CN102703586A - 梅花ssr遗传图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了梅花SSR遗传图谱的构建方法，其是基于梅花全基因组序列信息开发出SSR引物组的引物序列和扩增方法，所述引物组包含670对SSR引物，并从中筛选出144对核心引物组，用于构建梅花遗传图谱。本发明建立了梅花的SSR分子标记技术体系，获得的SSR核心引物组能够反映出其稳定性、共显性，在基因组中普遍存在，便于统计等优点。利用该套标记可以进行梅花遗传图谱的构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动梅花遗传学和基因组学的发展。

Description

梅花SSR遗传图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、遗传学和基因组学领域，具体地说，涉及梅花SSR遗传图谱的构建方法。

背景技术

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)属于蔷薇科李属，原产于我国川、滇、藏、贵等地区，已有3000多年的栽培历史，是我国重要的木本观赏花卉。但是由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究滞后于蔷薇科其他植物。

目前在木本观赏花卉的遗传学分析中，应用较多的主要是RAPD、ISSR、AFLP等分子标记，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得到，虽然具有一定的应用价值，但是随机性强、稳定性差。而简单重复序列(simplesequence repeat，SSR)标记，也称为微卫星DNA(Macrosatellite)，是一种由1-6个核苷酸为单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。由于SSR标记具有重复性好、稳定性强、多态性高、共显性遗传和在基因组中普遍存在等优点，广泛应用于植物遗传图谱的构建、品种鉴定、遗传多样性分析、DNA指纹图谱的构建和分子标记辅助育种等研究。随着测序技术的发展和成本的降低，许多的植物均已完成全基因组测序，在此基础上便于对这些植物进行全基因组SSR标记的挖掘和分析。由于将基因组的所有SSR位点对备选材料进行逐个分析，需要耗费大量的人力和物力，所以在小麦、甘蓝、棉花和玉米等作物中采用核心引物(全基因组染色体上均匀覆盖并且多态性、稳定性、重复性等综合特征好、可作为初步研究优先选用的一套引物)进行研究，有助于提高SSR技术的检测效率。因此开发基于梅花全基因组序列的SSR核心引物组，有助于高效的构建梅花的遗传图谱，开展与重要观赏性状相关的QTL定位，从而推动梅花分子标记辅助育种的进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种梅花SSR遗传图谱的构建方法。

本发明的另一目的是提供一套基于梅花全基因组序列开发的SSR引物组。

本发明的再一目的是提供一套基于梅花全基因组序列开发的SSR核心引物组。

为了实现本发明目的，本发明的一种梅花SSR遗传图谱的构建方法，包括以下步骤：1)提取待测梅花亲本与子代的基因组DNA；2)利用生物学软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记，并分别针对这些SSR标记设计SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测梅花亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建出梅花SSR遗传图谱。

前述方法中，所述待测梅花亲本是以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本。

前述方法中，步骤2)中挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记的标准为：单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp。

前述方法中，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的670对引物，优选序列表中所示的144对核心引物。

前述方法中，步骤3)中进行PCR扩增反应之前，分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对序列表中所示的144对核心引物的上游引物进行荧光标记。

前述方法中，所述步骤4)为：利用生物学软件分析PCR扩增结果，利用卡平方检验作图群体符合孟德尔期望分离比为1∶2∶1、1∶1或1∶1∶1∶1的标记，P＜0.05，过滤掉SSR标记中偏分离的标记，构建出梅花SSR遗传图谱。

具体地，本发明提供的基于梅花全基因组序列开发的SSR引物及其应用的方法，其包括如下步骤：

1、构建梅花F1代拟测交群体；

2、对父母本及其190个子代进行基因组DNA的提取；

3、利用MISA软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记；

4、从中随意挑选出670个含有SSR标记的核苷酸序列，利用Primer 3.0软件设计670对SSR引物(如序列表所示)；

5、利用上述引物在父母本及6个子代中进行核心引物组的筛选，综合考虑引物重复性、扩增条带清晰度等因素，最终确定144对引物为梅花核心引物组(如序列表中所示核心引物)，可用于构建梅花SSR遗传图谱；

6、将所获得的144对核心引物组分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对其上游引物进行荧光标记；

7、利用荧光标记的SSR引物，对父母本及其190个子代进行PCR的扩增，在ABI3730DNA自动测序仪上对扩增产物进行检测，利用GENEMAPPER 3.7进行图像的分析和数据的收集；

8、利用Joinmap4.1软件对数据的统计结果进行分析，利用卡平方检验作图群体是否符合孟德尔期望分离比为1∶2∶1、1∶1或1∶1∶1∶1的标记，P＜0.05，过滤掉SSR分子标记中偏分离的标记，利用JoinMap4.1的软件，设置LOD值≥3，构建梅花SSR遗传图谱。

利用本发明的基于梅花全基因组序列开发的670对SSR分子标记引物如序列表所示，在以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本进行杂交，构建F₁代拟测交群体中，筛选出144对SSR引物核心组，分别对其上游引物进行FAM、HEX和TEMRA三种荧光的标记，然后在ABI3730DNA自动测序仪上对扩增产物进行检测，利用GENEMAPPER 3.7进行图像的分析和数据的收集，最后利用Joinmap4.1软件对数据的统计结果进行分析，构建梅花SSR遗传图谱(图1)。

利用本发明的梅花SSR核心引物组可以进行梅花遗传图谱的构建、遗传多样性分析、品种鉴定、指纹图谱构建和分子标记辅助育种。

本发明的优点在于，提供了670对基于梅花全基因组序列开发的SSR引物组的序列，其中包括144对梅花的SSR引物核心组的序列，建立了梅花SSR分子标记的技术体系，并利用该144对核心引物组首次构建了梅花SSR遗传图谱，有助于开展梅花重要观赏性状的QTL定位，加快梅花分子标记辅助育种的进程。

附图说明

图1显示了采用本发明方法构建得到的梅花遗传图谱LG1～LG8连锁群。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1梅花遗传作图群体的构建

根据作图亲本选配原则，以结实率高，柱头发育良好的梅花品种‘粉瓣’为母本，散粉量大，花粉生活力高的梅花品种‘扣子玉蝶’为父本。

在父本初花期与盛花期时，选取无病虫害及生理缺陷的枝条上大蕾与中蕾期的花蕾，将花药剥离平铺在硫酸纸上，室温(25℃)湿度(35％以下)，自然散粉20小时，4℃保存备用。在母本初花期，选择生长健壮的中短花枝，适当修剪，用医用镊子小心地将雄蕊去除，去雄完成后，在9-17时，柱头上具有粘液时，用毛笔蘸取花粉涂于柱头，完成授粉，计数并挂牌，马上套袋隔离，共杂交2120朵花。果实发育115天时，人工采收，共采收561粒杂交种子，将收获的果实去除果肉后，将种子取出，洗净，晾干，置于4℃冷库中砂藏催芽；将露白342粒种子播种于花盆中，待其生长到20-30cm时将310棵杂种苗移栽到大田中，注意水肥养护及病虫害防护。

实施例2基于梅花全基因组序列开发的SSR核心引物组的获得

1.1基于梅花全基因组序列的670对SSR引物的开发

在利用Illiumina公司的Solexa测序技术完成梅花全基因组测序的基础上，使用MISA(MIcroSAtellites identification tool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)计算机程序，在梅花全基因组序列中搜寻1-6个核苷酸重复单元的微卫星标记，采用的标准如下：单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp，总之在梅花全基因组中共有184629微卫星标记，见表1。从梅花全基因组的184629个微卫星标记中，随机选取含有微卫星重复单元的670个核苷酸序列，利用Primer 3.0进行引物设计，见表2。

表1SSR重复单元在梅花基因组中的分布情况

表2670对SSR引物组在梅花SSR重复单元类型中的分布情况

1.2670对SSR引物的筛选

(1)在实施例1获得的F1群体中随机选取190棵用于构建SSR遗传图谱。从中随机选取6个子代与父母本，采取顶叶以下1-3片嫩叶，采用天根公司植物基因组提取试剂盒(DP305-02)提取叶片总DNA，使DNA的浓度达到50ng/μl。

(2)使用670对引物在父母本和6个子代中进行核心引物的筛选。

PCR反应体系(25μl)如下：10×缓冲液(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mM dNTP 1.6μl，Taq DNA聚合酶(Promega，Madison，WI，USA)2.5U，10μmol L^-1上、下游引物各1.8μl，50ng/μl模板DNA2μl，以水补足至总体积25μl。反应程序：95℃预变性4min；95℃30s，退火温度(见序列表中所示)30s，72℃30s，30次循环；然后72℃延伸6min，保存于4℃备用。

(3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测。

在PCR扩增产物中加入8μl上样缓冲液(Loading Buffer)，充分混匀后，95℃变性10min，立刻转移到冰中冷却待用，将凝固的聚丙烯酰胺凝胶玻璃板固定在垂直电泳仪上，上下槽分别加入1×TBE的电泳缓冲液；接通电源，参数设置为1700V，100A，100W，预电泳20min；插入64孔样品梳，上样6μl，参数设置为1700V，100A，100W，电泳90min左右；结束电泳，将带胶的玻璃板放入10％的冰醋酸固定液中，固定20min；用去离子水漂洗两次，每次3min；然后将玻璃板放入硝酸银水溶液中(AgNO₃ 2g+37％甲醛3mL+去离子水2L)，银染25min；用去离子水将银染完的玻璃板漂洗一下，不超过5s；最后把玻璃板迅速放到2L充分预冷的显影液(30g/L碳酸钠溶液+37％甲醛3mL+10mg/ml硫代硫酸钠200μL+去离子水2L)，前后左右轻轻摇动，直至条带出现；等条带清晰后，迅速将玻璃板放入固定液中，固定2min；用去离子水漂洗，最少10min；室温下风干，保存；照相并统计多态性条带。结果从670对SSR引物中筛选到144对可用于构建梅花遗传图谱的SSR核心引物组(见序列表)。

实施例3构建梅花SSR遗传作图

1.1父母本基因组DNA的提取

从实施例1获得的F1群体中随机选取190棵用于构建SSR遗传图谱。采取父母本及其子代顶叶以下1-3片嫩叶，采用天根公司植物基因组提取试剂盒(DP305-02)提取叶片总DNA，使DNA的浓度达到50ng/μl。

1.2利用144对SSR核心引物组进行PCR扩增

(1)用FAM、HEX和TEMRA三种荧光分别对已筛选的144对SSR核心引物组的上游引物进行荧光标记；

(2)利用荧光标记的SSR引物，对父母本及其随机选取用于构建遗传图谱的190个子代进行PCR的扩增；

反应体系(10μL)：10×缓冲液(含Mg²⁺)1μL，2.5mM dNTP 0.8μL，Taq DNA聚合酶(Promega，Madison，WI，USA)1U，10mmol L^-1上游荧光引物0.8μL，10mmol L-1下游引物0.8μL，50ng/μl模板DNA 1μl，以水补足至总体积10μl。

反应程序：95℃预变性5min；95℃40s，退火温度(见序列表中所示)30s，72℃40s，35次循环；72℃延伸6min，然后保存于4℃备用。

1.3数据处理

在ABI 3730DNA自动测序仪上对扩增产物进行检测，利用GENEMAPPER3.7进行图像的分析和数据的收集。

1.4利用软件进行遗传图谱的构建

应用拟测交策略进行图谱构建：选择在双亲及其6个子代中表现多态的SSR位点，且在作图群体中发生1∶1、1∶2∶1或1∶1∶1∶1分离的位点，选择P＜0.05，过滤掉SSR分子标记中偏分离的标记，进行连锁分析，最后将以上得到129个SNP标记位点输入作图软件JoinMap 4.1进行图谱的构建，设置LOD＝7，共获得了8条梅花连锁群，总图距为1014.8cM(见表3和图1)。

表3梅花SSR遗传图谱中8条连锁群的标记情况

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.梅花SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测梅花亲本与子代的基因组DNA；

2)利用生物学软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记，并分别针对这些SSR标记设计SSR引物；

3)分别利用上述SSR引物，各自以待测梅花亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；

4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建出梅花SSR遗传图谱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测梅花亲本是以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记的标准为：单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的670对引物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的144对核心引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中进行PCR扩增反应之前，分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对所述144对核心引物的上游引物进行荧光标记。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)为：利用生物学软件分析PCR扩增结果，利用卡平方检验作图群体符合孟德尔期望分离比为1∶2∶1、1∶1或1∶1∶1∶1的标记，P＜0.05，过滤掉SSR标记中偏分离的标记，构建出梅花SSR遗传图谱。

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