CN113881794B - 一组与甘蔗叶夹角显著相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组与甘蔗叶夹角显著相关的分子标记及其应用，属于甘蔗分子育种技术领域。本发明提供了一个与甘蔗叶夹角紧密连锁的SNP分子标记Ss6A_102766953‑G‑C及与其连锁的InDel分子标记，所述Ss6A_102766953‑G‑C位于甘蔗第6号染色体上的102766953bp处存在核苷酸单碱基突变GC；同时紧密连锁的InDel分子标记表现为存在或缺失18bp(TCCAGTTGTATTTGTACC)。本发明还提供了InDel分子标记的扩增引物。本发明还提供了一种鉴定或筛选紧凑株型甘蔗的方法，此鉴定方法简单可行、选择效率高。

Description

一组与甘蔗叶夹角显著相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于甘蔗分子育种技术领域，具体涉及一组与甘蔗叶夹角显著相关的分子标记及其应用。

背景技术

甘蔗是我国南方重要的经济作物之一，也是我国制糖、能源工业的重要原料。甘蔗单产低是甘蔗生产中存在的主要问题之一，提高种植密度是提高甘蔗单产的重要措施，而提高种植密度与培育紧凑型叶夹角小的甘蔗株型是密不可分的，紧凑型株型，叶夹角小，表现为叶片直立上挺，有利于光线透射，使光能均匀地分布在全部叶片上，光能利用率高，产量增加。平展型株型，叶夹角大，表现为叶片松散水平，中下部叶片被上部叶片所遮挡，透光率低，光能利用率低，影响产量。同时，紧凑型株型能够增加种植密度，使产量提高更为显著。紧凑型叶夹角小的甘蔗株型能最大限度的利用光能，达到最大的光能效率，增加光合产物，达到甘蔗的最高产量。因此挖掘与叶夹角相关的功能性分子标记，选育株型紧凑、密植性高的新品种已然成为甘蔗高产育种的有效途径之一，对加快甘蔗高产优良品种的选育具有重要的应用价值。

叶夹角属于典型的数量性状，基因之间、基因与环境间相互作用复杂。叶夹角的大小主要是因为叶耳处细胞的多少和叶枕处(叶鞘和叶片的连接处)主叶脉的机械支撑力的大小所决定的。传统的杂交育种方法存在许多等问题，随着分子生物学和分子标记技术的发展，出现了以分子标记遗传图谱和统计模型为基础的数量性状位点作图技术。利用QTL可检测出目标性状在染色体上的位置和效应以及与其它基因的关系。因此通过分子标记技术，研究和开发与甘蔗叶夹角相关的优异等位基因，可促进甘蔗最优株型的选育进程。

促进甘蔗的产量和经济效益的重要途径是通过远缘杂交，将甘蔗近缘属植物中的一些优异高产、抗逆性基因导入到栽培种。斑茅是甘蔗近缘属植物，具有高产、抗逆性强的优点。国内外在斑茅和甘蔗远缘杂交已经取得显著进展。但因缺乏有效的分子标记，鉴定效率低。甘蔗叶夹角是理想株型的重要形态指标，已成为品种选育中关注的重要性状，因此甘蔗叶夹角性状的遗传研究和基因发掘工作对玉米育种具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明通过构建分离群体，分析其遗传模型，明确叶夹角的遗传规律，利用全基因组关联分析进行控制甘蔗叶夹角的SNP挖掘，并进一步对目标片段进行精细定位，确定了其中一个与甘蔗叶夹角紧密连锁的SNP分子标记与InDel分子标记紧密连锁，并提供一种辅助选择株型紧凑型甘蔗的方法，为甘蔗理想株型分子育种奠定基础。

进行QTL定位工作，首先要构建合适的作图群体，优良的分离群体直接决定连锁图谱的质量，高准确性QTL定位需要满足连锁图谱上高密度的分子标记和可靠的群体表型，使用甘蔗的作图群体，能够保证连锁图谱的质量。分子生物标记是基于个体间的遗传差异，在DNA水平上响应遗传变异而产生的。分子标记具有遍布作物的整个基因组上，数量多，多态性较高，检测方便快捷，表现稳定，外界环境对其影响较小，开发成本较低，应用广泛等优点。SNP是基于高通测序的基础上，单个核苷酸发生突变而出现的不同碱基序列，是目前在基因定位与克隆和全基因组关联分析中最具代表性和权威性标记。

全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)是基于群体基因组中大量的SNP标记，挖掘性状相关候选基因的方法，以连锁不平衡(Linkagedisequilibrium，LD)为基础，鉴定出与表型变异紧密相关的分子标记位点。近年来，随着全基因组测序、高密度SNP基因分型等技术的发展，GWAS开始被应用于作物的复杂性状研究中。GWAS省略了构建群体过程，以LD为基础，对自然界中大量自然变异的种质资源为材料。对作物种质资源而言，GWAS分析具有永久固定性，能多次对表型进行调查，且针对性的对不同性状生成不同的关联图。

基于此，本发明第一个方面提供的是一组与甘蔗叶夹角显著相关的分子标记，包括SNP分子标记Ss6A_102766953-G-C及与其连锁的InDel分子标记，其中：

所述Ss6A_102766953-G-C位于甘蔗第6号染色体上的102766953bp处，存在核苷酸单碱基突变GC；

所述InDel分子标记与所述的Ss6A_102766953-G-C紧密连锁，当Ss6A_102766953-G-C处的碱基为C时，PCR产物大小为218bp；当Ss6A_102766953-G-C处的碱基为G时，PCR产物大小为200bp，缺失的18bp的核苷酸序列为：TCCAGTTGTATTTGTACC；

所述PCR是以甘蔗基因组DNA为模板，引物为：

InDel正向引物：5’-AAGCCTATGAAAATAAATCCCCTCC-3’，

InDel反向引物1：5’-GGAGTGTGGTACCATGGATTATAAAA-3’，

InDel反向引物2：5’-GGTGTGTCGTACCATGGATTATAAAA-3’。

本发明第二个方面提供的是一组引物，所述引物包括：

InDel正向引物：5’-AAGCCTATGAAAATAAATCCCCTCC-3’，

InDel反向引物1：5’-GGAGTGTGGTACCATGGATTATAAAA-3’，

InDel反向引物2：5’-GGTGTGTCGTACCATGGATTATAAAA-3’。

本发明第三个方面提供的是一种含有第二个方面所述引物的试剂盒。

本发明第四个方面提供的是第一个方面所述的分子标记或第二个方面所述的引物或第三个方面所述的试剂盒在如下任一方面中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定甘蔗叶夹角性状，或制备鉴定或辅助鉴定甘蔗叶夹角性状的产品；

(2)筛选紧凑型甘蔗单株；

(3)改良甘蔗品种或品系；

(4)选育甘蔗新品种或新品系。

本发明第五个方面提供的是一种筛选紧凑株型甘蔗的方法，包括以下步骤：

a.以待测甘蔗的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为第二个方面所述的引物，其中，InDel反向引物1和InDel反向引物2混合加入同一PCR反应中；

b.对扩增条带进行分析，所述InDel分子标记引物扩增的PCR产物大小为218bp，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较小；当扩增的PCR产物大小为200bp，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较大，可作为筛选甘蔗紧凑株型的标记；

优选地，PCR扩增体系为：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，10μM InDel正向引物、10μM InDel反向引物各1μL，模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水6μL；

优选地，PCR扩增程序如下：94℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸2min；

优选地，将扩增得到的PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后，用蒸馏水冲洗2次，之后使用硝酸银进行染色，显色后用扫描仪扫描观察。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果在于：通过本发明提供的与SNP分子标记紧密连锁的InDel分子标记进行分子标记辅助选择，只需检测SNP分子标记紧密连锁的InDel分子标记的特征扩增条带，即可预测甘蔗株型紧凑与否，此鉴定方法简单可行、选择效率高。可在甘蔗生育早期鉴定出紧凑株型的甘蔗单株，淘汰非紧凑型单株，选择目标明确，且不受环境影响，加快了甘蔗叶夹角的遗传改良进程，大大提高了甘蔗品种或品系的选择效率和质量，直接实现了SNP分子标记在甘蔗种质资源以及育种后代中的鉴定，为甘蔗育种开拓更多新的叶夹角遗传资源。

附图说明

图1为甘蔗不同生育期叶夹角分布频率。

图2为219份甘蔗LD衰退评估。

图3为甘蔗叶夹角三个时期相关位点的染色体定位。

图4为PCR产物测序与比对分析结果。

图5A和图5B为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。

实施例1 SNP分子标记及其紧密连锁的InDel分子标记的获得

1.1收集甘蔗自然群体全基因组数据

219份试验材料中80份为来自中国各个地区的种质资源、139份为国外引进的种质资源，在国内资源中，台湾地区10份、广东62份、广西26份、海南20份、云南9份、福建8份、四川8份、江西6份。在引进资源中，美国36份、澳大利亚11份、古巴9份、印度5份，其他地区种质材料9份。采用高通量测序技术对219份甘蔗品种苗期+2叶、+3叶，伸长期、成熟期+2、+3、+4叶(从根部开始往上数第二、第三和第四片叶子)的叶夹角进行全基因组测序，获得高质量的SNP标记。

1.2收集甘蔗组成关联群体的叶夹角表型数据

全部材料连续2年在湛江和翁源种植，采用完全随机区组试验设计，单行区种植，行长3m、行距0.6m。施肥、灌溉、防虫、除草同当地大田管理。于甘蔗苗期、伸长期、成熟期，每行每个重复测量5株+2、+3、+4叶的叶夹角。对8组数据进行正态分布校验及计算结果如图1所示，图A至图H对应的是甘蔗苗期+2、+3叶，伸长期+2、+3、+4叶，成熟期+2、+3、+4叶的叶夹角，由图中可以看出不同时期甘蔗叶夹角的表现型数据整体呈正态分布，植株具有一定的代表性，符合全基因组关联分析的要求。

1.3甘蔗叶夹角表型数据分析

利用EXCEL 2019对每个品种叶夹角进行初步整理，对异常值进行剔除，并获得平均值。利用SPSS 22.0统计软件对叶夹角的频率分布进行描述性统计分析。利用R语言的corrplot函数对不同生长时期的甘蔗叶夹角进行相关性分析。利用plink软件计算SNP之间的LD衰减距离，按同一染色体上两个位点之间的距离25kb的基本分类单元分类，并计算不同分类单元的平均LD。如图2所示，相关系数(r2)大于0.1，存在相关性。r2为0.40时，LD衰退率为20kb。

1.4甘蔗叶夹角全基因组关联分析

采用SPAGeDi软件，结合6142131个SNP数据对自然群体内219份甘蔗品种进行亲缘关系的评估，计算亲缘关系值矩阵(K矩阵)。亲缘关系是指两份特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相关值。GWAS分析使用混合线性模型(mixed linermoder，MLM)完成。GWAS分析结果用曼哈顿图和QQ-Plot图来表示。利用覆盖基因组的6142131个SNP标记结合219份的叶夹角表型进行全基因组关联分析。甘蔗3个生育期共8个叶夹角表型GWAS分析结果如图3所示，可以清楚的了解到SNP位点所在的染色体位置及位点数量。

以500bp窗口大小，100bp步长，用plink软件计算相邻窗口的r2值，如果r2≥0.2，则合并相邻窗口。用此方法，最后计算得到有效SNP个数为198910。关联分析显著性p-value≤1/198910，即P≤10^-6。因此，该值为甘蔗叶夹角全基因组关联分析中标记-性状显著相关的阈值。198910个有效SNP标记中，叶夹角相关位点73个，其中：苗期共挖掘12个位点，有4个位点同时存在+2叶与+3叶；伸长期共挖掘38个位点，有5个位点同时存在+2叶与+3叶，4个位点同时存在于+3叶与+4叶；成熟期共挖掘23个位点，有2个位点同时存在于+2叶与+3叶，3个位点同时存在于+3叶与+4叶。

1.5获得1个SNP位点存在与其连锁的InDel分子标记

选取上述挖掘的与甘蔗叶夹角相关的73个SNP位点中的8个，这8个SNP分子标记为与甘蔗不同时期叶夹角显著相关多的位点，分别选取这8个SNP分子标记前后各300bp共600bp的序列，根据所选序列设计引物，进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2×PrimeSTAR MaxPremix 10μL，10μM InDel正向引物、10μM InDel反向引物各1μL，模板DNA2μL，加灭菌双蒸水6μL；扩增程序如下：94℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸2min。将扩增得到的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测，在凝胶成像系统(Bio-Rad)中观察目的条带，各选取10个含有目的条带的扩增产物适量送上海生物工程有限公司测序对测序结果进行对比分析，获得了1个SNP位点存在与其连锁的InDel分子标记，获得的SNP分子标记为Ss6A_102766953-G-C，测序与比对分析结果见图4，其中1号为GWAS分析所用斑茅核苷酸序列，2-11号样品分别为甘蔗样品R570、C89-51、C323-68、CO419、C529-50、CO1001、TH10、CPF237、F134和川66-196的核苷酸序列。由图4可知，与SNP分子标记Ss6A_102766953-G-C连锁的InDel分子标记为一段18bp的核苷酸序列(TCCAGTTGTATTTGTACC)。

进一步的，所述SNP分子标记Ss6A_102766953-G-C与甘蔗苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的全基因组关联分析大于阈值的显著SNP位点，位于甘蔗第6号染色体上的102766953bp处，且存在核苷酸单碱基突变GC。若所述分子标记Ss6A_102766953-G-C处为C碱基，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较小；若所述分子标记Ss6A_102766953-G-C处为G碱基，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较大。

实施例2 SNP紧密连锁的InDel分子标记的检测和应用

使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述SNP紧密连锁的InDel分子标记的检测，本实施例对56份甘蔗样品目的片段进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2×PrimeSTARMax Premix10μL，10μM InDel正向引物、10μM InDel反向引物各1μL，模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水6μL；扩增程序如下：94℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸2min。所述引物对的具体序列如下：

InDel正向引物：5’-AAGCCTATGAAAATAAATCCCCTCC-3’，

InDel反向引物1：5’-GGAGTGTGGTACCATGGATTATAAAA-3’，

InDel反向引物2：5’-GGTGTGTCGTACCATGGATTATAAAA-3’。

上述两种反向引物混合加入同一PCR反应中，将扩增得到的PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后，用蒸馏水冲洗2次，之后使用硝酸银进行染色，显色后用EPSON PERFECTION 4990PHOTO扫描仪在48位全彩600dpi模式下扫描观察，结果见图5A和图5B，图5A中1-28号甘蔗样品分别为R570、CPF237、川66-196、C89-51、F134、内江57-416、C323-68、Q171、川86-665、CO331、BH10-12、川糖85-421、CO419、Q206、福农02-3924、C529-50、Q202、福农91-23、CO1001、川86-665、福农40、TH10、川73-219、赣81-1035、赣65-542、赣79-216、赣05-352、赣14；图5B中1-29号甘蔗样品分别为华南56-12、湛蔗40、YT07-913、YT93-159、YT94-128、1626、竹蔗、桂糖02-901、湛蔗40、梁河78-85、湛蔗34、崖城82-108、62-257、HOTH409、粤糖08-712、云蔗99-155、YT55、引3、崖城94-30、CP72-383、田野25、phi140-19、CP75-1632、选15、CP84-1198、HOCP05-902、引11、桂92-66、CP97-746。上述甘蔗品种在不同时期的甘蔗叶夹角值如表1所示：

表1所用甘蔗品种在不同时期的甘蔗叶夹角值

对结果进行分析，所述InDel分子标记引物扩增的PCR产物大小为218bp时，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较小；扩增的PCR产物大小为200bp时，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较大。

Claims (4)

1.与甘蔗叶夹角显著相关的分子标记或InDel分子标记扩增引物或含有InDel分子标记扩增引物的试剂盒在如下任一方面中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定甘蔗叶夹角性状，或制备鉴定或辅助鉴定甘蔗叶夹角性状的产品；

(2)筛选紧凑型甘蔗单株；

(3)改良甘蔗品种或品系；

(4)选育甘蔗新品种或新品系；

所述的分子标记，包括SNP分子标记Ss6A_102766953-G-C及与其连锁的InDel分子标记，其中：

所述Ss6A_102766953-G-C位于甘蔗第6号染色体上的102766953bp处，存在核苷酸单碱基突变GC；

所述InDel分子标记与所述的Ss6A_102766953-G-C紧密连锁，当Ss6A_102766953-G-C处的碱基为C时，PCR产物大小为218bp；当Ss6A_102766953-G-C处的碱基为G时，PCR产物大小为200bp，缺失的18bp的核苷酸序列为：TCCAGTTGTATTTGTACC；

所述PCR是以甘蔗基因组DNA为模板，引物为：

InDel正向引物：5’-AAGCCTATGAAAATAAATCCCCTCC-3’，

InDel反向引物1：5’-GGAGTGTGGTACCATGGATTATAAAA-3’，

InDel反向引物2：5’-GGTGTGTCGTA CCATGGATTATAAAA-3’；

所述的InDel分子标记扩增引物包括：

InDel正向引物：5’-AAGCCTATGAAAATAAATCCCCTCC-3’，

InDel反向引物1：5’-GGAGTGTGGTACCATGGATTATAAAA-3’，

InDel反向引物2：5’-GGTGTGTCGTACCATGGATTATAAAA-3’。

2.一种筛选紧凑株型甘蔗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.以待测甘蔗的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为InDel分子标记扩增引物，其中，InDel反向引物1和InDel反向引物2混合加入同一PCR反应中；

b.对扩增条带进行分析，当PCR产物大小为218bp，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较小；当PCR产物大小为200bp，则甘蔗样品苗期+2叶、伸长期+2叶和成熟期+2叶的叶夹角平均值相对较大，可作为筛选甘蔗紧凑株型的标记；

所述的InDel分子标记扩增引物包括：

InDel正向引物：5’-AAGCCTATGAAAATAAATCCCCTCC-3’，

InDel反向引物1：5’-GGAGTGTGGTACCATGGATTATAAAA-3’，

InDel反向引物2：5’-GGTGTGTCGTACCATGGATTATAAAA-3’。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR，其扩增体系为：2×PrimeSTARMax Premix 10μL，10μM InDel正向引物、10μM InDel反向引物各1μL，模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水6μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR，其扩增程序如下：94℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35循环；72℃延伸2min。

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