CN109055369B

CN109055369B - 小麦亩穗数主效qtl的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109055369B
Application number: CN201811067277.0A
Authority: CN
Inventors: 尤明山; 李景辉; 温绍哲; 樊超凤; 张明虎; 田帅; 康文静; 赵文歆
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-09-13
Also published as: CN109055369A

Abstract

本发明公开了一种小麦亩穗数主效QTL的分子标记及其应用。本发明开发了一个与亩穗数主效QTL紧密连锁的Indel标记4BIN2，可以在苗期有效筛选出不同群体亩穗数的小麦株系，节约实验成本，快速筛选出亩穗数多的小麦株系，提高选择效率，加速小麦产量育种的进程。

Description

小麦亩穗数主效QTL的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种小麦亩穗数主效QTL的分子标记及其应用。

背景技术

小麦(TriticumaestivumL.)是世界上广泛种植的作物之一，养活了世界上40％的人口，在农业生产及国民经济中发挥了重要作用。随着世界人口的增长和耕地面积的减少，全球粮食安全引起了广泛关注，因此，培育高产小麦品种成为国内外科研人员的研究热点。

小麦是具有分蘖成穗特性的禾本科植物，其单位面积产量由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重，即产量“三要素”构成。因此对单位面积穗数进行QTL分析，有助于进一步解析产量性状的遗传基础以及加深对理想株型的理解，从而为培育高产小麦提供理论依据。

20世纪70年代以后，细胞生物学与分子生物学的不断发展为小麦复杂性状的遗传研究提供了技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦亩穗数主效QTL的分子标记及其应用。

本发明首先保护特异引物对，由引物F和引物R组成；

所述引物F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物F和引物R的摩尔比为1：1。

所述特异引物对的用途为如下(b1)-(b8)中的至少一种：

(b1)预测小麦亩穗数；

(b2)比较小麦亩穗数的多少；

(b3)筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦；

(b4)筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦；

(b5)制备用于预测亩穗数的试剂盒；

(b6)制备用于比较小麦亩穗数的多少的试剂盒；

(b7)制备用于筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦的试剂盒；

(b8)制备用于筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦的试剂盒。

本发明还保护所述特异引物对的的应用，为如下(b1)-(b8)中的至少一种：

(b1)预测小麦亩穗数；

(b2)比较小麦亩穗数的多少；

(b3)筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦；

(b4)筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦；

(b5)制备用于预测亩穗数的试剂盒；

(b6)制备用于比较小麦亩穗数的多少的试剂盒；

(b7)制备用于筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦的试剂盒；

(b8)制备用于筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦的试剂盒。

本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c4)中的至少一种：

(c1)预测小麦亩穗数；

(c2)比较小麦亩穗数的多少；

(c3)筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦；

(c4)筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述特异引物对的各条引物进行独立包装的步骤。

本发明还保护预测小麦亩穗数的方法，为方法A或方法B。

所述方法A包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中具有278±2bp的DNA片段且不具有320±2bp的DNA片段、待测小麦为或候选为亩穗数多的小麦，如果PCR扩增产物中具有320±2bp的DNA片段且不具有278±2bp的DNA片段、待测小麦为或候选为亩穗数少的小麦。

所述亩穗数多具体可为PCR扩增产物中具有278±2bp的DNA片段且不具有320±2bp的DNA片段的小麦相对于PCR扩增产物中具有320±2bp的DNA片段且不具有278±2bp的DNA片段的小麦为亩穗数多。

所述亩穗数少具体可为PCR扩增产物中具有320±2bp的DNA片段且不具有278±2bp的DNA片段的小麦相对于PCR扩增产物中具有278±2bp的DNA片段且不具有320±2bp的DNA片段的小麦亩穗数少。

所述方法B包括如下步骤：检测待测小麦基因组DNA中是否含有特异DNA片段甲和特异DNA片段乙；如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段甲且不含有特异DNA片段乙、待测小麦为或候选为亩穗数多的小麦，如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段乙且不含有特异DNA片段甲、待测小麦为或候选为亩穗数少的小麦；

所述特异DNA片段甲为序列表的序列3所示的DNA分子；

所述特异DNA片段乙为序列表的序列4所示的DNA分子。

所述亩穗数多具体可为基因组DNA中含有特异DNA片段甲且不含有特异DNA片段乙的小麦相对于基因组DNA中含有特异DNA片段乙且不含有特异DNA片段甲的小麦亩穗数多。

所述亩穗数少具体可为基因组DNA中含有特异DNA片段乙且不含有特异DNA片段甲的小麦相对于基因组DNA中含有特异DNA片段甲且不含有特异DNA片段乙的小麦亩穗数少。

本发明还保护比较小麦亩穗数的多少的方法，为方法C或方法D。

所述方法C包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物中具有278±2bp的DNA片段且不具有320±2bp的DNA片段的小麦相对于PCR扩增产物中具有320±2bp的DNA片段且不具有278±2bp的DNA片段的小麦为亩穗数更多。

所述方法D包括如下步骤：检测待测小麦基因组DNA中是否含有特异DNA片段甲和特异DNA片段乙；基因组DNA中含有特异DNA片段甲且不含有特异DNA片段乙的小麦相对于基因组DNA中含有特异DNA片段乙且不含有特异DNA片段甲的小麦亩穗数更多；

所述特异DNA片段甲为序列表的序列3所示的DNA分子；

所述特异DNA片段乙为序列表的序列4所示的DNA分子。

以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：模板DNA(50ng/μL)2.0μL，2×PCRMix 10.0μL、引物F 2.0μL(4μM)，引物R 2.0μL(4μM)，ddH₂O 4.0μL。

以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃5min；94℃30s、54℃30s、72℃30s，35个循环；72℃5min。

以上任一所述278±2bp的DNA片段具体可为序列表的序列3所示的DNA分子。

以上任一所述320±2bp的DNA片段具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。

本发明还保护筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦的方法，为方法E或方法F。

所述方法E包括如下步骤：

(e1)按照方法A或方法B预测待测小麦亩穗数；

(e2)基于步骤(e1)的结果筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦。

所述方法F包括如下步骤：

(e3)按照方法C或方法D比较小麦亩穗数；

(e4)基于步骤(e3)的结果筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦。

本发明还保护筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦的方法，为方法G或方法H。

所述方法G包括如下步骤：

(f1)按照方法A或方法B预测待测小麦亩穗数；

(f2)基于步骤(f1)的结果筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦。

所述方法H包括如下步骤：

(e3)按照方法C或方法D比较小麦亩穗数；

(e4)基于步骤(e3)的结果筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦。

本发明还保护所述特异引物对，或，以上任一所述的方法在小麦育种中的应用。

本发明还保护小麦育种方法，为方法I或方法J。

所述方法I包括如下步骤：将方法E或方法F筛选得到的亩穗数多的小麦作为育种材料；

所述方法J包括如下步骤：将方法G或方法H筛选得到的亩穗数少的小麦作为育种材料。

以上任一所述小麦可为但不限于如下品种中的任一种或任几种：高5、农大5224、农大981、农大3097、高5/农大5224F_2:3家系、农大981/农大3097重组自交系以及实施例部分表1中所示的87份小麦品种。

作为我国三大粮食作物之一，小麦在农业生产上具有重要地位。本发明开发了一个与亩穗数主效QTL紧密连锁的Indel标记4BIN2，可以在苗期有效筛选出不同群体亩穗数的小麦株系，节约实验成本，快速筛选出亩穗数多的小麦株系，提高选择效率，加速小麦产量育种的进程。

附图说明

图1为实施例3中F_2:3家系构建示意图。

图2为实施例3中部分待测小麦的基因型的检测结果。

图3为实施例4中重组自交系构建示意图。

图4为实施例4中部分待测小麦的基因型的检测结果。

图5为实施例5中部分待测小麦的基因型的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

高5：公众可以从中国农业大学获得。

农大5224：公众可以从中国农业大学获得。

农大981：参考文献：孙朝霞,贺岩,王玉国,等.外源激素对小麦成熟种子体细胞胚发生的影响[J].山西农业大学学报(自然科学版),2006,26(4):325-328.；公众可以从中国农业大学获得。

农大3097：孙其信,尤明山,宋印明,等.国审高产耐热小麦新品种-农大5181[J].麦类作物学报,2016,36(5).；公众可以从中国农业大学获得。

亩穗数(万穗/亩)＝穗数(1m²)*667/10000。

实施例1、分子标记的发现

以小麦品系高5和小麦品系农大5224为亲本构建349个F_2:3家系，通过对其进行大量表型筛选、基因分型和QTL分析，获得了一个与亩穗数主效QTL紧密连锁的Indel标记4BIN2，针对4BIN2设计合成了可应用的连锁标记引物对，有引物F和引物R组成。

F(序列表的序列1)：5'-GGATTTTCCTCCTTTTCGCTAT-3'；

R(序列表的序列2)：5'-GCCTACCCGGTATACATTGAAC-3'。

实施例2、使用连锁标记引物对鉴定待测小麦基因型的方法的建立

提取待测小麦幼嫩叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物F和引物R进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增的反应体系(20μl体系)：模板DNA(50ng/μL)2.0μL，2×PCR Mix(GenStar公司产品)10.0μL、引物F 2.0μL(4μM)，引物R 2.0μL(4μM)，ddH₂O4.0μL。

PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s、54℃30s、72℃30s，35个循环；72℃5min。

如果PCR扩增产物中具有278bp的DNA片段(序列3)且不含有320bp的DNA片段(序列4)，则将待测植株定义为AA纯合型；

如果PCR扩增产物中具有320bp的DNA片段(序列4)且不具有278bp的DNA片段(序列3)，则将待测植株定义为BB纯合型；

如果PCR扩增产物中具有320bp的DNA片段(序列4)且具有278bp的DNA片段(序列3)，则将待测植株定义为AB杂合型。

采用上述方法对小麦品系高5和小麦品系农大5224进行鉴定，小麦品系高5为BB纯合型，小麦品系农大5224为AA纯合型。

采用上述方法对农大981和农大3097进行鉴定，农大981为BB纯合型，小麦品系农大3097为AA纯合型。

实施例3、利用4BIN2检测高5和5224构建的F_2:3群体的亩穗数

待测小麦：小麦品系高5和小麦品系农大5224为亲本构建215个F_2:3家系(构建示意图见图1)。具体构建方法：以小麦品系高5为母本，小麦品系农大5224为父本杂交得到F₁代植株。将F₁代植株自交得到F₂代植株。将F₂代植株自交得到215个F_2:3家系。

在苗期采用实施例2中的方法检测待测小麦的基因型，部分结果如图2所示。同时，在成株期统计215个F_2:3家系组成的群体的亩穗数。

基因型结果显示，215个F_2:3家系中，有61个家系的基因型为AA纯合型，96个家系的基因型为AB杂合型，58个家系的基因型为BB纯合型。

亩穗数统计结果显示，有91个家系的亩穗数超过该群体亩穗数的平均值(44万穗/亩)，其中包括61个基因型为AA纯合型的家系和29个基因型为AB杂合型的家系。有125个家系的亩穗数低于该群体亩穗数的平均值(44万穗/亩)，其中包括58个家系为BB纯合型的家系和67个基因型为AB杂合型的家系。

上述结果表明，AA纯合型家系的亩穗数全部超过群体平均值，BB纯合型家系的亩穗数全部低于群体平均值，AB杂合型的家系中接近70％的家系亩穗数低于群体平均值(由于高5携带控制亩穗数的等位基因是显性)。Indel标记4BIN2与亩穗数主效QTL连锁，也就是说可以根据苗期不同家系的基因型来推测其成株期的亩穗数。

实施例4、利用4BIN2检测农大981和农大3097构建RIL群体的亩穗数

待测小麦：农大981和农大3097构建的197个重组自交系(构建示意图见图3)。具体构建方法：以农大981为母本，农大3097为父本杂交得到F₁代植株。将F₁代植株连续自交至F₇代，得到197个重组自交系。

在苗期采用实施例2中的方法检测待测小麦的基因型，部分结果如图4所示。同时，统计197个重组自交组成的群体系在6个环境(15QZ、15SZ、16QZ、16SZ、16NKY和17SZ)下成株期的亩穗数。

15QZ：2015年在曲周种植；

15SZ：2015年在上庄实验站种植；

16QZ：2016年在曲周种植；

16SZ：2016年在上庄实验站种植；

16NKY：2016年中国农科院种植；

17SZ：2017年在上庄实验站种植；

基因型结果显示，197个重组自交系中，有100个重组自交系的基因型为AA纯合型，97个重组自交系的基因型为BB纯合型。

各环境下的亩穗数统计结果为：

(1)在15QZ环境下AA纯合型重组自交系中有91个亩穗数高于群体平均数(52.29±6.93万/亩)，占91％，BB纯合型重组自交系中有77个亩穗数低于群体平均数(52.29±6.93万/亩)，占79％；

(2)在15SZ环境下AA纯合型重组自交系中有92个亩穗数高于群体平均数(45.68±4.00万/亩)，占92％，BB纯合型重组自交系中有75个亩穗数低于群体平均数(45.68±4.00万/亩)，占77％；

(3)在16QZ环境下AA纯合型重组自交系中有94个亩穗数高于群体平均数(53.69±6.33万/亩)，占94％，BB纯合型重组自交系中有70个亩穗数低于群体平均数(53.69±6.33万/亩)，占B型家系比例为72％；

(4)在16SZ环境下AA纯合型重组自交系中有96个亩穗数高于群体平均数(52.02±6.67万/亩)，占96％，BB纯合型重组自交系中有71个亩穗数低于群体平均数(52.02±6.67万/亩)，占73％；

(5)在16NKY环境下AA纯合型重组自交系中有95个亩穗数高于群体平均数(62.03±8.67万/亩)，占95％，BB纯合型重组自交系中有64个亩穗数低于群体平均数(62.03±8.67万/亩)，占66％；

(6)在17SZ环境下AA纯合型重组自交系中有93个亩穗数高于群体平均数(47.02±6.00万/亩)，占93％，BB纯合型重组自交系中有67个亩穗数低于群体平均数(47.02±6.00万/亩)，占69％。

在6个环境下，亩穗数多表型与AA纯合型的符合比例平均为93.3％，亩穗数少表型与BB纯合型的符合比例平均为70.7％。

以上结果说明用标记4BIN2在农大981和农大3097构建的重组自交系(RIL)群体进行穗数性状的选择同样是有效的。

实施例5、利用4BIN2检测小麦的亩穗数

待测小麦材料：87份小麦材料，具体见表1(表1中所示的小麦材料均为常规小麦品种)。

在苗期采用实施例2中的方法检测待测小麦的基因型，部分结果如图5所示。同时，在成株期统计87个小麦品种的亩穗数。

对87份自然材料的基因型和亩穗数进行分析发现，利用开发的Indel标记4BIN2，在87个RIL群体中，AA纯合型的有35个材料，BB纯合型的有52个材料；将该群体在两个环境(18YL和18LF)下的表型数据进行分析发现：(1)在18YL环境下AA纯合型中有21个亩穗数高于群体平均数(47.24±1.03万/亩)，占60％，BB纯合型中有32个亩穗数低于群体平均数(47.24±1.03万/亩)，占61.54％；(2)在18LF环境下下AA纯合型中有21个亩穗数高于群体平均数(46.34±0.72万/亩)，占60％，BB纯合型中有31个亩穗数低于群体平均数(46.34±0.72万/亩)，占59.62％；以上结果说明用标记4BIN2在自然群体中进行穗数性状的选择是有效的，可以用于分子标记辅助选择育种。

18YL：2018年在杨陵播种；

18LF：2018年在临汾播种。

表1 87份自然材料的表型和基因型

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 小麦亩穗数主效QTL的分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggattttcct ccttttcgct at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctacccgg tatacattga ac 22

<210> 3

<211> 278

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 3

ggattttcct ccttttcgct atgttttttt tttttggaga atctatggta tgcgtaaagg 60

ctactacaac cttgggcaac caaatacaga tcgaaaggta gagattaatt tggtcaagtc 120

gaacggtatg ttttcaaaaa cgagagtgta gtacttatcc caactcagaa aggtcccgtc 180

tcccatatga cctcggtccc cagagtagct accaaatagt tctttggttc cgttgtctga 240

tccatacccc aacaacgttc aatgtatacc gggtaggc 278

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 4

ggattttcct ccttttcgct atgttttttt tttggagaat ctatggtatg cgtaaaggct 60

actacaacct tgggcaacca aatacgggtc gacctgctcg ttctggtcct agtaacttct 120

tttagccgca gatcgaaagg tagagattaa tttggtcaag tcgaacggta tgttttcaaa 180

aacgagagtg tagtacttat cccaactcag aaaggtcccg tctcccatat gacctcggtc 240

cccagagtag ctaccaaata gttctttggt tccgttgtct gatccatacc ccaacaacgt 300

tcaatgtata ccgggtaggc 320

Claims

1.预测小麦亩穗数的方法，为方法A或方法B；

所述方法A包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中具有278 bp的DNA片段且不具有320 bp的DNA片段、待测小麦为或候选为亩穗数多的小麦，如果PCR扩增产物中具有320 bp的DNA片段且不具有278 bp的DNA片段、待测小麦为或候选为亩穗数少的小麦；

所述特异引物对，由引物F和引物R组成；

所述引物F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述特异DNA片段甲为序列表的序列3所示的DNA分子；

所述特异DNA片段乙为序列表的序列4所示的DNA分子；

所述亩穗数多是指亩穗数高于该群体亩穗数的平均值；

所述亩穗数少是指亩穗数低于该群体亩穗数的平均值。

2.比较小麦亩穗数的多少的方法，为方法C或方法D；

所述方法C包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物中具有278 bp的DNA片段且不具有320 bp的DNA片段的小麦相对于PCR扩增产物中具有320 bp的DNA片段且不具有278 bp的DNA片段的小麦为亩穗数更多；

所述特异引物对，由引物F和引物R组成；

所述引物F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述特异DNA片段甲为序列表的序列3所示的DNA分子；

所述特异DNA片段乙为序列表的序列4所示的DNA分子。

3.筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦的方法，为方法E或方法F；

所述方法E包括如下步骤：

（e1）按照权利要求1所述方法预测待测小麦亩穗数；

（e2）基于步骤（e1）的结果筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦；

所述方法F包括如下步骤：

（f1）按照权利要求2所述方法比较小麦亩穗数；

（f2）基于步骤（f1）的结果筛选或辅助筛选亩穗数多的小麦；

所述亩穗数多是指亩穗数高于该群体亩穗数的平均值。

4.筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦的方法，为方法G或方法H；

所述方法G包括如下步骤：

（g1）按照权利要求1所述方法预测待测小麦亩穗数；

（g2）基于步骤（g1）的结果筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦；

所述方法H包括如下步骤：

（h1）按照权利要求2所述方法比较小麦亩穗数；

（h2）基于步骤（h1）的结果筛选或辅助筛选亩穗数少的小麦；

所述亩穗数少是指亩穗数低于该群体亩穗数的平均值。

5.小麦育种方法，为方法I或方法J；

所述方法I包括如下步骤：将权利要求3筛选得到的亩穗数多的小麦作为育种材料；所述亩穗数多是指亩穗数高于该群体亩穗数的平均值；

所述方法J包括如下步骤：将权利要求4筛选得到的亩穗数少的小麦作为育种材料；所述亩穗数少是指亩穗数低于该群体亩穗数的平均值。