CN106434944A

CN106434944A - 与桃抗蚜基因紧密连锁的snp分子标记的应用

Info

Publication number: CN106434944A
Application number: CN201610927767.8A
Authority: CN
Inventors: 牛良; 鲁振华; 王志强; 潘磊; 张南南; 崔国朝; 曾文芳
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: CN106434944B

Abstract

与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记的应用，所述分子标记为KyHRM‑17‑45.71和KyHRM‑3‑46.12，分别位于桃基因组(Version 2.0)Scaffold 1的45.713Mb和46.121Mb处，其中KyHRM‑17‑45.71的等位基因为T和G，序列如SEQ ID NO.1所示，KyHRM‑3‑46.12的等位基因为C和G，序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用基于SNP的第三代标记技术，结合构建的分离杂交群体，采用图位克隆的方法，对桃抗蚜的基因进行了精细定位，在精细定位区域内，开发稳定的、共显性和多态性的SNP标记，以获得与目标性状紧密连锁的标记。

Description

与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP标记的应用。

背景技术

桃[Prunus persica(L.)Batsch]汁多味美，营养丰富，是深受我国人们喜爱的传统果品。据联合国粮农组织数据，2013年我国桃栽培面积1166万亩，产量1195万吨，分别占世界栽培总面积和总产量的50.5％和55.0％(FDA)。同时，桃也是我国的第三大落叶果树，广泛栽培于全国各地，是农业生产的一个重要组成部分。

蚜虫为半翅目昆虫，包含近5000种，是世界上种类最多、分布最广、危害最严重的植食刺吸式昆虫。蚜虫为害轻则影响植物生长，重者直接导致新梢甚至树体死亡，此外，蚜虫还是众多植物病毒的携带和传播媒介。桃蚜以桃树为初始寄主，从桃树萌芽期开始寄居于桃幼嫩新梢和叶片，以孤雌繁殖方式快速增殖，直接危害桃新梢及幼叶，取食汁液，导致桃叶片卷曲、新梢生长受限，同时，桃蚜还为害幼果，导致果实畸形，品质下降。

目前，蚜虫的防治主要以化学防治为主，但农药的大范围、长期、持续使用很容易导致蚜虫抗药性的产生，导致防治难度和成本持续增加。在我国和美国、法国、西班牙等欧美国家，桃蚜已对近些年来应用最广泛的烟碱类杀虫剂产生抗药性。抗蚜新药研发周期长、成本高昂，在与蚜虫进化的赛跑中已显吃力。植物抗蚜资源挖掘和抗性品种的培育应用可以减少农药使用和残留、保护益虫群体和病毒传播等。在美国，仅抗蚜苜蓿和高梁品种的使用每年就可以产生高达25亿元的效益。

通过确定与抗蚜基因紧密连锁的分子标记可以实现早期对目标性状进行分子鉴定，利于加快获得抗蚜性状的桃品种，提高育种效率。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记的应用。

技术方案：与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记在桃树育种中的应用，所述分子标记为KyHRM-17-45.71和KyHRM-3-46.12，分别位于桃基因组(Version 2.0)Scaffold 1的45.713Mb和46.121Mb处，其中KyHRM-17-45.71的等位基因为T和G，序列如SEQ ID NO.1所示：ACTCGAAACTCGTTTAACAAAACAAGTCACAGAACAACCGCAAGTGTACGTAAGCAATCCAACATCCAACTACATGCAACCGA，KyHRM-3-46.12的等位基因为C和G，序列如SEQ ID NO.2所示：GCAGCAACGAAACAGGGTTACTAACTGGACAAAGCATTAAGATGTTTGCTTTTCATTTTTTCAGAAAATAAACTTAACCCCGGGAGCAATTTGGAACATATACATTTGTGAAAACAGAAGCTTACAAGTTGTGGCATCATCCTCGCTCATTCCAAGGAAGAGAGCTGT。下划线表示等位基因位点。

所述KyHRM-17-45.71位点基因型为T，KyHRM-3-46.12抗蚜位点基因型为G。

检测权利要求1所述与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记的引物对，

KyHRM-17-45.71：5-CGGTTGCATGTAGTTGGATGTT-3

5-CCGGCCGGCTATACTATTTCT-3

KyHRM 3-46.12：5-GCAGCAACGAAACAGGGTTA-3

5-ACAGCTCTCTTCCTTGGAATGA-3

检测杂交后代单株的引物对：

KYYZ-SNP：5-CGAATCGCAATTTCCTCCTCA-3

5-AGTATGCTTTCACCTGCCCT-3。

一种检测抗蚜桃的试剂盒，含有KyHRM-17-45.71和KyHRM 3-46.12所述的引物对。

上述检测抗蚜桃的试剂盒，还含有KYYZ-SNP所述的引物对。

与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP标记，所获得的SNP标记为KyHRM-17-45.71和KyHRM3-46.12，分别位于桃基因组(Version 2.0)Scaffold 1的45.713Mb和46.121Mb处，主要通过如下方法得到：

(1)采用人工接种和套袋的方法对杂交后代单株进行表型鉴定，根据蚜虫危害特征进行表型评价，保证了结果的准确性；

(2)以抗蚜的01-77-3为母本，感蚜的中油13号为父本进行杂交，并获得杂交分离群体，在前期鉴定抗蚜和感蚜表型的基础上，对杂交后代单株的抗蚜和感蚜表型进行鉴定，根据表型鉴定结果确定分离比例；

(3)参考Genome Database for Rosaceae数据库的桃基因组(Version 2.0)序列，采用primer3Web Version 4.0(http://primer3.ut.ee/)设计引物，约每1Mb设计1对引物，扩增片段长度为约1600bp，用于开发基于Sanger测序的SNP标记；

(4)基因组DNA的提取采用CTAB法，略作修改；

(5)基于Sanger测序法获得SNP标记，并根据母本和父本的基因型确定候选SNP标记，并在杂交群体单株中进行序列测定，确定交换单株并进行精细定位；

(6)在精细定位区间内，结合母本为Aa，父本为aa的基因型开发紧密连锁的SNP标记，以进行性状鉴定。

有益效果：本发明采用基于SNP的第三代标记技术，结合构建的分离杂交群体，采用图位克隆的方法，对桃抗蚜的基因进行了精细定位，在精细定位区域内，开发稳定的、共显性和多态性的SNP标记，以获得与目标性状紧密连锁的标记。由于研究的对象具有抗蚜性状的种质，可依据获得的紧密连锁标记克隆目标性状的基因，应用于分子辅助选种。

附图说明

图1抗蚜表型图；

图2感蚜表型图；

图3 DNA琼脂糖电泳图(M1和M2为DNAmarker，1-7为部分提取DNA样品)；

图4与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记KyHRM-3-46.12的基因分型结果示意图；

图5与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记KyHRM-17-45.71的测序峰图和SNP位点示意图。

具体实施方式

实施例1

(一)、抗蚜表型的鉴定和群体构建

(1)抗蚜表型的鉴定

以01-77-3(抗蚜)为母本，中油桃13号(感蚜)为父本进行杂交，手工去雄并后人工授粉，行人工杂交后代108株实生苗分别放入网室中进行接种处理，人工接种绿蚜10头后套上小纱网，观察蚜虫对新梢的危害，以确定抗蚜和感蚜的表型，其中呈红点状无其他危害症状的为抗蚜类型(图1)，明显危害症状的为感蚜类型(图2)。

(二)、杂交群体分离表型的鉴定

本发明以01-77-3(抗蚜)和中油桃13号(感蚜)进行杂交，共得到108个实生苗单株。定植后于2014年4月进行人工接种蚜虫进行抗蚜、感蚜评价。通过对后代单株进行表型评价，发现其中抗蚜52株，感蚜56株，二者比例接近1:1，P值为0.700，符合孟德尔遗传规律，抗蚜性状为显性单基因控制。

(三)、基因组DNA的提取，SNP标记的开发、目标性状的定位

(1)基因组DNA的提取

采用CTAB法提取桃叶片基因组DNA，略作修改，具体如下：(1)取新鲜的叶子，放入玻璃碾钵中，加入液N₂进行碾磨，直至碾磨细粉状为止；(2)将叶片粉末转入2mL离心管，再加入配制好的CTAB液1300μL，进行1h长的65℃水浴，其间约每10min轻摇匀；(3)加入氯仿和异戊醇混合液，体积比为24：1，直至2mL的离心管满载线，后缓慢颠倒混匀10分钟。放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R)4℃条件下，12000rpm,离心10分钟；(4)吸取约1mL的上清液，转入2mL的离心管，加入氯仿和异戊醇的混合液，体积比为24:1，直至离心管满载线，轻轻颠倒摇匀10min。放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R)，4℃条件下，12000rpm,离心10分钟；(6)二次抽提后，用200μL的移液器小心吸取上清液600μL于1.5mL管中，加入等体积的无水乙醇，于-20℃冰箱1小时。之后，4℃条件下，12000rpm，离心10分钟，弃上清液；(8)在带有沉淀的离心管中加入500μL的70％的乙醇，10000rpm瞬时离心，洗涤沉淀2次，加入无水乙醇洗涤沉淀一次，用200μL移液器(Eppendorf)吸除离心管底部剩余无水乙醇，后自然晾干；(9)在室温下自然风干沉淀后，加入100μL体积的0.1×TE溶解沉淀DNA，同时加入0.5μL的RNase，37℃放置1h，祛除RNA污染(长期保存在-20℃冰箱，常用则存于4℃冰箱)；(10)采用NanoDrop1000spectrophotometer(Themo)和1％的琼脂糖胶对提取的DNA进纯度浓度和完整度进行检测，并稀释成工作液浓度(25ng/μL)，以用于后续研究。

(2)SNP开发的引物设计

参考Genome Database for Rosaceae数据库的桃基因组序列，采用primer3WebVersion4.0(http://primer3.ut.ee/)设计引物，引物参数为退火温度在60-63℃之间，引物长度20-23bp，开发基于Sanger测序的SNP标记，选择每1Mb设计1对引物，扩增片段长度约为1600bp。

(3)PCR反应体系以及SNP标记的获得

PCR扩增体系总体积为40μL，具体组分如下：

混匀后，在离心机(5810R，Eppendorf)离心，并在PCR仪(Eppendorf)上进行扩增。PCR扩增程序为95℃3min；94℃30s，54.3℃30s，72℃90s，34个循环；72℃10min。

我们对亲本、后代各两个单株进行PCR扩增，PCR产物送上海生工进行序列测定，将测序结果在Contig软件中打开，序列对齐后寻找多态性SNP标记。

(4)基于HRM(High Resolution Melting)的SNP基因分型

在获得亲本基因型和表型一直的SNP后，我们采用了HRM技术对杂交组合后代群体单株进行SNP基因分型。HRM master mix试剂购自Roche，在LightCycler 480II定量PCR仪(Roche)上进行SNP基因分型，HRM分析参考说明书进行。

(三)、目标性状紧密连锁标记的开发

基于测序结果，寻找紧密连锁的SNP标记，表现为抗蚜型母本基因型为Aa、感蚜父本基因型为aa，子代表型与基因型一致。在4个子代中获得紧密连锁的SNP标记后，扩大至子代各20个单株中，进而扩大至全部后代单株样品，确定紧密连锁的SNP标记后，继续开发SNP标记，实现精细定位。在精细定位区间依据父母本的基因型和表型开发更多的SNP标记，用于区分不同杂交后代单株，确立紧密连锁的SNP标记。

(四)、基于分子标记的植株表型鉴定

根据已经获得的紧密连锁的SNP标记的物理位置，参考桃基因组数据在新的亲本(10-7*96-5-1)中开发表型和基因型一致的SNP标记KYYZ-SNP。即在同一位点，抗蚜亲本基因型为Aa，感蚜基因型为aa，目的是利用分子标记对杂交后代单株的表型进行鉴定。通过标记表型和基因型比较，显示验证符合率为100％。

表1本发明所采用紧密连锁SNP标记的引物信息

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记的应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcgaaact cgtttaacaa aacaagtcac agaacaaccg caagtgtacg taagcaatcc 60

aacatccaac tacatgcaac cga 83

<210> 2

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagcaacga aacagggtta ctaactggac aaagcattaa gatgtttgct tttcattttt 60

tcagaaaata aacttaaccc cgggagcaat ttggaacata tacatttgtg aaaacagaag 120

cttacaagtt gtggcatcat cctcgctcat tccaaggaag agagctgt 168

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggttgcatg tagttggatg tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccggccggct atactatttc t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcagcaacga aacagggtta 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acagctctct tccttggaat ga 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgaatcgcaa tttcctcctc a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtatgcttt cacctgccct 20

Claims

1.与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记在桃树育种中的应用，其特征在于所述分子标记为KyHRM-17-45.71和KyHRM-3-46.12，分别位于桃基因组(Version 2.0)Scaffold 1的45.713Mb和46.121Mb处，其中KyHRM-17-45.71的等位基因为T和G，序列如SEQ ID NO.1所示，KyHRM-3-46.12的等位基因为C和G，序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述KyHRM-17-45.71位点基因型为T，KyHRM-3-46.12抗蚜位点基因型为G。

3.检测权利要求1所述与桃抗蚜基因紧密连锁的SNP分子标记的引物对，其特征在于KyHRM-17-45.71：5-CGGTTGCATGTAGTTGGATGTT-3

5-CCGGCCGGCTATACTATTTCT-3

KyHRM3-46.12：5-GCAGCAACGAAACAGGGTTA-3

5-ACAGCTCTCTTCCTTGGAATGA-3 。

4.检测杂交后代单株的引物对，其特征在于

KYYZ-SNP：5-CGAATCGCAATTTCCTCCTCA-3

5-AGTATGCTTTCACCTGCCCT-3。

5.一种检测抗蚜桃的试剂盒，其特征在于含有权利要求3所述的引物对。

6.根据权利要求5所述的一种检测抗蚜桃的试剂盒，其特征在于还含有权利要求4所述的引物对。