化、虫洞和叶脉部分，更为优选的，待检测的银杏为幼苗、幼树等营养体，或未见球花的大树。

本发明具有的有益效果：

本发明所提供的引物对为银杏雄性个体专一性核酸分子探针，在样品性别来源未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在探针寡核苷酸序列，鉴定出其是否为雄性个体，为银杏性别的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，而且样品用量少。

附图说明

图1是采用银杏雄性个体引物对GbSD1和GbSD2分别对银杏雌雄各24个个体进行检测的PCR扩增电泳图。

图2是采用银杏雄性个体引物对GbSD3和GbSD4分别对银杏雌雄各24个个体进行检测的PCR扩增电泳图。

具体实施方式

实施例1：银杏雄性个体特异性核苷酸序列的制备

1、基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法提取银杏叶片基因组DNA，步骤如下：

(1)取2mL离心管，每管加入1.5cm×1.5cm大小的干燥银杏叶片，并避开黄化、虫洞、叶脉部分，再加入少量聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)及1粒小磁珠。将离心管放入研磨仪中，以5m/s研磨20s左右至叶片呈粉末状。

(2)加入1mL wash buffer(wash buffer现配现用，配方为100ml 0.1mol/L Hepesbuffer加入0.9g无水柠檬酸与0.9g抗坏血酸充分溶解)至离心管中，涡旋混合均匀使沉淀物散开；样品在室温12 000rpm下离心10min，除去上清液。重复上述步骤2次至上清液变澄清。同时，以1mL plant DNA zol:2μLβ-巯基乙醇为比例准备溶液，并水浴65℃预热。

(3)去除澄清的上清液，每管加入1mL预热好的plant DNAzol溶液。充分混匀后，65℃水浴30min-1h，水浴时每5-10min充分混摇一次。水浴结束后，冷却至室温冰离心20s，吸取上清液移至新的2mL离心管中。

(4)每个离心管中加入1mL氯仿/异戊醇(24:1)，温和振摇100次，使其充分混合均匀。

(5)室温12 000rpm离心10min，吸取上清液转移至新的2mL离心管中。重复抽提一次后，加600-800μL等体积-20℃预冷的异丙醇，混合均匀。然后-20℃静置30min-1h，从而使溶液中的DNA充分析出。将溶液在10℃，12 000rpm离心10min，轻轻倾去异丙醇，得到透明或白色的DNA沉淀小块。

(6)用移液枪取1 000μL浓度为75％的酒精溶液，温和冲洗DNA沉淀。12 000rpm离心1min后，吸去酒精，并用1 000μL无水乙醇温和冲洗DNA，12 000rpm离心1min后，吸去酒精并晾干。根据DNA沉淀的大小加50～100μL TE溶液。

(7)上0.5-2μL DNA进行电泳检测，若电泳检测为单条带，说明提取DNA质量较好。如果为模糊条带，则需要对DNA进行纯化。

(8)向待纯化的DNA样品中加500μL TE，100μL的10×CTAB溶液，100μL的5M NaCl溶液。混匀，60℃水浴15min后，加氯仿/异戊醇(25:1)。室温离心12 000rpm，10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中。重复DNA提取步骤。

2、雄性特异性序列的获得

对实验室前期采样的130株雄性和291株雌性银杏进行重测序，得到了421个个体的SNP数据。通过全基因组关联分析(GWAS)鉴定了与银杏性别高关联的区域，确认了2号染色体是银杏的性染色体。通过对雄性个体进行stLFR测序，并从得到的序列中筛选出来自雄性的独有reads并组装得到雄性2号染色体(或称Y染色体)特异性区域作为探针设计候选序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。

实施例2：银杏雄性个体专一性核酸分子探针的制备

在获得银杏雄性个体特异性核苷酸序列的基础上，利用BatchPrimer3软件设计，得出引物对1：

上游引物GbSD1：5’-tcaagacacataaaaacgcaatg-3’，

下游引物GbSD2：5’-ggtgcattcaacattgtacacc-3’；

引物对2：

上游引物GbSD3：5’-gcttgcggacatccaatag-3’，

下游引物GbSD4：5’-ttcgtttgtttatggtgcattc-3’。

引物对1和引物对2的核苷酸组成与排列，是鉴定银杏性别的良好寡核苷酸片段。根据GbSD1和GbSD2、GbSD3和GbSD4的核苷酸组成的排列，在DNA自动合成仪上合成得到。

引物GbSD1和GbSD2扩增序列如SEQ ID NO.1所示。

引物GbSD3和GbSD4扩增序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3：银杏雄性个体的鉴定(常规PCR方法)

(1)DNA的提取：采用改良CTAB法提取银杏DNA。

(2)PCR操作

PCR反应体系为：

注：上游引物GbSD1和下游引物GbSD2一组；上游引物GbSD3和下游引物

GbSD4一组。

(3)全部个体验证实验

每对候选性别鉴定分子探针取一个96孔板，取48株雄性和48株雌性个体的DNA逐个上样，验证性别鉴定分子探针的效果。体系配方同预实验，也为25μL。设置如下反应热循环参数：

98℃预变性3min；

98℃变性10s，48～60℃退火10s，72℃延伸10～20s，共35个循环；

72℃延伸2min。

PCR扩增结果用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

电泳结果如图所示，图1采用银杏雄性个体专一性核酸分子探针GbSD1和GbSD2分别对银杏雌雄各24个个体进行检测的PCR扩增电泳图。扩增结果中100％的雌性个体表现为阴性，100％的雄性个体表现为阳性。(雄性个体有条带处分子量为617bp)。

图2是是采用银杏雄性个体专一性核酸分子探针GbSD3和GbSD4分别对银杏雌雄各24个个体进行检测的PCR扩增电泳图。扩增结果中100％的雌性个体表现为阴性，100％的雄性个体表现为阳性。(雄性个体有条带处分子量为531bp)。

银杏雄性个体分别在分子量617bp和531bp均有条带出现，而雌性个体在分子量617bp和531bp均没有条带出现。表明：采用GbSD1和GbSD2、GbSD3和GbSD4引物进行PCR检测，若样品中含雄性个体则为阳性反应，反之则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了GbSD1和GbSD2、GbSD3和GbSD4引物的专一性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于鉴别银杏性别的分子标记、引物对和方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 617

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba L.)

<400> 1

tcaagacaca taaaaacgca atgtagatta cactatgaat agaatataaa aggggatgat 60

ttgatacttg cttcatgtga cactaagcta tatataagtg cttgcggaca tccaatagca 120

cgaatatagg ctgaatattt tttactctac tgcttcaatg ataatccaaa ttttccaggc 180

ttcaaagcat tggatacaga ttaatacatt ggaaagtccg tggttgtgtg atatgcctca 240

gagtctggtg tactactgaa atgtgtcctt tattttctta cttcgatcta atatatgact 300

ttccttcacc agcatctttc caaaaaacta taatcacgtt ttatactaat cgaatgcttg 360

cacactttat cagagaggct ttgcccttaa tattatattt catgtgaagt aaacaaaata 420

aactacaaaa tgggaaatat acctgcggat tactgggagc ttataggaca tttatataat 480

atattacatc tacaaaagta atgtactaag caatctaccc cgcattgaac ttgccccatt 540

gcacttccac tgtctcatca atcaacttcc caaattggtg cttccagtac aacagggtgt 600

acaatgttga atgcacc 617

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba L.)

<400> 2

gcttgcggac atccaatagc acgaatatag gctgaatatt ttttactcta ctgcttcaat 60

gataatccaa attttccagg cttcaaagca ttggatacag attaatacat tggaaagtcc 120

gtggttgtgt gatatgcctc agagtctggt gtactactga aatgtgtcct ttattttctt 180

acttcgatct aatatatgac tttccttcac cagcatcttt ccaaaaaact ataatcacgt 240

tttatactaa tcgaatgctt gcacacttta tcagagaggc tttgccctta atattatatt 300

tcatgtgaag taaacaaaat aaactacaaa atgggaaata tacctgcgga ttactgggag 360

cttataggac atttatataa tatattacat ctacaaaagt aatgtactaa gcaatctacc 420

ccgcattgaa cttgccccat tgcacttcca ctgtctcatc aatcaacttc ccaaattggt 480

gcttccagta caacagggtg tacaatgttg aatgcaccat aaacaaacga a 531

<210> 3

<211> 784

<212> DNA

<213> 银杏(Ginkgo biloba L.)

<400> 3

gttatcatac gttttcgtta ttcatatata tagtgatgtt ctacaaatta aggatagcaa 60

gtagaactat atcgatattc tatattccta ttatttcacc aatgacatta caagtctagc 120

ttcaagacac ataaaaacgc aatgtagatt acactatgaa tagaatataa aaggggatga 180

tttgatactt gcttcatgtg acactaagct atatataagt gcttgcggac atccaatagc 240

acgaatatag gctgaatatt ttttactcta ctgcttcaat gataatccaa attttccagg 300

cttcaaagca ttggatacag attaatacat tggaaagtcc gtggttgtgt gatatgcctc 360

agagtctggt gtactactga aatgtgtcct ttattttctt acttcgatct aatatatgac 420

tttccttcac cagcatcttt ccaaaaaact ataatcacgt tttatactaa tcgaatgctt 480

gcacacttta tcagagaggc tttgccctta atattatatt tcatgtgaag taaacaaaat 540

aaactacaaa atgggaaata tacctgcgga ttactgggag cttataggac atttatataa 600

tatattacat ctacaaaagt aatgtactaa gcaatctacc ccgcattgaa cttgccccat 660

tgcacttcca ctgtctcatc aatcaacttc ccaaattggt gcttccagta caacagggtg 720

tacaatgttg aatgcaccat aaacaaacga atactgtgta gtattttaaa tatttcccat 780

agaa 784

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaagacaca taaaaacgca atg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtgcattca acattgtaca cc 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttgcggac atccaatag 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcgtttgtt tatggtgcat tc 22

Claims

1.一种鉴别银杏性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取银杏基因组DNA；

(2)以步骤(1)银杏基因组DNA作为PCR检测模板，使用引物对进行PCR扩增；

所述引物对为以下任意一对：

引物对1：

上游引物GbSD1：5’-tcaagacacataaaaacgcaatg-3’，

下游引物GbSD2：5’-ggtgcattcaacattgtacacc-3’；

引物对2：

上游引物GbSD3：5’-gcttgcggacatccaatag-3’，

下游引物GbSD4：5’-ttcgtttgtttatggtgcattc-3’，

(3)电泳检测扩增产物，如果使用引物对1进行扩增，扩增产物有617bp条带，或使用引物对2进行扩增，扩增产物有531bp条带，则为雄性；否则为雌性，

待检测的银杏为幼苗、幼树营养体，或未见球花的大树。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系为：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：

98℃预变性3min；

98℃变性10s，48～60℃退火10s，72℃延伸10～20s，共35个循环；

72℃延伸2min。