CN110592251B - 一个甘蓝型油菜开花期性状的主效qtl位点、snp分子标记开发及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点，位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6143445位碱基～第7287910位碱基之间。较佳地，对甘蓝型油菜开花期性状的贡献率为15.43％。与第一SNP分子标记紧密连锁，第一SNP分子标记位于第6143445位碱基，为A或C，该突变导致多态性。与第二SNP分子标记紧密连锁，第二SNP分子标记位于第7287910位碱基，为A或G，该突变导致多态性。与峰值SNP分子标记紧密连锁，峰值SNP分子标记位于第6330026位碱基，为C或G，该突变导致多态性。还提供了相关的SNP分子标记及应用。本发明的甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点对甘蓝型油菜开花期性状的贡献率高，对甘蓝型油菜开花期的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

Description

一个甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点、SNP分子标记开发及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，特别涉及甘蓝型油菜开花期性状技术领域，具体涉及甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及应用。

背景技术

油菜(Brassica napus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，napus)是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物。因此国家把发展油菜生产作为保证食用油安全供应的重点，具有重要的现实意义。我国甘蓝型油菜由于具有抗病、产量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜增产主要通过期高单位面积菜籽产量、期高菜籽含油量和扩大种植面积三种途径。油菜育种工作者现在的主要目标是努力期高含油量、产量和品质。由于油菜的含油量、产量、品质等性状为复杂的数量性状，受环境的影响较大，依靠传统的育种方法和技术在现有的基础上很难有较大的突破，因此将数量遗传学和分子标记技术相结合，为油菜遗传育种的发展期供了新的机会。

基于SNP的分子标记技术被认为是继RFLP和SSR之后出现的第三代分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的缺失、突变、插入等，通过基于测序或PCR的DNA芯片技术等方法可以实现自动化批量检测，因而在基因定位的研究中有着不可比拟的优越性和潜力。

现有技术中，俎峰等(南方农业学报，2019)指出油菜花期与生育期高度正相关，是油菜早熟性状选择的重要指标，但二者作为数量性状由多基因控制，且与环境的互作效应显著，在无分子标记辅助的情况下较难实现直接选择。也有大量研究表明，油菜花期与生育期具有较高的遗传力，适宜开展QTL定位研究。因此，借助分子标记和数量性状位点(QTL)定位，在分子水平对甘蓝型油菜花期的数量性状进行研究，将有助于选育早熟和高油的油菜品种，同时为揭示相关分子机理和克隆早花基因奠定基础。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记，所述的甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6143445位碱基～第7287910位碱基之间，对甘蓝型油菜开花期性状的贡献率高，对甘蓝型油菜开花期的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

优选地，所述的甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点与SNP分子标记紧密连锁，所述SNP分子标记为第一SNP分子标记、第二SNP分子标记和/或峰值SNP分子标记。

优选地，所述第一SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6143445位碱基，所述第6143445位碱基为A或C，该突变导致多态性。

优选地，所述第二SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7287910位碱基，所述第7287910位碱基为A或G，该突变导致多态性。

优选地，所述峰值SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6330026位碱基，所述第6330026位碱基为C或G，该突变导致多态性。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记的应用。

优选地，其用于检测甘蓝型油菜开花期的早晚，或用于预测甘蓝型油菜开花期的早晚，或用于对甘蓝型油菜开花期的早晚进行有效选择。

优选地，其用于甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，或用于加速甘蓝型油菜生育期育种的进程。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记的引物或探针。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chrA02_6143445(A/C)的前后各400bp序列(共801bp)DNA片段为模板设计的，所述DNA片段如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chrA02_7287910(A/G)的前后各400bp序列(共801bp)DNA片段为模板设计的，所述DNA片段如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chrA02_6330026(C/G)的前后各400bp序列(共801bp)DNA片段为模板设计的，所述DNA片段如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述引物或探针标记有荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记的引物或探针在检测和/或预测甘蓝型油菜开花期，或甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点，其与SNP分子标记紧密连锁，其对甘蓝型油菜开花期性状的贡献率高，对甘蓝型油菜开花期的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

(2)本发明的甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记，包括位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6143445位碱基的SNP分子标记、位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7287910位碱基的SNP分子标记和位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6330026位碱基的峰值SNP分子标记，其可以检测甘蓝型油菜开花期的早晚，可以预测甘蓝型油菜开花期的早晚，可以对甘蓝型油菜开花期的早晚进行有效选择，还可以用于开花期早的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜生育期育种的进程，适于大规模推广应用。

(3)本发明具体提供了三种甘蓝型油菜开花期性状的SNP分子标记，其中峰值SNP标记为：chrA02_6330026(C/G)，对应开花期表型分组为：当chrA02_6330026位置的SNP为C时，材料的平均开花期为159.8天；G时，材料的平均开花期为153.8天；该峰值SNP的贡献率为15.43％；

开花期性状的一个边界SNP标记为：chrA02_6143445(A/C)，对应开花期表型分组为：当chrA02_6143445位置的SNP为A时，材料的平均开花期为154.0天；C时,材料的平均开花期为159.6天；该边界SNP的贡献率为7.0％；

开花期性状的另一个边界SNP标记为：chrA02_7287910(A/G)，对应开花期表型分组为：当chrA02_7287910位置的SNP为A时，材料的平均开花期为150.7天；G时,材料的平均开花期为159.6天；该边界SNP的贡献率为13.9％。

附图说明

图1是本发明的甘蓝型油菜开花期性状的分布结果的示意图，即关联群体开花期表型频率分布图。

图2是本发明的甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点定位示意图，即关联群体开花期性状关联分析曼哈顿图。

图3是本发明中利用甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的峰值SNP分子标记进行等位分析的示意图，即主效QTL位点的峰值SNP(chr02_6330026)分子标记等位分析图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1甘蓝型油菜开花期性状的表型的测定

1.关联群体的开花期表型的测定

(1)对324份来源世界各地的甘蓝型油菜高世代品系构成自然群体，在武汉市阳逻试验基地和扬州市农科院试验基地完成3年2点的开花期性状调查。

(2)采用直播定苗,行距33cm,株距15cm，每个小区4行，随机设计三个重复。试验材料田块四周种植保护行。

(3)开花期：以全区有25％植株开始开花的日期减去种植日期得到的天数。

(4)用BLUP方法(http://www.extension.org/pages/61006)对多年多点表型数据进行整合，得到开花期育种值做为开花期表型。

将324份材料的所有环境的表型值平均，结果汇总如下：

表1 324份材料的所有环境的开花期表型值(天)

关联群体的开花期分布结果表明开花期性状表现分布呈连续性分布，呈正态分布，证明开花期性状属于数量性状且存在主效基因位点，如附图1所示。

2.关联群体高质量SNP数据集的获得

采用CTAB方法提取叶片总DNA，提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，具体方法为：

将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨至粉末状，装入2mL离心管中；加入预热DNA提取液700μL；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；加入700μL混合液(苯酚：氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀10min；室温下，10 000×g离心15min；吸取上清液至新的2mL离心管中；加入等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000×g，离心15min，用枪吸取上清液到新的离心管中；加入2倍体积无水乙醇，混匀后在–20℃静置1h，10 000×g，离心10min，弃上清液；再加入500μL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2次洗涤沉淀后，晾干；加入含有2％RNase A溶液100μL，在37℃静置1h后4℃过夜；用等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提DNA溶液，颠倒混匀，静置10min，10 000×g，离心15或20min，去除RNase A，吸取上清液(约60μL)，再次离心，1min；利用琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测DNA浓度、质量及完整性；确定所有DNA样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。然后将DNA样品干冰运输至测序公司(华大基因科技有限公司)，每个材料测序深度大约为7×。

根据上文描述获得高质量DNA后，测序公司(华大基因科技有限公司)进行7×覆盖深度的测序后返回的数据，先使用FastQC软件进行测序质量评估，然后对测序序列进行adapter和低质量reads过滤。得到每个材料的双端测序的clean data，然后使用bwa软件进行mapping以及GATK软件进行变异检测，得到关联群体总的SNP数据集后，根据最小等位基因频率≥0.05，缺失率≤0.1和杂合率≤0.1进行SNP数据集质量过滤，最终得到高质量的群体SNP数据集用于后续分析。

3.全基因组关联分析

使用plink软件对上一步产生的高质量SNP数据集的VCF文件进行格式转换，然后使用EMMAX软件将得到的开花期表型和SNP数据集进行全基因关联分析，得到开花期性状每个位点的P值，当P值小于7.2×10^-7的SNP即为显著SNP，P值最小的SNP即为峰值SNP，将峰值SNP在群体中的不同等位基因类型将材料进行分组，进行方差分析，组间方差与总方差的比值的百分比，即为该峰值SNP的贡献率。

通过分析，将甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的区间限定在甘蓝型油菜的A02染色体的第6143445位碱基～第7287910位碱基之间，对应的SNP为chrA02_6143445(A/C)，chrA02_7287910(A/G)，峰值SNP为：chrA02_6330026(C/G)，该QTL对甘蓝型油菜开花期性状的贡献率为15.43％(根据峰值SNP的不同等位基因类型将材料分组，进行单因素方差分析，组间方差除以总方差的百分比即为贡献率)。

开花期性状的峰值SNP为：chrA02_6330026(C/G)，对应开花期表型分组为：当chrA02_6330026位置的SNP为C时，材料的平均开花期为159.8天；G时，材料的平均开花期为153.8天，如附图2所示，该峰值SNP的贡献率为15.43％。

开花期性状的其中一个边界SNP为：chrA02_6143445(A/C)，对应开花期表型分组为：当chrA02_6143445位置的SNP为A时，材料的平均开花期为154.0天；C时,材料的平均开花期为159.6天；该边界SNP的贡献率为7.0％。

开花期性状的另一个边界SNP为：chrA02_7287910(A/G)，对应开花期表型分组为：当chrA02_7287910位置的SNP为A时，材料的平均开花期为150.7天；G时,材料的平均开花期为159.6天；该边界SNP的贡献率为13.9％。

甘蓝型油菜的全基因组序列已经公布，包含chrA02_6143445(A/C)的前后各400bp序列(共801bp)如SEQ ID NO:1所示，包含chrA02_7287910(A/G)的前后各400bp序列(共801bp)如SEQ ID NO:2所示，包含chrA02_6330026(C/G)的前后各400bp序列(共801bp)如SEQ ID NO:3所示。本领域技术人员可以采用常规方法根据已知序列设计检测SNP位点的特异性引物或探针，所述引物或探针还可通过本领的常规技术标记有荧光基团，如FAM、HEX、VIC、ROX等，以及淬灭基团如BHQ1或TAMRA，从而可以通过本领域的常规方法如测序或PCR等方法检测上述SNP位点的基因型，由此可以检测甘蓝型油菜开花期的早晚，预测甘蓝型油菜开花期的早晚，进而对甘蓝型油菜开花期的早晚进行有效选择，用于开花期早的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜生育期育种的进程。

因此，本发明通过开花期性状的表型分析和全基因组重测序，然后进行全基因组关联分析，在甘蓝型油菜第A02号染色体上检测到一个甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点，对甘蓝型油菜开花期的贡献率为15.43％。该甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6143445位碱基～第7287910位碱基之间，边界显著SNP为chrA02_6143445(A/C)，chrA02_7287910(A/G)，峰值SNP为chrA02_6330026(C/G)，根据该与主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，可以用于检测甘蓝型油菜开花期的早晚，可以用于预测甘蓝型油菜开花期的早晚，可以用于对甘蓝型油菜开花期的早晚进行有效选择，还可以用于开花期早的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜生育期育种的进程。

通过本发明公布的SNP分子标记进行分子标记辅助选择，鉴定方法简单，选择效率高，可预测甘蓝型油菜开花期。选择目标明确，不受环境的影响。可在甘蓝型油菜生育早期鉴定出开花期早的甘蓝型油菜单株，淘汰其它单株。综上，本发明的甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点对甘蓝型油菜开花期性状的贡献率高，对甘蓝型油菜开花期的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一个甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点、SNP分子标记开发及应用

<130>

<140> 201910521681.9

<141> 2019-07-26

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus, L.）

<221> 包含chrA02_6143445（A/C）的前后各400bp序列的基因组序列

<222> (1)..(801)

<400> 1

tccttcccaa tcaccaaatc tctgtacgaa ccattcgtcc aaacgactct ccctaaaccg 60

tccgatataa aaccaggaca cgtgtccctc tccagattca tcttcttttc ctcgtccgta 120

caccctaact cgtactcccc ctccgttacg cactctaccg ttaacaacga cgacacaacc 180

gtttccgttc tcgccgttag taatccctcc gtcagatcta aactcttctt cgccgcttga 240

taacgtccgt catctccgaa actcaaccac gaagacgccg ccgcaggcac caaaacccta 300

ggcggttcct tcctcctctc aggagtctcg ggaagaagag gcaacgtcac agtctcagat 360

ccgttcttag cctcttcgtt tctcctccgt ttactgttgc cgttactgtt aacagatccc 420

ccgctgctgc tactgttctc tttcgaatat tttctctttc ctctccgcga cttgggcgat 480

acggaatcca acggcggcga agaggatccg ccggaatctg gtctcggagc aatcggacgg 540

taccggagca taatcctatc cacctttgac atatcaccac caccaccact gcctccgtat 600

ctcgctatac aacagcctcc ccgaaaattc atttttaatt gattttttct gcgaaatttt 660

actttaaaag caaatgaaat gaagatgctg aattaacgtg aagcttgccg gtacgtttat 720

aaagagaaaa ctgttacgtc gacacgtttg gagaaacagc cacgtgcgag accacaggct 780

gaacagcgca accctgtgat t 801

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus, L.）

<221> 包含chrA02_7287910（A/G）的前后各400bp序列的基因组序列

<222> (1)..(801)

<400> 2

agagagagaa agtcgtcgat ccacctcacc ggtttgtctt cggccttcag atttgtttca 60

atctatattt catcgggttt ttctctccgg cgtcgatggc ttataaagcg tcgcatgacc 120

ggttctgttc gcatctttca tatggtggac gaccggcttc tggctctggg aaccatgcct 180

cttttacggg attggaccgc cggctcttgg cttcggggac cacactttcc tctgtggtgt 240

tggaccgccg gcttttggat ccgctttgca gcatcctttg atgtttgacg gcgaattggt 300

tacatgttgg atcagattct gtatggtctc tttttctttg tttcgttctg ttccaagcga 360

tttccggttc gattgattcg atggcgatgt tcaattggag gtcggaactc cttctgaaga 420

agagattttt tacacgtctc ggcgatggaa gctaaagcgg tgtggctgag ttttcacctc 480

caggtattga tgtcgcggtt gctttgcacg ggatcctgtt tccggtgtgg ttctagtgga 540

tctccgatta gcaggttgtc ggtgatgctc ttgccggtgt tgtgcggtgg cgattcagcc 600

ttagggcacg tgacattcga gtggcgatgt tgtgacatat gttcctcatt ggtggggctt 660

caacatgcgt cttttacggg tttcagttca atgggcttaa ggcccaagtg actcttttag 720

tttgcccttc tattttgggc tttttagttt gatctttgta atgtgttttg ggctttgtcc 780

tttgggcttt gtccctttaa t 801

<210> 3

<211> 801

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus, L.）

<221> 包含chrA02_6330026 (C/G)的前后各400bp序列的基因组序列

<222> (1)..(801)

<400> 3

aacttcaagc acccttctaa ggttgagcac tacataccga acatcttaag catctacata 60

tttcatctat atcggataaa tcaacgtacc aattcatgtt ctcagattca gcactattct 120

tcattatcca cttagatacg gtgtcacaat ctacaggacg gtgagcttct tcagcacact 180

gcggtcacat gacacgtccg aggaaattac tttctacgca aaggaaagat agagaatttt 240

acagaaagga acgacttaca ttccagcaga aactgtaaca acatcgacaa ttcacatcat 300

aattaccact cccaacaaca aagtttacag cgtagtcaca gcctggagca ggacaccact 360

tggtctgaag gataaagaac actaagatta tgcactagaa gacaactaaa catcatgaac 420

atgcctgaag aataatgaaa ctgaagattg atagtttacc tttctattgt cttcaacgta 480

cgatctaaca aaataacttg tgtacttctg cctatctttc tcaggagcta acgcattgat 540

catatcctga ccaatagcag cattgcaaga aggatccggg catcgtaaca taagacaccc 600

tggaccatca ttaatcgccg tggagatata acctaaggat gtgtgaaaag gtcagacaga 660

taaccaaaca agaatgaacc atcattatct gttacttact taaagatact attatcagga 720

caggagtaaa acaaaccttc ccagcacgaa tcgcaaaaag ggtgaccaca agcagcagcg 780

tgcaatttat cagaaaggta a 801

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> chrA02_6143445（A/C）的上游引物序列

<222> (1)..(20)

<400> 4

tctcaggagt ctcgggaaga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> chrA02_6143445（A/C）的下游引物序列

<222> (1)..(20)

<400> 5

tcgcggagag gaaagagaaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> chrA02_7287910（A/G）的上游引物序列

<222> (1)..(20)

<400> 6

tgtttgacgg cgaattggtt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> chrA02_7287910（A/G）的下游引物序列

<222> (1)..(20)

<400> 7

tttagcttcc atcgccgaga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> chrA02_6330026 (C/G)的上游引物序列

<222> (1)..(20)

<400> 8

ttacagcgta gtcacagcct 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> chrA02_6330026 (C/G)的下游引物序列

<222> (1)..(21)

<400> 9

agctcctgag aaagataggc a 21

Claims (2)

1.一种甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记的引物或探针在检测和/或预测甘蓝型油菜开花期，或甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用；

所述甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记为以下中的任意一种或两种：

第一SNP分子标记位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或C；当这个位点为A时，相较于为C时具有更短的开花期；

第二SNP分子标记位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或G；当这个位点为A时，相较于为G时具有更短的开花期。

2.一种油菜育种方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测的油菜的基因组，对甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记进行检测，筛选出早熟品种继续进行繁育；

所述甘蓝型油菜开花期性状的主效QTL位点的SNP分子标记为以下中的任意一种或两种：

第一SNP分子标记位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或C；当这个位点为A时，相较于为C时具有更短的开花期；

第二SNP分子标记位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或G；当这个位点为A时，相较于为G时具有更短的开花期。

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