CN111560461B - 与甘蓝型油菜第一分枝高度性状紧密相关的主效qtl位点及snp分子标记及应用 - Google Patents
与甘蓝型油菜第一分枝高度性状紧密相关的主效qtl位点及snp分子标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，特别涉及与甘蓝型油菜第一分枝高度性状紧密相关的主效QTL位点及SNP分子标记及应用。本发明发现了3个与甘蓝型油菜第一分枝高度性状紧密相关的分子标记，分别位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基、第7186857位碱基、第7061193位碱基、其对甘蓝型油菜第一分枝高度性状的贡献率分别为15.85%、11.6%和9.3%。本发明挖掘的分子标记对甘蓝型油菜第一分枝高度性状的贡献率高，对甘蓝型油菜第一分枝高度的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，特别涉及与甘蓝型油菜第一分枝高度性状紧密相关的主效QTL位点及SNP分子标记及应用。
背景技术
油菜(Brassica napus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，是世界上三大油料作物之一，也是我国播种面积和产油量最大的油料作物，所产菜籽油是国产食用植物油的第一大来源。因此国家把发展油菜生产作为保证食用油安全供应的重点，具有重要的现实意义。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)由于具有抗病、产量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜以实现“双低、三高、两化”(低芥酸、低硫苷，高产、高抗、高效，产业化和机械化)为首要育种目标，培育高产量和适合机械化收割的油菜品种是当务之急。油菜第一分枝高度作为油菜重要的农艺性状，直接影响能否进行有效机械收割。但是这些性状受环境的影响较大，依靠传统的育种方法和技术在现有的基础上很难有较大的突破，因此将数量遗传学和分子标记技术相结合，为油菜遗传育种的发展期供了新的机会。
基于SNP的分子标记技术被认为是继RFLP和SSR之后出现的第三代分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的缺失、突变、插入等，通过基于测序或PCR的DNA芯片技术等方法可以实现自动化批量检测，因而在基因定位的研究中有着不可比拟的优越性和潜力。
现有技术中，王嘉等(作物学报，2015)指出油菜第一分枝高度是影响分枝数的重要因素，也是决定能否高效机械收割的重要指标，但第一分枝高度作为数量性状由多基因控制，且与环境的互作效应显著，在无分子标记辅助的情况下较难实现直接选择。因此，借助分子标记和数量性状位点(QTL)定位，在分子水平对甘蓝型油菜第一分枝高度的数量性状进行研究，将有助于选育高产和易于机械收割的油菜品种，同时为揭示相关分子机理和克隆第一分枝高度基因奠定基础。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种与甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的SNP分子标记，通过检测该分子标记，可以对甘蓝型油菜第一分枝高度进行育种筛选；所述的SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基，该碱基为A或G。
本发明的另一个目的在于提供了一组与甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的SNP分子标记，所述的分子标记为A02染色体的第6195139位碱基与其他标记两两组合，或者3个组合一起，对甘蓝型油菜第一分枝高度进行育种筛选。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
与甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的SNP分子标记的获得：
(1)对324份来源世界各地的甘蓝型油菜高世代品系构成自然群体，在武汉市阳逻试验基地和扬州市农科院试验基地完成3年2点的第一分枝高度性状调查。
(2)采用直播定苗,行距33cm,株距15cm，每个小区4行，随机设计三个重复。试验材料田块四周种植保护行。
(3)第一分枝高度：从地面到第一个有效分枝的高度。
(4)用BLUP方法(http://www.extension.org/pages/61006)对多年多点表型数据进行整合，得到第一分枝高度育种值做为第一分枝高度表型。
最后全基因组关联分析，最终获得3个snp分子标记：
位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基，所述第6195139位碱基为A或G。
位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7186857位碱基，所述第7186857位碱基为A或C。
位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7061193位碱基，所述第7061193位碱基为A或G。
以上分子标记可以单独或者组合，对甘蓝型油菜第一分枝高度筛选育种。
检测上述分子标记的试剂在甘蓝型油菜第一分枝高度筛选育种的应用也属于本发明的保护范围，
以上所述的应用，优选的检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基的引物：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC。
以上所述的应用，优选的，检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基、第7186857位碱基的引物分别为：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；和F：CAGCTTCGGCGACTGTGAGT、R：TATCTTTGTGCCTTTGTGGG。
以上所述的应用，优选的，检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基、第7061193位碱基的引物分别为：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；和F：AGGCAACAAGATCATCAACA、R：CTAAGGGACCTAGCCAGAAG。
以上所述的应用，优选的，检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基、第7186857位碱基、第7061193位碱基的引物分别为：：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；F：CAGCTTCGGCGACTGTGAGT、R：TATCTTTGTGCCTTTGTGGG；和F：AGGCAACAAGATCATCAACA、R：CTAAGGGACCTAGCCAGAAG。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点，其与SNP分子标记紧密连锁，其对甘蓝型油菜第一分枝高度性状的贡献率高，对甘蓝型油菜第一分枝高度的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。
(2)本发明的甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的SNP分子标记，包括位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基的SNP分子标记、位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7186857位碱基的SNP分子标记和位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7061193位碱基的峰值SNP分子标记，其可以检测甘蓝型油菜第一分枝的高低，可以预测甘蓝型油菜第一分枝的高低，可以对甘蓝型油菜第一分枝的高低进行有效选择，还可以用于第一分枝高度甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜易机械收割株型的育种进程，适于大规模推广应用。
(3)本发明具体提供了三种甘蓝型油菜第一分枝高度性状的SNP分子标记，其中峰值SNP标记为：chrA02_7061193(A/G)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_7061193位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为43.63厘米；G时，材料的平均第一分枝高度为58.63厘米；该峰值SNP的贡献率为15.85％；
第一分枝高度性状的一个边界SNP标记为：chrA02_6195139(A/G)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_6195139位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为52.27厘米；G时,材料的平均第一分枝高度为57.72厘米；该边界SNP的贡献率为11.6％；
第一分枝高度性状的另一个边界SNP标记为：chrA02_7186857(A/C)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_7186857位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为59.47厘米；C时,材料的平均第一分枝高度为54.18厘米；该边界SNP的贡献率为9.3％。
附图说明
图1是本发明的甘蓝型油菜第一分枝高度性状的分布结果的示意图。
图2是本发明的甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点定位示意图。
图3是本发明中利用甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的峰值SNP分子标记进行等位分析的示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的获得：
1.关联群体的第一分枝高度表型的测定
(1)对324份来源世界各地的甘蓝型油菜高世代品系构成自然群体，在武汉市阳逻试验基地和扬州市农科院试验基地完成3年2点的第一分枝高度性状调查。
(2)采用直播定苗,行距33cm,株距15cm，每个小区4行，随机设计三个重复。试验材料田块四周种植保护行。
(3)第一分枝高度：从地面到第一个有效分枝的高度。
(4)用BLUP方法(http://www.extension.org/pages/61006)对多年多点表型数据进行整合，得到第一分枝高度育种值做为第一分枝高度表型。
将324份材料的所有环境的表型值平均，结果汇总如下：
表1 324份材料的所有环境的第一分枝高度表型值(厘米)
关联群体的第一分枝高度分布结果表明第一分枝高度性状表现分布呈连续性分布，呈正态分布，证明第一分枝高度性状属于数量性状且存在主效基因位点，如图1所示。
2.关联群体高质量SNP数据集的获得
采用CTAB方法提取叶片总DNA，提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，送测序公司(华大基因科技有限公司)进行7×覆盖深度的测序后返回的数据，先使用FastQC软件进行测序质量评估，然后对测序序列进行adapter和低质量reads过滤。得到每个材料的双端测序的clean data，然后使用bwa软件进行mapping以及GATK软件进行变异检测，得到关联群体总的SNP数据集后，根据最小等位基因频率≥0.05，缺失率≤0.1和杂合率≤0.1进行SNP数据集质量过滤，最终得到高质量的群体SNP数据集用于后续分析。
3.全基因组关联分析
使用plink软件对上一步产生的高质量SNP数据集的VCF文件进行格式转换，然后使用EMMAX软件将得到的第一分枝高度表型和SNP数据集进行全基因关联分析，得到第一分枝高度性状每个位点的P值，当P值小于7.2×10-7的SNP即为显著SNP，P值最小的SNP即为峰值SNP，将峰值SNP在群体中的不同等位基因类型将材料进行分组，进行方差分析，组间方差与总方差的比值的百分比，即为该峰值SNP的贡献率。
通过分析，将甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点的区间限定在甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基～第7186857位碱基之间，对应的SNP为chrA02_6195139(A/G)，chrA02_7186857
(A/C)，峰值SNP为：chrA02_7061193(A/G)，该QTL对甘蓝型油菜第一分枝高度性状的贡献率为15.85％(根据峰值SNP的不同等位基因类型将材料分组，进行单因素方差分析，组间方差除以总方差的百分比即为贡献率)。
第一分枝高度性状的峰值SNP标记为：chrA02_7061193(A/G)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_7061193位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为43.63厘米；G时，材料的平均第一分枝高度为58.63厘米；该峰值SNP的贡献率为15.85％；
第一分枝高度性状的一个边界SNP标记为：chrA02_6195139(A/G)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_6195139位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为52.27厘米；G时,材料的平均第一分枝高度为57.72厘米；该边界SNP的贡献率为11.6％；
第一分枝高度性状的另一个边界SNP标记为：chrA02_7186857(A/C)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_7186857位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为59.47厘米；C时,材料的平均第一分枝高度为54.18厘米；该边界SNP的贡献率为9.3％。
实施例2：
甘蓝型油菜第一分枝高度性状的主效QTL位点在油菜育种中的应用：
根据实施例1中得到的3个SNP分子标记，具体设计对应的引物如下：
chrA02_7061193(A/G)的检测引物为：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG和R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；
chrA02_6195139(A/G)的检测引物为：F：CAGCTTCGGCGACTGTGAGT和R：TATCTTTGTGCCTTTGTGGG；
chrA02_7186857(A/C)的检测引物为：F：AGGCAACAAGATCATCAACA和R：CTAAGGGACCTAGCCAGAAG。
利用上述三3个SNP分子标记，我们进一步对一个由16个油菜株系组成的群体进行检测,见下表2：
表1 16份材料的3个SNP分子标记检测结果及其第一分枝高度表型值(厘米)
第一分枝高度性状的峰值SNP标记为：chrA02_7061193(A/G)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_7061193位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为23.87厘米；G时，材料的平均第一分枝高度为39.07厘米；
第一分枝高度性状的一个边界SNP标记为：chrA02_6195139(A/G)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_6195139位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为27.33厘米；G时,材料的平均第一分枝高度为35.32厘米；
第一分枝高度性状的另一个边界SNP标记为：chrA02_7186857(A/C)，对应第一分枝高度表型分组为：当chrA02_7186857位置的SNP为A时，材料的平均第一分枝高度为47.78厘米；C时,材料的平均第一分枝高度为33.42厘米。
因此，可将上述SNP分子标记进行单独筛选，或者两两组合，或者3个组合一起，进行联合对第一分枝高度进行筛选育种。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 与甘蓝型油菜第一分枝高度性状紧密相关的主效QTL位点及SNP分子标记及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcttcgctca gcaataacgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggcagagg gacaaaccac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttcgctca gcaataacgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agggcagagg gacaaaccac 20
<210> 5
<211> 20
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<400> 5
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<212> DNA
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
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<400> 10
ctaagggacc tagccagaag 20
<210> 11
<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctaagggacc tagccagaag 20
Claims (4)
1.检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基的试剂在甘蓝型油菜第一分枝高度筛选育种中的应用，所述的试剂为引物：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC。
2.检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基的试剂和检测甘蓝型油菜的A02染色体的第7186857位碱基的试剂在甘蓝型油菜第一分枝高度筛选育种中的应用，所述的试剂为引物组：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；和F：CAGCTTCGGCGACTGTGAGT、R：TATCTTTGTGCCTTTGTGGG。
3.检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基的试剂和检测甘蓝型油菜的A02染色体的第7061193位碱基的试剂在甘蓝型油菜第一分枝高度筛选育种中的应用，所述的试剂为引物组：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；和F：AGGCAACAAGATCATCAACA、R：CTAAGGGACCTAGCCAGAAG。
4.检测甘蓝型油菜的A02染色体的第6195139位碱基的试剂、检测甘蓝型油菜的A02染色体的第7186857位碱基的试剂和检测甘蓝型油菜的A02染色体的第7061193位碱基的试剂在甘蓝型油菜第一分枝高度筛选育种中的应用，所述的试剂为引物组：F：GCTTCGCTCAGCAATAACGG、R：AGGGCAGAGGGACAAACCAC；F：CAGCTTCGGCGACTGTGAGT、R：TATCTTTGTGCCTTTGTGGG；和F：AGGCAACAAGATCATCAACA、R：CTAAGGGACCTAGCCAGAAG。
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| CN111118203A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-05-08 | 贵州省油菜研究所 | 甘蓝型油菜第一次有效分枝数性状的a06染色体主效qtl位点、snp分子标记及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A genome-wide association study of plant height and primary branch number in rapeseed （Brassica napus）;Feng LI等;《Plant Science》;20150523;第169-177页 * |
| Genome-Wide Association Study Reveals Candidate Genes for Control Of Plant Height,Branch Initiation Height and Branch Number in Rapeseed (Brassicanapus L.);MingZheng等;《Frontiers in Plant Science》;20170718;第8卷;摘要，第4-9页，表3-4 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111560461A (zh) | 2020-08-21 |
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