CN105063185B - 小麦穗长主效qtl的紧密连锁标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦穗长主效QTL的紧密连锁标记及其应用。本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的引物对，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用序列表中序列1和序列2所示引物对进行PCR扩增所得的DNA片段，具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成。以小麦基因组为模板，采用该引物进行PCR扩增所得产物即为小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记。本发明可用于小麦穗长的分子标记育种，为小麦穗长QTL的精细定位提供标记基础，加速小麦高产育种的进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种小麦穗长主效QTL的紧密连锁标记及其应用。
背景技术
小麦是世界上的重要粮食作物之一，养活了世界上35％的人口。世界范围内小麦的育种目标是不断提高小麦产量。小麦单产取决于三个产量因素，即单位面积成穗数、穗粒数和籽粒重量。这三个产量因素是提高小麦产量的重要组成成分。
小麦的籽粒生长于穗部，因此穗部性状与三个产量因素密切相关。除此之外，穗部参与抽穗后的光合作用，对于籽粒灌浆起重要作用，尤其是干旱环境中。穗部形态结构主要包括穗长、小穗密度和可育小花数且这些性状都属于数量性状。
前人对于穗部性状尤其是易于考查的穗长性状展开了诸多研究。例如，有研究表明穗长性状与小穗密度也有很高的相关性。另外，穗长(SPL)与根部生物量、秸秆生物量、收获指数以及籽粒产量成正相关。虽然穗越长，密实度越小，但可以降低赤霉病的感病率，从而减少由于病害引起的产量损失和品质下降。
目前，小麦产量及相关性状的QTL定位和克隆研究是小麦数量性状研究的热点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的引物对。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的引物对，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用序列表中序列1和序列2所示引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。
具体的，所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成。
所述引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述引物对的制备方法，包括将所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的试剂盒，含有所述引物对和如下中的至少一种：dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法，包括将引物对和如下中的至少一种分别单独包装的步骤：dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液。
本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦杂交后代的穗长性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦杂交后代的穗长性状的方法，具体可包括如下步骤：
(a1)分别以小麦A、小麦B以及由所述小麦A和所述小麦B杂交而来的小麦杂交后代群体中的每个个体的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)分别进行PCR扩增，得到所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物；
所述小麦A的穗长大于所述小麦B的穗长；
(a2)将所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物分别进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述小麦杂交后代的穗长性状：与所述小麦A的PCR产物的电泳条带的带型相同的所述小麦杂交后代的穗长大于或候选大于与所述小麦B的PCR产物的电泳条带的带型相同的所述小麦杂交后代。
本发明的第四个目的是提供一种从小麦杂交后代群体中获得穗长相对较长的个体的方法。
本发明所提供的从小麦杂交后代群体中获得穗长相对较长的个体的方法，具体可包括如下步骤：
(b1)分别以小麦A、小麦B以及由所述小麦A和所述小麦B杂交而来的小麦杂交后代群体中的每个个体的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)分别进行PCR扩增，得到所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物；
所述小麦A的穗长大于所述小麦B的穗长；
(b2)将所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物分别进行电泳，选取所述小麦杂交后代群体中与所述小麦A的PCR产物的电泳条带的带型相同的个体，即为或候选为所述小麦杂交后代群体中所述穗长相对较长的个体。
对于上述两种方法，在本发明中，所述小麦A具体为小麦品种农大3338；所述小麦B具体为小麦品种京冬6号。相应的，所述小麦杂交后代群体具体为由小麦品种农大3338和小麦品种京冬6号杂交而来的小麦杂交后代群体。
当然，所述小麦A也可为除小麦品种农大3338外符合条件A的任一品种的小麦；所述条件A为：以基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，电泳条带的带型与参照带型A相同；所述参照带型A为以小麦品种农大3338的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型。
相应的，所述小麦B也可为除小麦品种京冬6号外符合条件B的任一品种的小麦；所述条件B为：以基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，电泳条带的带型与参照带型B相同；所述参照带型B为以小麦品种京冬6号的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型。
所述小麦A和所述小麦B中，任一为母本，另一为父本。
在上述两种方法中，所述小麦杂交后代具体可为小麦杂交后代的DH群体。
本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦的基因组中是否含有小麦穗长主效QTL QSl-5A.1的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测小麦的基因组中是否存在小麦穗长主效QTLQSl-5A.1的方法，具体可包括如下步骤：
(c1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，得到PCR产物；
(c2)将所述PCR产物进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测小麦的基因组中是否存在所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1：若所述PCR产物的电泳条带的带型与参照带型A相同，或同时含有所述参照带型A和参照带型B，则所述待测小麦的基因组中存在或候选存在所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1；若所述PCR产物的电泳条带的带型与参照带型B相同，则所述待测小麦的基因组中不存在或候选不存在所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1；
所述参照带型A为以小麦品种农大3338的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型；
所述参照带型B为以小麦品种京冬6号的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型。
其中，所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1位于小麦5A染色体上，定位于SNP标记Kukri_rep_c72329_163和SSR标记AL-127之间；所述SSR标记AL-127是以小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增得到的DNA片段；所述SNP标记Kukri_rep_c72329_163的检测探针序列为序列表中序列3。
本发明的第六个目的是提供一种培育穗长增加的小麦品种的方法。
本发明所提供的培育穗长增加的小麦品种的方法，是选取符合如下条件的小麦作为亲本进行育种：以基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，电泳条带的带型与参照带型A相同；
所述参照带型A为以小麦品种农大3338的基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型。
在前述四种方法中，所述PCR扩增时采用的退火温度具体可为60℃。
进一步，所述PCR扩增的反应条件具体为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃30s，36个循环；72℃ 10min；12℃保温。
进一步，所述PCR扩增的反应体系具体为：40ngμL-1模板DNA 1.0μL；10×PCRbuffer 1.0μL；dNTPs 0.2μL；引物2.0μL(上下游引物各1.0μL)；rTaqDNA聚合酶0.1μL；ddH2O 5.7μL。
在前述四种方法中，所述电泳具体可为聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％(质量百分含量)。
本发明的第七个目的是提供一种与小麦穗长性状相关的分子标记。
本发明所提供的与小麦穗长性状相关的分子标记，具体为以小麦基因组DNA为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增所得的DNA片段。
所述引物对(序列1和序列2)或所述试剂盒或所述分子标记或所述DNA分子在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状；
(2)小麦育种。
本发明针对小麦5A染色体上初定位的穗长主效QTL(名称为QSl-5A.1)，继续开发目标区间内的分子标记，获得与目标QTL紧密连锁的分子标记，从而应用于穗长性状的选择应用上，为穗长主效QTL的精细定位和分子标记辅助育种奠定基础，加速小麦高产育种的进程。
附图说明
图1为农大3338/京冬6的DH群体203个系的穗长直方图。
图2为穗长主效QTL QSl-5A.1区间的分子标记遗传图谱。
图3为利用分子标记AL-127对189份小麦材料中的部分材料的基因型检测结果。其中，A表示与母本农大3338基因型相同(电泳带型相同)；B表示与父本京冬6号基因型相同(电泳带型相同)。
图4为189份小麦材料的穗长直方图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦品种农大3338：“逯腊虎等；普通小麦农大3338×京冬6号DH系群体株高及节间长度的QTL分析,中国农业大学学报；[J]；2014年01期”中公开过，公众可从中国农业大学获得，用以重复本发明。
小麦品种京冬6号：“逯腊虎等；普通小麦农大3338×京冬6号DH系群体株高及节间长度的QTL分析,中国农业大学学报；[J]；2014年01期”中公开过，公众可从中国农业大学获得，用以重复本发明。
实施例1、小麦穗长主效QTL QSl-5A.1的定位及其紧密连锁SSR标记AL-127的获得
一、实验材料
1、两个小麦亲本农大3338、京冬6号的幼嫩叶片提取DNA后用于差异引物的筛选。
2、农大3338/京冬6的DH群体，共203个系，用于目标区间的遗传图谱构建。其中，农大3338/京冬6的DH群体是以小麦品种农大3338为母本，以小麦品种京冬6号为父本杂交得到F1，并对F1代植株进行花药培养再加倍后，自交多代后获得的203个株系组成的。
二、小麦穗长性状鉴定
小麦穗长性状的测定在小麦灌浆期进行，从小麦穗基部到顶部的长度(不包括芒长)即为穗长，对农大3338/京冬6的DH群体203个系的穗长数据进行分析，绘制频率分布图，结果如图1和表1所示。
三、小麦穗长主效QTL QSl-5A.1的定位及其紧密连锁SSR标记AL-127的获得
1、小麦基因组DNA大量提取(改良CTAB法)
(1)取小麦植株幼嫩叶片10-20mg，置于1.5ml Eppendorf管中，加入液氮，研成细粉。
(2)在离心管中加入65℃预热的1×CTAB提取缓冲液600μl，轻轻振荡混匀。
(3)在65℃水浴锅中温浴30min，且每10min小心摇动离心管一次。
(4)30min后取出离心管，在通风橱中加入等体积氯仿:异戊醇(体积比24:1)，并小心充分摇动离心管2-3min，然后静置至有机相由无色→绿色→深绿色。
(5)室温下，10000rpm离心10min，然后吸上清500μl至新的离心管中。
(6)在上清中加入等体积预冷的异丙醇(-20℃)，小心混匀后于-20℃放置15min。
(7)室温下，10000rpm离心5min，小心倒掉上清后加入70％乙醇600μl进行漂洗，轻微摇动离心管，使DNA悬浮起来。
(8)室温下，10000rpm离心3min，然后小心倒掉上清并放置常温干燥。
(9)待DNA晾干后，加入适量的灭菌ddH2O，充分溶解DNA。
(10)用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，存在-20℃冰箱中备用。
2、目标片段的扩增
PCR反应体系(10μl体系)如下：40ngμL-1模板DNA 1.0μL；10×PCR buffer 1.0μL；dNTPs 0.2μL；引物2.0μL(上下游引物各1.0μL)；rTaqDNA聚合酶0.1μL；ddH2O5.7μL。
PCR反应程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，36个循环；72℃10min；12℃保温。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
A.制胶
(1)将干净的两块玻璃板及垫片用夹子加紧，8％的胶(ml)：20％APS(μl)：TEMED(μl)按1:10:1的比例配好混匀，快速封底；
(2)准备干净的梳子，待封底的胶凝固，依每板35ml的8％的胶按同样的比例配胶，立即灌胶；如有气泡，则轻轻敲打玻璃板赶出气泡，平行插入干净的梳子；
(3)为防止残胶，待胶凝固后及时小心拔出梳子，将胶板固定在电泳槽上，加入1×TBE缓冲液。
40％PAGE溶液(5L)：去离子水2000ml；N,N’-甲叉双丙烯酰胺50g；丙烯酰胺1950g；搅拌器搅拌，充分溶解，定容至5L。
8％PAGE溶液：40％PAGE溶液稀释5倍即按40％PAGE:5×TBE缓冲液:去离子水＝1:1:3的比例稀释。
5×TBE缓冲液(5L)：Tris 270.00g；硼酸137.50g；EDTA-Na218.61g；去离子水定容至1L。
B.电泳
(1)在扩增的PCR产物中加入2.0μl的6×Loading Buffer，离心后，每孔点样4μl且每板有1孔点4μl的100bp DNA Ladder；
(2)常温下，在GT核酸电泳系统(Bio-Rad,USA)中200V预电泳2min，然后在120V恒压下电泳5h左右。
6×Loading Buffer(100ml)：0.5M EDTA(pH8.0)2ml；去离子甲酰胺98ml；溴酚兰0.05g；二甲苯氰0.05g。
1×TBE电泳缓冲液：5×TBE缓冲液稀释5倍即按5×TBE缓冲液:去离子水＝1:4的比例稀释。
C.银染
(1)0.1％染色液：待电泳结束，取干净的银染盆，称取0.50g的AgNO3，500ml去离子水，混匀；
(2)染色：将胶板卸下，剥胶放入0.1％染色液中，每盆银染4板胶，然后在摇床上轻轻摇动，染色15min；
(3)显色液：NaOH 10.00g，无水Na2CO30.20g-0.30g，去离子水500ml，甲醛750μl；
(4)显色：待染色15min后，小心倒掉显色液并用去离子水快速漂洗30s，每盆加入显色液500ml，继续放在摇床上，轻轻摇动10min左右；
(5)照胶：待凝胶变成浅黄，DNA条带完全显现，倒掉显色液，清水冲洗，用照相机记录每板胶的条带情况，以便读取带型。
4、穗长主效QTL QSl-5A.1定位及QSl-5A.1区间特异SSR标记的开发
利用复合区间作图的方法，对小麦穗长性状进行QTL分析，LOD值取1000次pernutation的0.05水平作为临界值，结果在小麦5A染色体上检测到一个穗长主效QTLQSl-5A.1，其加性效应为0.33cm-0.66cm，可解释穗长变异的10.36％-20.92％，该QTL位于SNP标记Kukri_rep_c72329_163和SSR标记Xbarc330之间且该区间内暂无其他标记的报道。在此基础上，本发明针对目标区间Kukri_rep_c72329_163-Xbrac330，继续开发新的分子标记，以期为该穗长QTL QSl-5A.1的精细定位和分子标记辅助育种奠定标记基础。
根据国际小麦基因组测序协会(http://www.wheatgenome.org/)发布的genomezipper，进行穗长主效QTL QSl-5A.1区间内小麦与水稻、短柄草的染色体共线性关系比对。根据同源性关系比对结果，利用该区间所对应的水稻染色体区间内所包含的水稻基因序列，根据序列同源性比对从小麦基因组测序协会数据库中提取获得目标QTL区间内的基因组序列。在此基础上，借助primer3.0进行目标区间内的引物设计。经亲本间PCR扩增和8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及小群体验证，最终获得QSl-5A.1区间内多态性明显且带型清晰的特异SSR标记。
经筛选，鉴定出QSl-5A.1区间内多态性明显且带型清晰的13对SSR标记，分别为AL-127、AL-191、AL-45、AL-54、AL-50、AL-60、AL-178、AL-32、AL-73、AL-38、AL-39和AL-47。
5、QSl-5A.1区间遗传图谱加密
利用穗长QTL QSl-5A.1定位区间(分子标记Kukri_rep_c72329_163和Xbrac330之间)上的所有分子标记，即QSl-5A.1区间两端的分子标记Kukri_rep_c72329_163和Xbrac330及步骤4中新开发的13对多态性SSR标记，以亲本农大3338、京冬6号，以及农大3338/京冬6的DH群体的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并将PCR扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测统计各分子标记在DH群体中的扩增带型。在此基础上，借助作图软件JoinMap4.0进行QSl-5A.1区间内的遗传图谱构建，其中带型与亲本农大3338相同的记为A，与亲本京冬6号相同的记为B，缺失时记为“-”)。利用Kosambi函数，获得15个分子标记在目标区段上的最优顺序及标记间新的遗传距离即目标区段内的遗传连锁图谱(图2)。
图2表明，15个SSR标记均被加密到目标区间Kukri_rep_c72329_163-Xbrac330的相对中间位置的区间内且相互间的遗传距离都较小。
6、与QSl-5A.1紧密连锁标记的获得
针对203个株系DH群体，结合QTL QSl-5A.1定位区间(分子标记Kukri_rep_c72329_163和Xbrac330之间)内13个标记(即步骤4中新开发的13个标记)的基因型及7个环境下的穗长表型，同样利用WinQTLCart 2.5软件，通过复合区间作图法，对穗长QTL进行再次定位发现，穗长主效QTL均被定位到标记Kukri_rep_c72329_163和AL-127之间，且距离SSR标记AL-127最近，其LOD值平均值为12.77，加性效应为0.57cm，平均可解释表型变异的21.90％。与初定位的结果相比，该穗长主效QTL的目标区间缩小到Kukri_rep_c72329_163和AL-127之间，且与SSR标记AL-127紧密连锁，其效应值均增大，增效基因仍来自长穗亲本农大3338。具体参见表1和表2。
表1 农大3338/京冬6号的203个株系DH群体的穗长表型数据及AL-127基因型数据
| 株系 | 平均穗长(cm) | 基因型 |
| 1 | 8.60 | B |
| 2 | 8.87 | A |
| 3 | 8.28 | - |
| 4 | 9.27 | B |
| 5 | 7.85 | B |
| 6 | 9.68 | A |
| 7 | 8.72 | - |
| 8 | 7.40 | B |
| 9 | 8.37 | B |
| 10 | 8.54 | B |
| 11 | 8.59 | A |
| 12 | 9.87 | A |
| 13 | 7.26 | B |
| 14 | 8.70 | B |
| 15 | 9.69 | A |
| 16 | 9.55 | B |
| 17 | 10.49 | A |
| 18 | 9.76 | A |
| 19 | 7.55 | B |
| 20 | 8.71 | A |
| 21 | 9.38 | B |
| 22 | 10.21 | A |
| 23 | 8.97 | A |
| 24 | 8.38 | A |
| 25 | 8.59 | A |
| 26 | 9.39 | B |
| 27 | 10.55 | A |
| 28 | 9.33 | B |
| 29 | 9.01 | B |
| 30 | 7.27 | B |
| 31 | 8.27 | A |
| 32 | 7.98 | B |
| 33 | 7.91 | A |
| 34 | 9.12 | A |
| 35 | 10.08 | A |
| 36 | 8.41 | A |
| 37 | 8.97 | A |
| 38 | 9.21 | B |
| 39 | 10.67 | B |
| 40 | 8.67 | B |
| 41 | 8.46 | B |
| 42 | 7.64 | B |
| 43 | 7.04 | B |
| 44 | 8.75 | B |
| 45 | 7.23 | B |
| 46 | 10.02 | A |
| 47 | 9.74 | A |
| 48 | 7.84 | B |
| 49 | 8.62 | B |
| 50 | 9.22 | B |
| 51 | 8.14 | B |
| 52 | 7.49 | A |
| 53 | 8.09 | B |
| 54 | 9.17 | B |
| 55 | 7.40 | B |
| 56 | 9.80 | A |
| 57 | 7.60 | A |
| 58 | 11.25 | A |
| 59 | 9.24 | B |
| 60 | 9.74 | A |
| 61 | 9.58 | B |
| 62 | 8.47 | B |
| 63 | 7.23 | B |
| 64 | 8.84 | A |
| 65 | 8.68 | B |
| 66 | 7.62 | A |
| 67 | 9.24 | B |
| 68 | 7.54 | A |
| 69 | 9.39 | B |
| 70 | 10.66 | A |
| 71 | 10.29 | A |
| 72 | 8.92 | B |
| 73 | 9.59 | B |
| 74 | 8.34 | B |
| 75 | 9.34 | A |
| 76 | 7.95 | B |
| 77 | 8.18 | B |
| 78 | 9.32 | A |
| 79 | 8.42 | - |
| 80 | 8.58 | A |
| 81 | 9.41 | A |
| 82 | 10.61 | A |
| 83 | 9.59 | B |
| 84 | 8.38 | B |
| 85 | 9.06 | A |
| 86 | 7.34 | B |
| 87 | 9.11 | - |
| 88 | 9.00 | A |
| 89 | 8.61 | B |
| 90 | 8.98 | A |
| 91 | 9.28 | B |
| 92 | 7.69 | B |
| 93 | 8.75 | A |
| 94 | 8.11 | A |
| 95 | 8.89 | B |
| 96 | 10.62 | A |
| 97 | 7.51 | A |
| 98 | 9.00 | B |
| 99 | 9.30 | B |
| 100 | 8.81 | A |
| 101 | 7.76 | B |
| 102 | 7.98 | B |
| 103 | 8.13 | A |
| 104 | 10.58 | A |
| 105 | 7.90 | B |
| 106 | 8.82 | B |
| 107 | 7.77 | B |
| 108 | 8.85 | B |
| 109 | 7.80 | B |
| 110 | 8.45 | B |
| 111 | 7.33 | B |
| 112 | 8.84 | - |
| 113 | 9.76 | A |
| 114 | 8.20 | B |
| 115 | 9.17 | B |
| 116 | 10.47 | A |
| 117 | 8.54 | B |
| 118 | 8.63 | - |
| 119 | 10.71 | A |
| 120 | 9.91 | A |
| 121 | 8.89 | B |
| 122 | 8.74 | B |
| 123 | 8.71 | B |
| 124 | 6.58 | B |
| 125 | 9.47 | A |
| 126 | 6.73 | B |
| 127 | 10.40 | A |
| 128 | 8.07 | B |
| 129 | 9.60 | A |
| 130 | 8.35 | B |
| 131 | 8.43 | A |
| 132 | 10.37 | A |
| 133 | 10.47 | A |
| 134 | 8.31 | B |
| 135 | 8.21 | B |
| 136 | 8.45 | B |
| 137 | 8.17 | B |
| 138 | 9.03 | A |
| 139 | 7.50 | B |
| 140 | 9.26 | A |
| 141 | 6.67 | B |
| 142 | 8.59 | B |
| 143 | 10.80 | A |
| 144 | 10.76 | A |
| 145 | 7.38 | - |
| 146 | 9.19 | A |
| 147 | 8.61 | A |
| 148 | 9.02 | B |
| 149 | 7.94 | B |
| 150 | 8.84 | B |
| 151 | 9.44 | B |
| 152 | 9.18 | B |
| 153 | 9.29 | B |
| 154 | 9.45 | A |
| 155 | 10.23 | A |
| 156 | 10.71 | A |
| 157 | 8.20 | B |
| 158 | 7.28 | B |
| 159 | 9.81 | B |
| 160 | 7.63 | B |
| 161 | 9.51 | B |
| 162 | 7.86 | B |
| 163 | 7.64 | B |
| 164 | 9.52 | A |
| 165 | 8.59 | B |
| 166 | 8.71 | A |
| 167 | 9.10 | B |
| 168 | 10.54 | A |
| 169 | 9.18 | A |
| 170 | 8.23 | B |
| 171 | 10.04 | A |
| 172 | 9.10 | B |
| 173 | 8.22 | A |
| 174 | 8.82 | B |
| 175 | 7.87 | B |
| 176 | 9.15 | A |
| 177 | 9.30 | A |
| 178 | 9.52 | A |
| 179 | 9.31 | B |
| 180 | 10.57 | A |
| 181 | 9.56 | B |
| 182 | 10.50 | A |
| 183 | 8.57 | B |
| 184 | 7.28 | B |
| 185 | 9.90 | B |
| 186 | 10.67 | A |
| 187 | 7.43 | B |
| 188 | 10.32 | A |
| 189 | 8.31 | B |
| 190 | 7.43 | B |
| 191 | 7.91 | A |
| 192 | 7.35 | B |
| 193 | 7.50 | B |
| 194 | 7.47 | B |
| 195 | 10.55 | B |
| 196 | 9.45 | B |
| 197 | 8.66 | A |
| 198 | 9.03 | B |
| 199 | 8.10 | A |
| 200 | 10.41 | B |
| 201 | 8.23 | B |
| 202 | 11.30 | A |
| 203 | 8.82 | A |
| 农大3338 | 10.63 | A |
| 京冬6号 | 8.48 | B |
注：与亲本农大3338带型相同的标记为“A”；与亲本京冬6号带型相同的标记为“B”；缺失的标记表示“—”。
由表1可见，203个株系DH群体中，83个株系的基因型与亲本农大3338相同(即电泳条带的带型相同，为A)，穗长平均值为9.41cm；113份小麦材料的基因型与亲本京冬6号相同(即电泳条带的带型相同，为B)，穗长平均值为8.46cm。即83份含有该穗长主效QTL QSl-5A.1的小麦材料的穗长比113份不含有该穗长主效QTL QSl-5A.1的小麦材料平均值增加了0.95cm，在统计学上具有显著的差异(P<0.05)。具体而言，83份基因型与亲本农大3338相同的小麦材料中穗长超过该群体的平均穗长9.41cm的有41株，占49.4％，穗长超过亲本京冬6号平均穗长8.48cm的有68株，占81.9％；113份基因型与亲本京冬6号的基因型相同的小麦材料中穗长低于该群体的平均穗长8.46cm的有55株，占48.7％，穗长低于亲本农大3338平均穗长10.63cm的有112株，占99.1％。
表2 利用农大3338/京冬6号的DH群体在多环境下检测到的穗长QTL
用于扩增分子标记AL-127的引物对：
上游引物：5’-gatccatgcagaggtgatcc-3’(序列1)；
下游引物：5’-aaggagagccagaactagatgc-3’(序列2)。
用于检测SNP标记Kukri_rep_c72329_163的探针序列如下：5’-TGTTCAGTTCTATCCATCTGAGTACCGGTTGAATAATGGAAAGTATTGATRACTACACTCGGAGCAAGCCTTGTCGCGACGCTGCAAGTGTTTCCCCCCTC-3’(序列3，其中带有下划线的R即为SNP位点，可为A或G)。
实施例2、紧密连锁SSR标记AL-127在小麦穗长选择上的应用
一、实验材料
国内目前广泛推广的小麦品种中的189份小麦材料(见表3)用于紧密连锁标记在穗长选择上的应用。
二、实验方法
针对国内目前广泛推广的小麦品种中的189份小麦材料(见表3)及农大3338、京冬6号，苗期挂牌取样，提取其全基因组DNA并以其为模板，利用获得的与穗长主效QTL QSl-5A.1紧密连锁的SSR标记AL-127的扩增引物(序列1和序列2)进行PCR扩增及8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测其基因型，图3为利用AL-127对189份小麦材料中的部分小麦材料的基因型检测结果。同时，结合其穗长数据分析该连锁标记在小麦穗长选择上的应用效果。
PCR反应体系(10μl体系)如下：40ngμL-1模板DNA 1.0μL；10×PCR buffer 1.0μL；dNTPs 0.2μL；引物2.0μL(上下游引物各1.0μL)；rTaqDNA聚合酶0.1μL；ddH2O5.7μL。
PCR反应程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，36个循环；72℃10min；12℃保温。
表3 189份小麦材料、农大3338和京冬6号的穗长表型数据及基因型数据
| 编号 | 小麦品种 | 平均穗长(cm) | 基因型 |
| 1 | 碧蚂1号 | 9.90 | B |
| 2 | 凫山半截芒 | 7.85 | A |
| 3 | 济麦22 | 9.18 | A |
| 4 | 济麦23 | 8.63 | A |
| 5 | 济南6号 | 8.44 | B |
| 6 | 济南8号 | 10.20 | A |
| 7 | 济南13 | 10.49 | A |
| 8 | 济南17 | 9.33 | A |
| 9 | 济南矮6号 | 9.24 | A |
| 10 | 济宁3号 | 9.84 | B |
| 11 | 济宁13 | 10.79 | B |
| 12 | 济宁16号 | 10.60 | A |
| 13 | 良星77 | 8.82 | B |
| 14 | 临麦2号 | 9.38 | A |
| 15 | 鲁麦1号 | 9.25 | B |
| 16 | 鲁麦5号 | 9.35 | B |
| 17 | 鲁麦5号 | 8.60 | B |
| 18 | 鲁麦11 | 11.12 | B |
| 19 | 鲁麦22 | 8.56 | B |
| 20 | 鲁麦23 | 8.98 | A |
| 21 | 山农15 | 9.80 | A |
| 22 | 山农21 | 8.51 | B |
| 23 | 山农22 | 7.82 | A |
| 24 | 山农23 | 9.18 | A |
| 25 | 山农587 | 9.17 | A |
| 26 | 山农2149 | 6.94 | A |
| 27 | 山农矮2号 | 8.38 | B |
| 28 | 山农辐63 | 9.03 | A |
| 29 | 泰农153 | 9.36 | B |
| 30 | 泰农2987 | 10.08 | A |
| 31 | 泰农7018 | 7.85 | A |
| 32 | 泰山5号 | 10.27 | A |
| 33 | 泰山21 | 8.51 | A |
| 34 | 泰山4606 | 9.10 | A |
| 35 | 泰山4682 | 11.29 | A |
| 36 | 泰山6002 | 11.54 | A |
| 37 | 汶农19 | 8.12 | A |
| 38 | 跃进8号 | 9.38 | A |
| 39 | 烟农24 | 10.34 | A |
| 40 | 烟农25 | 10.17 | A |
| 41 | 早洋麦 | 8.93 | B |
| 42 | 烟09135 | 9.84 | A |
| 43 | 矮抗58 | 9.17 | B |
| 44 | 博农6号 | 8.19 | B |
| 45 | 德宏福麦7号 | 7.80 | B |
| 46 | 德宏福麦8号 | 7.62 | B |
| 47 | 富麦2008 | 9.85 | B |
| 48 | 冠麦1 | 9.15 | A |
| 49 | 邯农2312 | 9.40 | A |
| 50 | 衡10S29-2 | 7.85 | B |
| 51 | 花培1号 | 7.45 | B |
| 52 | 花培5号 | 9.00 | A |
| 53 | 冀729 | 10.44 | A |
| 54 | 金丰7183 | 7.80 | A |
| 55 | 金禾8431 | 9.40 | A |
| 56 | 浚2016 | 10.17 | A |
| 57 | 开麦18 | 8.95 | B |
| 58 | 良星99 | 9.40 | A |
| 59 | 洛麦1号 | 9.25 | B |
| 60 | 洛麦23 | 8.15 | A |
| 61 | 洛麦29 | 10.10 | B |
| 62 | 漯麦8号 | 8.75 | B |
| 63 | 平安3号 | 8.45 | B |
| 64 | 平安6号 | 8.30 | A |
| 65 | 平安8号 | 9.85 | B |
| 66 | 平安9号 | 9.15 | A |
| 67 | 泉麦890 | 10.20 | A |
| 68 | 瑞华1101 | 8.95 | B |
| 69 | 山农055843 | 9.50 | A |
| 70 | 石1109-4366 | 9.15 | A |
| 71 | 石11-5139 | 8.85 | A |
| 72 | 天民298 | 9.15 | A |
| 73 | 温9519 | 8.70 | B |
| 74 | 温9629 | 8.95 | B |
| 75 | 西农979 | 8.45 | B |
| 76 | 现麦68 | 9.40 | A |
| 77 | 新麦13 | 8.83 | B |
| 78 | 新麦208 | 10.1 | B |
| 79 | 新麦21 | 9.75 | A |
| 80 | 新麦2111 | 9.80 | A |
| 81 | 新麦31 | 8.80 | B |
| 82 | 新原9558 | 7.25 | A |
| 83 | 许科316 | 8.94 | A |
| 84 | 烟99102 | 8.06 | A |
| 85 | 偃高1号 | 9.00 | A |
| 86 | 予粮1688 | 9.00 | A |
| 87 | 育德1号 | 9.06 | A |
| 88 | 豫保1号 | 8.75 | A |
| 89 | 豫麦49-198 | 8.50 | B |
| 90 | 豫农9901 | 8.50 | B |
| 91 | 豫展4号 | 9.17 | A |
| 92 | 郑麦0856 | 8.33 | B |
| 93 | 郑麦366 | 9.81 | B |
| 94 | 郑麦583 | 9.55 | B |
| 95 | 郑麦9023 | 7.67 | B |
| 96 | 郑麦9045 | 9.46 | B |
| 97 | 郑麦9962 | 8.57 | A |
| 98 | 郑农17号 | 9.00 | A |
| 99 | 郑育麦0519 | 10.92 | B |
| 100 | 中育10号 | 9.07 | B |
| 101 | 中育12 | 9.18 | A |
| 102 | 中原之星 | 11.06 | B |
| 103 | 众麦998 | 10.15 | A |
| 104 | 周麦16 | 9.45 | A |
| 105 | 周麦17 | 9.29 | B |
| 106 | 周麦18 | 9.14 | B |
| 107 | 周麦22 | 9.46 | A |
| 108 | 周麦32 | 10.13 | B |
| 109 | 兰考926 | 10.02 | B |
| 110 | 漯PH02 | 9.92 | B |
| 111 | 豫农416 | 9.66 | B |
| 112 | 郑麦1817 | 10.59 | A |
| 113 | 洛旱13 | 8.91 | B |
| 114 | 兰考矮早8 | 9.19 | B |
| 115 | 新麦0208 | 9.81 | B |
| 116 | 长4738 | 9.62 | A |
| 117 | 临旱536(临丰3号) | 7.86 | A |
| 118 | 临抗22 | 10.54 | A |
| 119 | 太10604LP-84 | 8.29 | A |
| 120 | 太7209 | 9.03 | A |
| 121 | 运丰175LP-134 | 10.42 | A |
| 122 | 运旱20410 | 8.60 | A |
| 123 | 邯6172 | 8.35 | A |
| 124 | 邯708610P61 | 9.60 | A |
| 125 | 邯麦13 | 10.04 | A |
| 126 | 藳优2018 | 9.54 | A |
| 127 | 藳优9618 | 10.42 | B |
| 128 | 衡562 | 9.45 | A |
| 129 | 衡4332 | 7.75 | A |
| 130 | 衡5364 | 10.09 | A |
| 131 | 衡6632 | 10.85 | B |
| 132 | 衡观35 | 8.66 | B |
| 133 | 河麦58-3 | 9.88 | B |
| 134 | 河农5290 | 9.25 | A |
| 135 | 金禾9123 | 8.04 | A |
| 136 | 科农1006 | 8.85 | A |
| 137 | 石麦15 | 10.53 | A |
| 138 | 石麦18 | 11.10 | A |
| 139 | 石麦22 | 8.07 | A |
| 140 | 石新633 | 9.13 | A |
| 141 | 石新733 | 9.02 | A |
| 142 | 石家庄9号 | 9.70 | A |
| 143 | 刑531 | 8.40 | A |
| 144 | 刑麦17 | 8.50 | A |
| 145 | 新科8号 | 9.30 | B |
| 146 | 3097 | 9.95 | A |
| 147 | 矮杆早 | 9.15 | B |
| 148 | 北京8号 | 8.75 | A |
| 149 | CA0629 | 8.80 | B |
| 150 | CA9553 | 11.60 | A |
| 151 | CA9722 | 8.44 | A |
| 152 | 丰抗2号 | 9.20 | A |
| 153 | 京冬8号 | 9.30 | B |
| 154 | 京冬17 | 10.00 | A |
| 155 | 京生麦1号 | 8.83 | A |
| 156 | 轮选987 | 9.85 | A |
| 157 | 农大38 | 9.00 | A |
| 158 | 农大135(300GY) | 9.94 | B |
| 159 | 农大179 | 8.81 | B |
| 160 | 农大193 | 10.69 | B |
| 161 | 农大211 | 10.28 | A |
| 162 | 农大212 | 9.31 | A |
| 163 | 农大413 | 6.80 | B |
| 164 | 农大3492 | 13.70 | A |
| 165 | 农大3634 | 10.25 | A |
| 166 | 有芒白4号 | 9.65 | A |
| 167 | 中麦12 | 11.69 | A |
| 168 | 陇麦330 | 7.67 | B |
| 169 | 陇麦479 | 10.48 | A |
| 170 | 陇麦488 | 8.63 | A |
| 171 | 陇麦517 | 8.10 | B |
| 172 | 陇辐2号 | 9.83 | A |
| 173 | 长丰2112 | 9.41 | B |
| 174 | 航麦6号 | 9.39 | B |
| 175 | 陕02-3 | 6.80 | A |
| 176 | 陕麦139 | 10.29 | B |
| 177 | 陕麦175 | 8.19 | A |
| 178 | 陕农66 | 8.78 | A |
| 179 | 陕农70 | 8.76 | B |
| 180 | 陕农138 | 8.13 | B |
| 181 | 武农986 | 7.38 | B |
| 182 | 武农988 | 9.16 | B |
| 183 | 西农94 | 8.66 | A |
| 184 | 西农165 | 7.78 | B |
| 185 | 西农538 | 9.87 | B |
| 186 | 西农3517 | 10.70 | B |
| 187 | 西农9766 | 10.65 | A |
| 188 | 小偃166 | 11.04 | A |
| 189 | 小偃534 | 9.42 | B |
| 190 | 农大3338 | 10.63 | A |
| 191 | 京冬6号 | 8.48 | B |
注：与亲本农大3338带型相同的标记为A；与亲本京冬6号带型相同的标记为B。
根据分子标记AL-127的基因型检测结果，结合189份小麦材料的穗长表型数据(表3和表4、图3)进行分析发现，111份小麦材料的基因型与亲本农大3338相同(即电泳条带的带型相同)，穗长平均值为9.34cm；78份小麦材料的基因型与亲本京冬6号相同(即电泳条带的带型相同)，穗长平均值为9.14cm。即111份含有该穗长主效QTLQSl-5A.1的小麦材料的穗长比78份不含有该穗长主效QTL QSl-5A.1的小麦材料平均值增加了0.20cm，在统计学上具有显著的差异(P<0.05)。具体而言，111份基因型与亲本农大3338相同的小麦材料中穗长超过该群体的平均穗长9.34cm的有50株，占45.0％，穗长超过亲本京冬6号平均穗长8.48cm的有91株，占82.0％；78份基因型与亲本京冬6号的基因型相同的小麦材料中穗长低于该群体的平均穗行数(9.14cm)的有37株，占47.4％，穗长低于亲本农大3338平均穗长10.63cm的有71株，占91.0％。由此可以看出，利用新开发的SSR标记AL-127，可以在苗期有效筛选出穗长较长的小麦，节约实验成本，提高选择效率，从而快速筛选出穗长更长的株系，加速小麦高产育种的进程。
表4 189份小麦材料的穗长统计结果
综合以上结果，本发明开发了穗长主效QTL QSl-5A.1区间内的分子标记，增加了目标区间的标记丰度，构建获得目标区间的分子标记连锁图谱。继而，通过QTL的再次定位分析，获得与与目标QTL紧密连锁的SSR标记AL-127并将其应用到小麦材料的穗长选择上，有效筛选出穗部较长的小麦品种或品系，也为小麦产量QTL的相关研究提供标记基础。
Claims (10)
1.用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的引物对，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用序列表中序列1和序列2所示引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成。
3.制备权利要求1或2所述的引物对的方法，包括将权利要求1或2所述引物对中的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
4.用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的试剂盒，含有权利要求1或2所述的引物对和如下中的至少一种：dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液。
5.一种鉴定或辅助鉴定小麦杂交后代的穗长性状的方法，包括如下步骤：
(a1)分别以小麦A、小麦B以及由所述小麦A和所述小麦B杂交而来的小麦杂交后代群体中的每个个体的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对分别进行PCR扩增，得到所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物；
所述小麦A的穗长大于所述小麦B的穗长；
(a2)将所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物分别进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述小麦杂交后代的穗长性状：与所述小麦A的PCR产物的电泳条带的带型相同的所述小麦杂交后代的穗长大于或候选大于与所述小麦B的PCR产物的电泳条带的带型相同的所述小麦杂交后代。
6.一种从小麦杂交后代群体中获得穗长相对较长的个体的方法，包括如下步骤：
(b1)分别以小麦A、小麦B以及由所述小麦A和所述小麦B杂交而来的小麦杂交后代群体中的每个个体的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对分别进行PCR扩增，得到所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物；
所述小麦A的穗长大于所述小麦B的穗长；
(b2)将所述小麦A的PCR产物、所述小麦B的PCR产物以及所述小麦杂交后代群体中的每个个体的PCR产物分别进行电泳，选取所述小麦杂交后代群体中与所述小麦A的PCR产物的电泳条带的带型相同的个体，即为或候选为所述小麦杂交后代群体中所述穗长相对较长的个体。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦的基因组中是否存在小麦穗长主效QTLQSl-5A.1的方法，包括如下步骤：
(c1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(c2)将所述PCR产物进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测小麦的基因组中是否存在小麦穗长主效QTL QSl-5A.1：若所述PCR产物的电泳条带的带型与参照带型A相同，或同时含有所述参照带型A和参照带型B，则所述待测小麦的基因组中存在或候选存在所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1；若所述PCR产物的电泳条带的带型与参照带型B相同，则所述待测小麦的基因组中不存在或候选不存在所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1；
所述小麦穗长主效QTL QSl-5A.1位于小麦5A染色体上，存在于SNP标记Kukri_rep_c72329_163和SSR标记AL-127之间；所述SSR标记AL-127是以小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段；所述SNP标记Kukri_rep_c72329_163的检测探针序列为序列表中序列3；
所述参照带型A为以小麦品种农大3338的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型；
所述参照带型B为以小麦品种京冬6号的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型。
8.一种培育穗长增加的小麦品种的方法，是选取符合如下条件的小麦作为亲本进行育种：以基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳，电泳条带的带型与参照带型A相同；
所述参照带型A为以小麦品种农大3338的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增，将所得PCR产物进行电泳所得的带型。
9.与小麦穗长性状相关的分子标记，为以小麦基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。
10.权利要求1或2所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒或权利要求9所述的分子标记在如下任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状；
(2)小麦育种。
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