CN110551843A - 可区分烟草抗斑萎病位点rtsw纯合杂合基因型的共显性标记引物、区分方法及其应用 - Google Patents

Abstract

可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物、区分方法及其应用，所述引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成。本发明的共显性标记引物能够特异性的对烟草基因组DNA进行标记鉴定，检测烟草材料基因组DNA中RTSW的等位基因类型，不仅可以鉴定是否含有抗斑萎病位点RTSW，而且可以区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型，可靠且使用方便，与以往的抗斑萎病标记相比，具有与目标基因RTSW紧密连锁、准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，可大大提高抗烟草斑萎病基因RTSW品种的筛选效率，极大地缩短抗病烟草品种的育种周期，提高育种效率。

Description

可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记 引物、区分方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及可区分烟草抗斑萎病位点 RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物及其在烟草RTSW抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用。

背景技术

烟草斑萎病是由正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)病毒的侵染所造成的烟草病害。该属病毒是寄主范围最广、发生最为严重的一类植物病毒，其美洲型代表种番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Virus,TSWV)已对我国云南烟区的烟叶生产构成了较大的威胁。最近几年从云南各地(州、市)县采集样品检测结果看，云南全省烟草上TSWV均有分布并有扩大和加重的趋势。而更让人忧虑的是目前云南省的烤烟主栽品种均不抗TSWV，田间调查发现现有的主栽烤烟品种K326、红花大金元、云烟87等均能被TSWV侵染，成为TSWV流行、爆发的潜在因素。烟草斑萎病常用的防治手段主要依赖防治传毒介体蓟马，但由于蓟马具有发育历期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果，因而，选育抗斑萎病的烤烟品种是最经济、最有效的手段。

野生烟草资源含有丰富的抗性基因。研究表明花烟草(Nicotiana alata)对 TSWV具有很好的抗性。接种TSWV仅在接种叶表现过敏性坏死症状，在系统叶中检测不到病毒的存在。经过一系列的常规杂交和回交转育，研究人员已将该抗性基因从花烟草抗性转育至烤烟品种中，育成抗病育种中间材料Polalta。 Nicotiana alata和Polalta对TSWV的抗性是由显性的单基因(命名为RTSW) 位点控制。

但令人遗憾的是，抗病基因RTSW尚未被克隆。在短时间内无法克隆抗病基因的情况下，开发和抗病基因紧密连锁的分子标记成为烟草斑萎病抗病育种的重要手段。迄今为止，国际上仅有H.Moon和J.S.Nicholson(2007)开发了相应的分子标记，但其AFLP标记存在和抗性基因遗传距离较远，连锁不紧密，开发的SCAR标记在实际应用中存在容易产生假阳性的问题。而且这两种标记都无法区分抗性位点的纯合/杂合基因型，限制了这些标记的大规模应用。在利用RTSW进行烟草抗斑萎病的育种过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出RTSW纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。共显性标记 (codominancemarker)是能同时检测出显性和隐性等位基因、能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记。因此，开发可用于区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记，可以建立一种简便、快速、准确、灵敏的鉴定烟草抗斑萎病基因方法，弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物和采用所述引物区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法以及所述引物在烟草斑萎病抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用具体应用，该分子标记引物及鉴别方法可用于筛选含有RTSW抗病基因位点的资源和育种单株，并可以精确的获得含有 RTSW抗病基因位点的纯/杂合基因型，达到简便、快速、准确、灵敏的鉴定烟草抗斑萎病基因位点方法的效果，为选育出高抗斑萎病的烟草育种材料提供技术手段。

在本发明的上下文中，术语“抗斑萎病基因位点RTSW”是指包含烟草斑萎病抗病基因(RTSW基因)野生烟染色体片段的位点。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物，所述引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成；

所述引物1序列为Seq ID No.1：

RTSW_Marker3_F 5’-TCTGGCTCCGCTACTGTCT-3’；

所述引物2序列为Seq ID No.2：

RTSW_Marker3_R 5’-AGCATTAGGGTTGTAGGATAGGG-3’。

采用所述引物区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法，步骤如下：

(1)分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326 的基因组DNA为模板，用由分子标记RTSWMarker3的引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增，在含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为522bp，其序列为SEQ ID No.3；在不含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为465bp，其序列为SEQID No.4；

(2)将扩增的PCR产物通过电泳检测或者测序，按照如下方法鉴别并确定待鉴定烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型：

1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带仅与Polalta的带型相同，且含有大小为522bp的条带，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗性RTSW基因位点纯合；

2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带仅与K326的带型相同，且含有大小为465bp的条带，则待鉴定烟草为感斑萎病烟草或候选为感斑萎病烟草，且基因型为感病rtsw基因位点纯合；

3)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带同时含有与 Polalta和K326带型相同的条带，且大小分别为522bp和465bp，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗病RTSW/rtsw,基因位点杂合。

本发明提供了所述区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物在烟草斑萎病抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用。

进一步地，本发明在提取待鉴定烟草DNA时，可采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。

进一步地，本发明所述的用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物 2各0.5μL，50ng/μL模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR 反应程序为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

本发明所述由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物包含在Seq ID No.1或Seq ID No.2的5’端或3’端分别增加1～30个碱基扩增得到的基本相同DNA片段的引物。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明的引物是与RTSW基因位点紧密连锁的标记，本发明所建立的分子标记方法是基于PCR技术产生共显性标记，可用于抗病基因的图位克隆和分子标记辅助选择，通过检测抗斑萎病基因位点来预测烟草对斑萎病的抗性，区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型，可以在烟草的实生苗阶段进行淘汰选择，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加速烟草抗斑萎病育种进程。

具体体现在以下几点：

1.紧密连锁：实验证明，利用本方法对烟草育种材料辅助鉴定的结果与抗性鉴定结果完全一致，而利用以往的抗斑萎病AFLP和SCAR标记，有部分结果和抗性鉴定不一致，表明该方法能够用于烟草抗斑萎病育种的分子标记辅助选择。

2.准确性高:利用本方法对烟草育种材料辅助鉴定的结果，条带清晰，带型差别明显，而以往的抗斑萎病SCAR标记扩增片段在100-200bp之间，极易和引物二聚体所在的条带位置产生混淆。与以往的抗斑萎病标记相比，该检测方法克服了假阳性高、稳定性差等问题，准确率达100％。

3.成本低廉：本研究利用普通PCR体系，PCR产物经过电泳即可完成检测，有效降低高通量检测成本。

4.检测效率高：与以往的抗斑萎病AFLP标记相比，本研究仅仅只用一次电泳分析，克服了以往检测需要聚丙烯凝胶电泳的缺点，极大地提高了检测效率。

5.操作简单：用本发明标记检测育种材料的抗烟草斑萎病基因RTSW操作简单，不仅节省生产成本，而且大大提高抗烟草斑萎病基因RTSW品种的筛选效率，极大地缩短抗病烟草品种的育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1是本发明以分子标记引物1和引物2为引物，对基因组DNA进行扩增的产物电泳检测结果,泳道1为抗病亲本Polalta，泳道2为烟草斑萎病抗源P olalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交F1单株；泳道3为感病亲本K326；

图2为本发明以引物1和引物2为引物对烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交后代BC6F3分离群体210个单株扩增产物的电泳检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性分子标记引物，所述分子标记为Seq ID No.3或Seq ID No.4所示序列，所述的分子标记可以由引物1和引物2组成的引物扩增获得。所述引物由引物1和引物2的两条单链 DNA组成。

所述引物1序列为Seq ID No.1：

RTSW_Marker3_F 5’-TCTGGCTCCGCTACTGTCT-3’；

所述引物2序列为Seq ID No.2：

RTSW_Marker3_R 5’-AGCATTAGGGTTGTAGGATAGGG-3’；

序列Seq ID No.3：

AGCATTAGGGTTGTAGGATAGGGGGTAGCGGAGCTCTTTGCTACTCCGTACCGGATGAGAGGCTAGTCTGACAGGGTTGTGTCCTAGAGTACTAGTAGTTATTGTTGTGTCCAAATTTCTCTTTCACTTTTCATAG TAGCGAGCCTTTCTTACGTGTTACTGCTATTGTTTTTCATCTATTTTCTGGTACTTTTGATTCTGTTA TTATTTCTCAGCTTTCTGCTGTTGGTACTGATATATTGTCTTTTTTGTATGCTTGAGCCGAGGGTCTA TCGGAAACAGCCTCTCTACCCCTTGGGTTAGGGGTAAGGTCTGCATACACTCTACCCTCCTCAGACCC ATTGGTAGGGTTTTACTGGGTTGTTGTGGTTGTGGGGTGGTTGGTGGTTCTTGGCTTTGCAGAAAATC TTATCTGAGAAGCAGATATGTTTACTTATTTAGCTGTTTTTTTCCAACATAGATCCTTCTGCTTATCT TCCTAATTTAGGTTTATTGTGCACCTCAGACAGTAGCGGAGCCAGA

序列Seq ID No.4：

AGCATTAGGGTTGTAGGATAGGGGTAGTAAAACTTTCATTACTTCATACCGGGGGTGAGGCGGGATTGGATTAGGGTTGATCTTAGATGGCTTGCAGTTTATGTTGAACCCACACTATTCTTGTTGTTTATCTTAG CCTCGGGCCTTAGATTCTGGTTACTGTTATTGCATGTCATTCATCTTTTCATTTTTATGCTTCTGTTA CTATTACGGTTTCTACTGGAGTTACTAATGAATTCTCTTTTCTTGTTTTTTATTTTATTTTCGTCTTT TTGAGCCGAGGGTCTATCGGAAACAGCCTATCTGTCCCTATCGGGGCAGGGGTAAGGTATGCGTACAC ATTACCTTCCCTAGACCCCACTATGTGGGATTTTACTGGGTAGTTATTGTTGTTGTTGTTGAGATCCT TCTGCAGATCTTCCTAATTTAGGTTTACTGTGCACCTCAGACAGTAGCGGAGCCAGA

采用所述引物区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法，具体步骤如下：

(1)分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326 的基因组DNA为模板，用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增，利用由分子标记RTSWMarker3的引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增，在含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为522bp，其序列为SEQ IDNo.3；在不含RTSW 基因的植株扩增得到所特有的片段大小为465bp，，其序列为SEQ IDNo.4。提取待鉴定烟草DNA时，可以采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。对烟草DNA的提取方法为本领域常规的提取方法，可以为CTAB 法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。

在用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行 PCR扩增时，PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta 与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，50ng/ μL模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

(2)将扩增的PCR产物通过电泳检测或者测序扩增产物，按照如下方法鉴别并确定待鉴定烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型：

1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳后的条带与Polalta的带型相同，且含有大小为522bp的条带，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗性RTSW基因位点纯合(RTSW/RTSW)；

2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳后的条带与K326的带型相同，且含有大小为465bp的条带，则待鉴定烟草为感斑萎病烟草或候选为感斑萎病烟草，且基因型为感病rtsw基因位点纯合(rtsw/rtsw)；

3)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳后的条带同时含有与Polalta 和K326带型相同的条带，且大小分别为522bp和465bp，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗病RTSW基因位点杂合 (RTSW/rtsw)。

本发明所述可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物可应用于烟草斑萎病抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种。利用本发明的引物，以待检测的烟草基因组DNA为模板进行PCR，可以得到检测烟草中是否含有烟草抗斑萎病基因位点RTSW并可以区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用由引物1 和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增。所述检测还可以通过高通量测序方法检测是否含有本发明所述引物序列及扩增产物。

本领域技术人员熟知，在Seq ID No.1或Seq ID No.2序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～30个碱基，所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA上与Seq ID No.1或SeqID No.2相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物与Seq IDNo.1或Seq ID No.2的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No.1或Seq ID No.2 的5’端或3’端分别增加1～30个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物，均包括在本发明的引物中。

本发明利用了包含RTSW抗斑萎病基因位点的抗TSWV烟草材料：Polalta，未包含RTSW抗斑萎病基因位点的感TSWV材料K326以及烟草斑萎病抗源 Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交及回交、自交获得的BC6F3后代。以上烟草材料均为常见的烟草种质资源，公众可从烟草种质资源保存单位或云南省烟草农业科学研究院获得。限制性内切酶、卡拉霉素、壮观霉素，Taq DNA聚合酶2×Premix Ex TaqMix均购自大连宝生物公司。其他化学试剂均为市售产品。N.tobacum(K326)的参考基因组序列已在(Edwards et al.,2017,Areference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning ofhomeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency.Bmc Genomics18,448.)中公开，公众可从 https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome获得。

本发明的一个具体的操作实例如下：

1、利用分离群体烟草抗性鉴定构建抗感池及转录组测序。

取将烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交及回交、自交获得的BC6F3后代210株，利用无毒基因浸润的方法进行TSWV抗病性鉴定，并更加具体的，所述抗病性鉴定方法参见中国专利申请201710414755.X(一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法)。4～5片叶时，选取完全展开的顶部叶片，在同一张叶片上选取三个位置分别接种pK2-35S-NS m、pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b。其中pK2-35S-NSs 作为阴性对照，pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b为阳性对照，阳性对照在所有的烟草上都会产生过敏性坏死。烟苗接种后20～28℃的光照培养室中培养72h，调查观察待检测烟草叶片上pK2-35S-NSm引起的过敏坏死(HR反应)。210株中有161株产生HR反应，为抗性单株， 49株没有HR反应，为感病单株。结果见表1

从161株抗性单株和49株感病单株中分别随机选择40株构建抗性池(R-pool)和感性池(S-pool)，其构建方法为分别从选取的抗病 40株单株单株中每株取0.1g叶片，共计4g混合后构建抗性池(R-po ol)，碾磨成粉末后送样进行转录组测序。利用相同的方法构建感性池 (S-pool)并送样测序。

转录组测序选用华大基因的BGI500测序平台进行，抗/池每个样品测序获得12Gb的测序数据。

2、抗性连锁分子标记的筛选。

将转录组获得的抗/感池数据分别比对至K326参考基因组，通过 SNP分型，共发现抗/感池之间Dealta值大于0.4的SNP位点共计60 47个，其SNP主要集中于K326的7号染色体，因此将抗斑萎病基因定位于第7号染色体。调取SNP存在的Reads并根据K326的基因组为参考基因组进行序列拼接。利用这些SNP所在的基因组序列进行高频 SNP搜索，共获得含有SNP富集的31个序列用于开发抗斑萎病相关的分子标记。提取烟草抗斑萎病亲本材料Polalta、感斑萎病亲本材料K 326、烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀)杂交F1 的基因组DNA，根据获得的31个序列设计引物，PCR扩增后进行电泳筛选双亲间的多态性标记。最终获得本发明所述的由引物1和引物2 的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增在双亲间有明显的多态性。

PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10 μmol/L上游引物1和下游引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA 2 μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序：94℃预变性5 min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3 0s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

电泳结果表明：从图1所示结果表明，利用由引物1和引物2、的两条单链DNA组成的PCR标记引物对上述Polalta、K326及F1材料进行PCR扩增，所有材料都得到扩增，没有假阴性结果出现，表明本研究所验证的PCR反应体系完全正常，符合检测要求。PCR产物进行电泳比较分析，泳道1为抗病亲本Polalta，PCR扩增产物经电泳后含有两个条带，其中522bp大小的条带为明显的特异性条带，550b p大小的条带为非特异性条带；泳道2为烟草斑萎病抗源Polalta(♂) 与主栽感病品种K326(♀)杂交F1单株，PCR扩增产物经电泳后三条条带，大小分别522bp和465bp为明显的特异性条带，550bp大小的条带为非特异性条带；泳道3为感病亲本K326，PCR扩增产物经电泳后含有两个条带，其中465bp大小的条带为明显的特异性条带，5 50bp大小的条带为非特异性条带。表明双亲间利用此标记存在多态性。将来源于抗病亲本的522bp特异性条带和来源于感病亲本的550 bp条带割胶回收进行克隆测序获得分子标记序列SEQ ID No.3和SE Q ID No.4。

3、利用烟草斑萎病抗源Polalta(♂)与主栽感病品种K326(♀) 杂交及回交、自交获得的BC6F3后代分离群体210个单株对多态性标记进行验证。

对其单株编号，分别提取210个不同单株的DNA样品，按照传统的核酸提取方法CTAB法，以纯化后的基因组DNA作为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×Premix Ex Taq Mix PCR Buffer 12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。取PC R反应产物进行电泳检测验证。

所述引物1序列为Seq ID No.1：

RTSW_Marker3_F 5’-TCTGGCTCCGCTACTGTCT-3’；

所述引物2序列为Seq ID No.2：

RTSW_Marker3_R 5’-AGCATTAGGGTTGTAGGATAGGG-3’；

电泳结果表明：图2为本申请人建立的区分烟草抗斑萎病位点RT SW纯合杂合基因型的共显性标记的电泳分析。从分析结果来看，条带亮度高，条带清晰易辨认，条带大小差别明显。如果待鉴定烟草的PC R扩增产物经电泳后的条带与Polalta的带型相同，且含有大小为5 22bp的条带，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗性RTSW基因位点纯合(RTSW/RTSW)；如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳后的条带与K326的带型相同，且含有大小为46 5bp的条带，则待鉴定烟草为感斑萎病烟草或候选为感斑萎病烟草，且基因型为感病rtsw基因位点纯合(rtsw/rtsw)；如果待鉴定烟草的 PCR扩增产物经电泳后的条带同时含有与Polalta和K326带型相同的条带，且大小分别为522bp和465bp，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗病RTSW基因位点杂合(R TSW/rtsw)。

通过标记检测结果发现，仅含有522bp带型的单株有39株(抗性纯合，RTSW/RTSW)，仅含有465bp带型的单株有50株(感病纯合，rt sw/rtsw)，杂合带型121株(抗性位点杂合)。抗性检测纯度鉴定结果表明，210个单株中，160个为抗病植株，50个为感病植株，与标记检测结果一致，准确率达到100％。通过将本发明所建立的快速鉴定烟草抗斑萎病基因位点RTSW的分子标记结果和抗性鉴定结果对比后发现，210个样品的抗性鉴定结果完全一致，表明该方法结果稳定可靠准确性极高，没有出现假阳性结果(见表1)。

表1 BC6F3群体抗性鉴定及标记检测结果统计

4、抗斑萎病位点RTSW等位基因类型的验证

从上述第3点中的BC6F3群体210个单株中随机选取抗性RTSW 基因位点纯合(RTSW/RTSW)，基因型为感病rtsw基因位点纯合(rts w/rtsw)，且基因型为抗病RTSW基因位点杂合(RTSW/rtsw)各5株自交留种，获得BC6F4种子并每株播种30株做左右，对BC6F4每个单株进行抗病性检测，确定BC6F4单株的等位基因类型。从表2可以看出随机选择的BC6F3单株后代抗/感分离比完全符合BC6F3单株的标记检测结果，表明该方法结果稳定可靠准确性极高，没有出现假阳性结果。

表2部分BC6F3单株自交留种后BC6F4单株抗病性检测

由此可见，本发明所提供的检测烟草对斑萎病抗性的方法可靠、简便、实用，在烟草种质资源评价和育种标记的辅助选择中具有重要应用前景，同时为培育对斑萎病高抗的烟草品种提供了参考依据。

实施例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

以上实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物、区分方法及其应用

<141> 2019-09-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> RTSW_Marker3_F

<400> 1

tctggctccg ctactgtct 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> RTSW_Marker3_R

<400> 2

agcattaggg ttgtaggata ggg 23

<210> 3

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agcattaggg ttgtaggata gggggtagcg gagctctttg ctactccgta ccggatgaga 60

ggctagtctg acagggttgt gtcctagagt actagtagtt attgttgtgt ccaaatttct 120

ctttcacttt tcatagtagc gagcctttct tacgtgttac tgctattgtt tttcatctat 180

tttctggtac ttttgattct gttattattt ctcagctttc tgctgttggt actgatatat 240

tgtctttttt gtatgcttga gccgagggtc tatcggaaac agcctctcta ccccttgggt 300

taggggtaag gtctgcatac actctaccct cctcagaccc attggtaggg ttttactggg 360

ttgttgtggt tgtggggtgg ttggtggttc ttggctttgc agaaaatctt atctgagaag 420

cagatatgtt tacttattta gctgtttttt tccaacatag atccttctgc ttatcttcct 480

aatttaggtt tattgtgcac ctcagacagt agcggagcca ga 522

<210> 4

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agcattaggg ttgtaggata ggggtagtaa aactttcatt acttcatacc gggggtgagg 60

cgggattgga ttagggttga tcttagatgg cttgcagttt atgttgaacc cacactattc 120

ttgttgttta tcttagcctc gggccttaga ttctggttac tgttattgca tgtcattcat 180

cttttcattt ttatgcttct gttactatta cggtttctac tggagttact aatgaattct 240

cttttcttgt tttttatttt attttcgtct ttttgagccg agggtctatc ggaaacagcc 300

tatctgtccc tatcggggca ggggtaaggt atgcgtacac attaccttcc ctagacccca 360

ctatgtggga ttttactggg tagttattgt tgttgttgtt gagatccttc tgcagatctt 420

cctaatttag gtttactgtg cacctcagac agtagcggag ccaga 465

Claims (6)

1.可区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的共显性标记引物，其特征在于，所述引物组由引物1和引物2的两条单链DNA组成；

所述引物1序列为Seq ID No.1：

RTSW_Marker3_F 5’-TCTGGCTCCGCTACTGTCT-3’；

所述引物2序列为Seq ID No.2：

RTSW_Marker3_R 5’-AGCATTAGGGTTGTAGGATAGGG-3’。

2.采用如权利要求1所述引物组区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，用由分子标记RTSWMarker3的引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增，在含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为522bp，其序列为SEQ ID No.3；在不含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为465bp，其序列为SEQID No.4；

(2)将扩增的PCR产物通过电泳检测或者测序，按照如下方法鉴别并确定待鉴定烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型：

1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带仅与Polalta的带型相同，且含有大小为522bp的条带，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗性RTSW基因位点纯合；

2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带仅与K326的带型相同，且含有大小为465bp的条带，则待鉴定烟草为感斑萎病烟草或候选为感斑萎病烟草，且基因型为感病rtsw基因位点纯合；

3)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带同时含有与Polalta和K326带型相同的条带，且大小分别为522bp和465bp，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗病RTSW/rtsw,基因位点杂合。

3.权利要求1所述与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物在烟草斑萎病抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用。

4.采用如权利要求2所述的引物组区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法，其特征在于，提取待鉴定烟草DNA时，采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。

5.采用如权利要求2所述的引物组区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法，其特征在于，所述的用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物组进行PCR扩增，PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，50ng/μL模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

6.采用如权利要求2所述的引物组区分烟草抗斑萎病位点RTSW纯合杂合基因型的方法，其特征在于，所述由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物组包含在Seq ID No.1或Seq ID No.2的5’端或3’端分别增加1～30个碱基扩增得到的基本相同DNA片段的引物组。