CN111254216B - 鉴定大豆rn型cms恢复基因的caps标记及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴定大豆RN型CMS恢复基因的CAPS标记及方法，该标记用于鉴定是否含有大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf‑rn的材料，也可应用于含Rf‑rn基因的恢复系的分子标记辅助选育。该方法包括如下步骤，提取待鉴别大豆材料基因组DNA作为扩增模板，选用二对CAPS标记的引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。扩增的PCR产物利用限制性内切酶酶切，通过1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物的特定长度和数量进行观察，从而确定大豆材料是否含有恢复基因Rf‑rn及其基因型。

Description

鉴定大豆RN型CMS恢复基因的CAPS标记及方法
技术领域
本发明提供了一种鉴定大豆RN型CMS恢复基因的CAPS标记及方法，涉及一种鉴定大豆RN型细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）恢复基因的酶切扩增多态性序列标记(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）鉴定方法，用于检测育种材料是否为含有恢复基因Rf-rn的恢复系或含Rf-rn基因的育种材料，属于农作物分子标记检测技术领域。
背景技术
大豆细胞质雄性不育“三系”由不育系、保持系和恢复系组成，雄性不育细胞质的载体是不育系，RN型雄性不育细胞质不育系是吉林省农业科学院（孙寰等， 1993）利用栽培大豆和野生大豆间杂交、回交育成的不育系材料，于1995年在世界上首先利用RN型雄性不育细胞质育成了大豆CMS“三系”，于2000年获得中国发明专利（“细胞质雄性不育大豆及生产大豆杂交种的方法”，专利号：ZL 97112173.7），采用此方法于2002年并育成并审定了世界上第一个大豆杂交种“杂交豆1号”（孙寰等， 2003）并获得了农业部植物新品种权（品种权号：CNA20090143.5），截至2019年利用RN型CMS系统已审定17个杂交大豆品种。育性的遗传信息表明，RN型雄性不育细胞质不育系统为单基因配子体不育（赵丽梅，2003），育性恢复受一对显性基因恢复基因（Rf）控制。赵丽梅等首次利用SSR 标记，将Rf基因定位16号染色体的Satt547附近（赵丽梅, 2007）。Wang等（2010）进一步将Rf基因缩小至Sctt_011 和Satt547 之间。之后，任良真（2012）、王鹏年（王鹏年, 2016）均以RN 型材料为亲本将Rf基因定位于16号染色体上，定位区间在500 kb 左右。
酶切扩增多态性序列(CAPS)标记技术是一种简单、经济、可靠和共显性的技术，是基于 SNP 的 PCR技术与 RFLP 技术结合的分子标记技术，适用于生物研究的许多方面。CAPS 标记技术在植物基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴定等发面广泛应用(欧杨虹等, 2016；潘广磊等，2020)。本发明提供了一种鉴定大豆RN型CMS恢复基因的CAPS标记及方法，涉及一种鉴定大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因的酶切扩增多态性序列标记(CAPS）鉴定方法，用于检测育种材料是否为含有恢复基因Rf-rn的恢复系或含Rf-rn基因的育种材料。
发明内容
本发明提供了一种鉴定大豆RN型CMS恢复基因的CAPS标记及方法，实现了用于辅助鉴定大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf-rn。
本发明公开了CAPS做为分子标记在大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因分子标记辅助转育中的用途。
本发明提供的一种鉴别大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf-rn的CAPS分子标记的方法，解决方案如下：
（1）提取大豆组织基因组DNA，此DNA作为PCR扩增模板；
（2）进行PCR扩增，体系为：6μL的2×Es Taq Master mix，将上述的上游引物、下游引物各加入 0.5μl，1μL大豆DNA，加入2μL的ddH2O；PCR反应程序为95℃预变性3min； 95℃变性30s，55℃退火30s，72℃30s，共35个循环；然后72℃延伸5min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；此PCR产物作为酶切模板；
（3）进行PCR产物酶切：
所述的CAPS标记Caps16-1对应的酶切体系为：加入1μL的MboⅠ；加入1μL的10倍CutSmart buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O；酶切反应程序为37℃孵育15min，然后80℃孵育20min将酶失活；
所述的CAPS标记Caps16-8对应的酶切体系为：加入1μL的BsmFⅠ；加入1μL的10倍CutSmart buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O；酶切反应程序为65℃孵育60min，然后80℃孵育20min将酶失活；
（4）利用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带数量和大小；通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆材料的准确区分。
对应的PCR扩增的产物大小、相应的限制性内切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述：
其中CAPS标记Caps16-1对应的PCR扩增的产物为233bp，PCR产物利用限制性内切酶MboⅠ酶切，含纯合显性恢复基因（Rf-rn Rf-rn）大豆基因型的酶切片段为一个，长度为233bp；含杂合恢复基因（Rf-rn rf-rn）大豆基因型的酶切片段为三个，长度分别为233bp、153bp和80bp；含纯合隐性恢复基因（rf-rn rf-rn）即不含恢复基因的大豆基因型酶切片段为两个，长度分别为153bp和80bp。
其中CAPS标记Caps16-8应的PCR扩增的产物为560bp，PCR产物利用限制性内切酶BsmFⅠ酶切，含纯合显性恢复基因（Rf-rn Rf-rn）大豆基因型的酶切片段为两个，长度分别为300bp和260bp。含杂合恢复基因（Rf-rn rf-rn）大豆基因型的酶切片段为三个，长度分别为560bp、300bp和260bp；含纯合隐性恢复基因（rf-rn rf-rn）即不含恢复基因的大豆基因型酶切片段为1个，长度为560bp。
本发明提供的CAPS分子标记，实现了含有大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf- rn大豆品种、种质资源的快速鉴定；做到了随时可以提取大豆种子或叶片DNA进行检测，避免了传统方法需要进行田间种植，在开花期与不育系测验种进行杂交，在F1代种子收获后在第二年进行种植，在F2植株开花期，利用花粉染色法检测花粉育性，判断是否为恢复系，所耗费两个生长周期的弊端；本发明还可用于导入Rf-rn基因的优异品种或种质资源后代的分子标记辅助选育，缩短含Rf-rn新恢复系的育成时间，加快大豆杂交品种的选育进度。本发明检测快速，耗时短，从提取种子DNA到酶切电泳，1个工作日可以完成；因为酶切条带区分明显，利用低浓度的琼脂糖凝胶电泳即可在紫外灯或者蓝光灯下观察鉴别，检测结果准确、可靠；检测所用的仪器和药品为常规的分子生物学实验室具备；检测过程没有复杂的技术，普通的实验技术人员即可完成，操作简单易行。
本发明中的CAPS标记稳定，PCR产物在酶切后产生的片段在含恢复基因Rf-rn和非含Rf-rn恢复基因大豆基因型中的片段长度差异在50bp以上，通过1%的低浓度琼脂糖电泳就可以明显区分。
本发明的积极效果在于：
利用CAPS标记Caps16-1、Caps16-8将为快速鉴定大豆品种或种质资源中含有Rf- rn基因的恢复系，提供了有效方法；同时还为利用含有Rf-rn基因的材料与普通材料杂交后，逐代检测含有Rf-rn基因子代，实现分子标记辅助选育含有Rf-rn基因的新恢复系，提供方便快捷的途径。开发的CAPS标记用于PCR扩增，扩增的产物片段大小通过限制性内切酶酶切，可以快速鉴定大豆材料是否含有Rf-rn基因，条带清晰，重复性好，可靠性强。
附图说明
图1、利用标记检测JLCMS9A×吉恢500的F2分离群体的部分单株DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图（a为Caps16-1的PCR产物电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为JLCMS9A，F1为杂交种，1-21为不同单株的PCR扩增产物；b为Caps16-1的PCR产物酶切电泳图，M：100bpladder，父为吉恢500，母为JLCMS9A，F1为杂交种，1-21为不同单株的PCR产物经MboⅠ酶切；c为Caps16-8的PCR产物电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为JLCMS9A，F1为杂交种，1-21为不同单株的PCR扩增产物；d为Caps16-8的PCR产物酶切电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为JLCMS9A，F1为杂交种，1-21为不同单株的PCR产物经BsmFⅠ酶切）；
图2、本发明实施例1的大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf-rn与CAPS分子标记的连锁图（Caps16-8与恢复基因Rf-rn之间的距离为0.6cM；CAPS分子标记Caps16-1与恢复基因Rf-rn之间的距离为1.3cM）；
图3、利用标记检测24份种质资源单株DNA的琼脂糖凝胶电泳图（a为Caps16-1的PCR产物电泳图，M：100bp ladder，1-24为不同资源单株的PCR扩增产物；b为Caps16-1的PCR产物酶切电泳图，M：100bp ladder，1-24为不同单株的PCR产物经MboⅠ酶切；c为Caps16-8的PCR产物电泳图，M：100bp ladder，1-24为不同单株的PCR扩增产物；d为Caps16-8的PCR产物酶切电泳图，M：100bp ladder，1-24为不同单株的PCR产物经BsmFⅠ酶切）；
图4、利用标记检测威廉姆斯82×吉恢500的F2分离群体的部分单株DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图（a和b为Caps16-1的PCR产物电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为威廉姆斯82，F1为杂交种，1-42为不同后代单株的PCR扩增产物；c和d为Caps16-1的PCR产物酶切电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为威廉姆斯82，F1为杂交种，1-42为不同后代单株的PCR产物经MboⅠ酶切；e和f为Caps16-8的PCR产物电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为威廉姆斯82，F1为杂交种，1-42为不同后代单株的PCR扩增产物；g和h为Caps16-8的PCR产物酶切电泳图，M：100bp ladder，父为吉恢500，母为威廉姆斯82，F1为杂交种，1-42为不同后代单株的PCR产物经BsmFⅠ酶切）。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
以下是一种大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf-rn的CAPS分子标记发明方法，其具体实施步骤如下：
一、试验材料
大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf-rn的F2分离群体：以不育系JLCMS9A为母本，恢复系吉恢500为父本杂交获得F1，再由F1自交种子繁殖，获得161株F2分离单株。开花期经花粉育性鉴定，在F2离群体中共有85株可育表型单株，76株杂合半育表型单株这两种表型型符合1:1的分离比（χ2=0.625，P=0.429），Rf-rn基因符合以配子体不育细胞质为背景的单基因显性遗传模式。
二、分子标记开发
（1）分子标记位置的锚定
根据F2分离群体中20个可育单株和20个半育单株的花苞混池转录组测序和差异分析结果，得到Rf-rn基因目标区段；
（2）分子标记的设计
对亲本JLCMS9A和JLR500进行重测序和序列比对分析，利用含恢复基因Rf-rn区段内的核苷酸序列差异，设计CAPS标记；
其中CAPS16-1，其中涉及到的PCR引物序列如下：
上游引物序列：5’-AGCCCACAAACAGGAAAACAAAT-3’，
下游引物序列：5’-GTCCATGCCTGGCCTTTTCT-3’；
预计PCR产物大小为233bp。酶切涉及到的内切酶为MboⅠ，酶切片段长度在含有Rf- rn的恢复系中为233bp，不含有Rf-rn的材料中为150bp和83bp；
其中CAPS16-8，其中涉及到的PCR引物序列如下：
上游引物序列：5’-ACCAATTGACCAAAACTTGCG-3’，
下游引物序列：5’-AGCAACACCAACTATCCCTC-3’；
预计PCR产物大小为560bp。酶切涉及到的内切酶为BsmFⅠ，酶切片段长度在含有Rf-rn的恢复系中为300bp和260bp，不含有Rf-rn的材料中为560bp。
三、分子标记验证
1、提取大豆样本基因组DNA
以大豆叶片或者种子为材料，利用CTAB法提取DNA，详细步骤如下：
1）取大豆组织约100 mg，放入离心管中，加入液氮充分研磨；
2）将收集粉末的离心管中，加入600 µl CTAB提取缓冲液和3 µl RNase A溶液（10mg/ml），65 ℃水浴60min，间隔摇动3-5次，充分裂解；
3）加入等体积的氯仿/异戊醇进行混匀10min；
4）12000 rpm（～13,400×g）离心10min，将上清转入一新的离心管中；
5）加入上清等体积的无水乙醇充分混匀，静置20分钟；
6）12000 rpm（～13,400×g）离心10min，弃去上清；
7） 加入70%乙醇冲洗沉淀，重复一次；
8）将DNA沉淀吹干，然后溶解于TE缓冲液中。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，于-20℃保存DNA；
2、CAPS分子标记的扩增、酶切和电泳检测
1）总体积10µl的PCR体系，其中加入6μL的2×Es Taq Master mix，上游引物、下游引物各加入 0.5μL，加入1μL大豆DNA，加入2μL的ddH2O；PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃30s，共35个循环；然后72℃延伸5min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；
2）将PCR产物进行酶切，总体积10μL酶切体系，其中加入1μL的BsmFⅠ；加入1μL的10倍NEB buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O。酶切反应程序为65℃孵育60min，然后80℃孵育20min将酶失活，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带大小；
3、结果分析
通过对JLCMS9A×吉恢500的F2分离群体的161个单株DNA进行CAPS分子标记检测分析；
其中经Caps16-1标记检测，PCR扩增产物在电泳中呈现1种带型（图1a），而PCR扩增产物进行MboⅠ酶切后电泳中呈现2种带型，即恢复系JLR500（Rf-rn Rf-rn）和杂种F1（Rf-rn rf-rn）的带型（图1b）。通过对F2分离群体的连锁分析，并用Joinmap 4.0软件作图，发现所筛选到的CAPS标记与雄性不育恢复基因紧密连锁，遗传距离为1.3cM（图2）。
其中经Caps16-8标记检测，PCR扩增产物在电泳中呈现1种带型（图1c），而PCR扩增产物进行BsmFⅠ酶切后电泳中呈现2种带型（图1d），即恢复系JLR500（Rf-rn Rf-rn）和杂种F1（Rf-rn rf-rn）的带型；在F2离群体中共检测到Rf-rn Rf-rn基因型的85株，Rf-rn rf-rn基因型的单株75株，这2种基因型符合1:1的分离比（χ2=0.625，P=0.429），恢复基因Rf-rn为单基因控制。通过对其后代的连锁分析，并用Joinmap 4.0软件作图，发现所筛选到的CAPS标记与雄性不育恢复基因紧密连锁，遗传距离仅有0.6cM（图2）。
因此，通过紧密连锁标记的CAPS标记Caps16-1、Caps16-8能准确区分恢复基因Rf- rn位点的不同基因型，达到含Rf-rn基因恢复系的CAPS分子标记快速鉴定及新导入Rf-rn基因恢复系CAPS分子标记辅助选育的目的。
实施例2
以下是利用CAPS分子标记，进行含Rf-rn基因恢复系鉴定的方法；其具体实施步骤如下：
一、引进品种和种质资源DNA提取
以24份引进品种和种质资源种子为材料（参见表1），利用CTAB法提取大豆基因组总DNA，具体提取步骤同实施例1；
表1：24份引进品种和资源情况
泳道编号 名称 泳道编号 名称 泳道编号 名称
1 合丰34 9 选3 17 合95-1009
2 绥农4 10 吉育58 18 JP-S
3 绥农8 11 黑河43 19 吉农402-5172
4 吉林47 12 九94-99 20 辽82-5243
5 珍珠塔 13 东农90581 21 公96205-6
6 合丰29 14 合95-996 22 威廉姆斯82
7 绥农14 15 农大12938 23 公96234-3
8 斯坦3260 16 合93-1003 24 绥94-335
二、CAPS分子标记的扩增、酶切和电泳
1、总体积10µl的PCR体系，其中加入6μL的2×Es Taq Master mix，上游引物、下游引物各加入 0.5μL，加入1μL大豆DNA，加入2μL的ddH2O；PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃30s，共35个循环；然后72℃延伸5min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；
2、将PCR产物进行酶切，总体积10μL酶切体系，其中加入1μL的BsmFⅠ；加入1μL的10倍NEB buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O。酶切反应程序为65℃孵育60min，然后80℃孵育20min将酶失活，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带大小；
3、含有Rf-rn基因材料的鉴定
经CAPS16-1标记扩增PCR产物大小为233bp。酶切使用的内切酶为MboⅠ，含纯合显性恢复基因（Rf-rn Rf-rn）大豆基因型的酶切片段为一个，长度为233bp；含纯合隐性恢复基因（rf-rn rf-rn）即不含恢复基因的大豆基因型酶切片段为两个，长度分别为153bp和80bp；因所选用材料为品种或稳定种质资源，不存在杂合基因型（Rf-rn rf-rn）电泳条带类型；
其中CAPS16-1，涉及到的PCR引物序列如下：
上游引物序列：5’-AGCCCACAAACAGGAAAACAAAT-3’，
下游引物序列：5’-GTCCATGCCTGGCCTTTTCT-3’；
经CAPS16-8标记扩增PCR产物大小为560bp。酶切使用的内切酶为BsmFⅠ，含纯合显性恢复基因（Rf-rn Rf-rn）大豆基因型的酶切片段为两个，长度分别为300bp和260bp；含纯合隐性恢复基因（rf-rn rf-rn）即不含恢复基因的大豆基因型酶切片段为1个，长度为560bp；因所选用材料为品种或稳定种质资源，不存在杂合基因型（Rf-rn rf-rn）电泳条带类型；
其中CAPS16-8，涉及到的PCR引物序列如下：
上游引物序列：5’-ACCAATTGACCAAAACTTGCG-3’，
下游引物序列：5’-AGCAACACCAACTATCCCTC-3’；
4、筛选含有Rf-rn基因种质材料恢复性验证
通过CAPS标记的鉴定，证实种质资源材料JP-S含有Rf-rn基因（图3）；
利用RN型细胞质雄性不育系JLCMS9A为母本，以种质资源材料JP-S为父本，温室种植，开花期进行杂交，收获F1种子，F1种子在温室种植，正常结实，成熟期可收获种子。证实JLCMS9A不育性状被JP-S恢复， JP-S为含有纯合显性恢复基因Rf-rn的恢复系，今后可用于作为父本，与RN型细胞质雄性不育系进行杂交组配，用于大豆杂交种的创制。
实施例3
以下是利用CAPS分子标记，进行含Rf-rn基因新恢复系分子标记辅助选育的方法；其具体实施步骤如下：
1、含Rf-rn恢复基因F2分离后代种子的获得
以不含恢复基因Rf-rn大豆品种威廉姆斯82为母本，以含恢复基因Rf-rn的大豆RN型细胞质雄性不育恢复系吉恢500为父本，温室种植，开花期进行杂交，收获F1种子；F1种子继续种植于温室，收获F2种子；
2、F2种子DNA提取
以F2种子为材料，种脐背面钻孔磨粉，利用CTAB法提取DNA，具体提取步骤同实施例1；
3、F2种子CAPS分子标记的扩增、酶切和电泳
1）总体积10µl的PCR体系，其中加入6μL的2×Es Taq Master mix，上游引物、下游引物各加入 0.5μL，加入1μL大豆DNA，加入2μL的ddH2O；PCR反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃30s，共35个循环；然后72℃延伸5min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；
2）将PCR产物进行酶切，总体积10μL酶切体系，其中加入1μL的BsmFⅠ；加入1μL的10倍NEB buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O；酶切反应程序为65℃孵育60min，然后80℃孵育20min将酶失活，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带大小；
4、含有Rf-rn基因F2种子的检测
其中CAPS16-1，涉及到的PCR引物序列如下：
上游引物序列：5’-AGCCCACAAACAGGAAAACAAAT-3’，
下游引物序列：5’-GTCCATGCCTGGCCTTTTCT-3’；
PCR产物大小为233bp；酶切使用的内切酶为MboⅠ，酶切片段长度在含有Rf-rn为纯合显性的F2种子中为233bp；杂合型F2种子中分别为233bp、150bp和83bp；纯合隐性即不含有Rf-rn的F2种子中为150bp和83bp。
其中CAPS16-8，涉及到的PCR引物序列如下：
上游引物序列：5’-ACCAATTGACCAAAACTTGCG-3’，
下游引物序列：5’-AGCAACACCAACTATCCCTC-3’；
PCR产物大小为560bp；酶切使用的内切酶为BsmFⅠ，酶切片段长度在含有Rf-rn的F2种子中为300bp和260bp，杂合型F2种子中分别为560bp、300bp和260bp；纯合隐性即不含有Rf-rn的F2种子中为560bp。
5、回交转育及Rf-rn基因逐代检测
以通过CAPS分子标记检测含有纯合显性Rf-rn基因的F2种子（图4）为母本，连续利用威廉姆斯82做父本进行回交，每一个回交子代F1所结种子按实施例3中（2）~（4）方法检测是否含有纯合显性Rf-rn基因，连续回交五代以上，获得威廉姆斯82为遗传背景且含有纯合显性恢复基因Rf-rn的稳定遗传材料，命名为WM82R；
（6）含有恢复基因Rf-rn的新恢复系的育成
利用RN型细胞质雄性不育系JLCMS9A为母本，以WM82R为父本，温室种植，开花期进行杂交，收获F1种子，F1种子在温室种植，正常结实，成熟期可收获种子。证实JLCMS9A不育性状被WM82R恢复，WM82R为含有纯合显性恢复基因Rf-rn的新恢复系，今后可用于作为父本，与RN型细胞质雄性不育系进行杂交组合配制，用于大豆杂交种创制。
本发明通过筛选恢复系材料及回交转育，育成一个新恢复系“吉恢500” （品种权申请号：20181608.0），其含有的恢复基因与上述已定位的恢复基因，在定位区间和恢复能力上均不相同，命名为Rf-rn。通过用RN型不育系JLCMS9A与吉恢500杂交，构建F2分离群体，进行Rf-rn基因的分子标记定位，根据父母本基因组重测序结果开发Rf-rn基因紧密连锁的CAPS分子标记，可以用来检测引进大豆品种或资源中，是否含有恢复基因Rf-rn。含有Rf-rn基因的材料可以用于作为父本的恢复系，与母本RN型不育系进行杂交，生产F1杂交种。也可用于以含有Rf-rn的恢复系为测交亲本与不含此恢复基因的优异品种或资源进行杂交，在回交转育含Rf-rn基因的新恢复系过程中，以CAPS分子标记进行快速检测含Rf-rn基因后代材料，实现CAPS分子标记辅助选育。基于以上，本发明创造了与大豆RN型雄性不育细胞质的恢复基因Rf-rn的紧密连锁的CAPS分子标记。可以用来鉴定含有恢复基因Rf-rn的恢复系或含Rf-rn基因的育种材料。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 鉴定大豆RN型CMS恢复基因的CAPS标记及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Caps16-1上游引物(大豆)
<400> 1
agcccacaaa caggaaaaca aat 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Caps16-1下游引物(大豆)
<400> 2
gtccatgcct ggccttttct 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Caps16-8上游引物(大豆)
<400> 3
accaattgac caaaacttgc g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Caps16-8下游引物(大豆)
<400> 4
agcaacacca actatccctc 20

Claims (1)

1.一种鉴别大豆RN型细胞质雄性不育恢复基因Rf-rn的CAPS分子标记的方法，其特征在于：所述的CAPS分子标记包括Caps16-1和Caps16-8：其中，
标记Caps16-1进行PCR扩增对应的引物序列如下：
上游引物序列：5’-AGCCCACAAACAGGAAAACAAAT-3’；
下游引物序列：5’-GTCCATGCCTGGCCTTTTCT-3’；
标记Caps16-8进行PCR扩增对应的引物序列如下：
上游引物序列：5’-ACCAATTGACCAAAACTTGCG-3’；
下游引物序列：5’-AGCAACACCAACTATCCCTC-3’；
具体包括以下步骤：
（1）提取大豆组织基因组DNA，此DNA作为PCR扩增模板；
（2）进行PCR扩增，体系为：6μL的2×Es Taq Master mix，将上述的上游引物、下游引物各加入 0.5μL，1μL大豆DNA，加入2μL的ddH2O；PCR反应程序为95℃预变性3min； 95℃变性30s，55℃退火30s，72℃30s，共35个循环；然后72℃延伸5min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；此PCR产物作为酶切模板；
（3）进行PCR产物酶切：
所述的CAPS标记Caps16-1对应的酶切体系为：加入1μL的MboⅠ；加入1μL的10倍CutSmart buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O；酶切反应程序为37℃孵育15min，然后80℃孵育20min将酶失活；
所述的CAPS标记Caps16-8对应的酶切体系为：加入1μL的BsmFⅠ；加入1μL的10倍CutSmart buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O；酶切反应程序为65℃孵育60min，然后80℃孵育20min将酶失活；
（4）利用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像并记录条带数量和大小；通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆材料的准确区分；
利用限制性内切酶酶切PCR产物，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据获得不同长度大小的条带，进行大豆材料是否含有恢复基因及含有恢复基因基因型的准确区分；
所述的CAPS标记Caps16-1对应的PCR扩增的产物长度为233bp，PCR产物利用限制性内切酶MboⅠ酶切，含纯合显性恢复基因Rf-rn Rf-rn大豆基因型的酶切片段为一个，长度为233bp；含杂合恢复基因Rf-rn rf-rn大豆基因型的酶切片段为三个，长度分别为233bp、153bp和80bp；含纯合隐性恢复基因rf-rn rf-rn即不含恢复基因的大豆基因型酶切片段为两个，长度分别为153bp和80bp；
所述的CAPS标记Caps16-8对应的PCR扩增的产物长度为560bp，PCR产物利用限制性内切酶BsmFⅠ酶切，含纯合显性恢复基因Rf-rn Rf-rn大豆基因型的酶切片段为两个，长度分别为300bp和260bp；含杂合恢复基因Rf-rn rf-rn大豆基因型的酶切片段为三个，长度分别为560bp、300bp和260bp；含纯合隐性恢复基因rf-rn rf-rn即不含恢复基因的大豆基因型酶切片段为1个，长度为560bp。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004853A (zh) * 2014-06-18 2014-08-27 吉林省农业科学院 叶绿体dna的snp标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
CN109593875A (zh) * 2019-01-11 2019-04-09 华中农业大学 棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用
CN111394502A (zh) * 2020-04-29 2020-07-10 吉林省农业科学院 鉴定大豆RN型CMS恢复基因的InDel标记及方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY35927A (es) * 2013-12-31 2015-07-31 Dow Agrosciences Llc ?gen restaurador rf3 de tipo s de la esterilidad masculina citoplasmática del maíz (cms), marcadores moleculares y sus usos?.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004853A (zh) * 2014-06-18 2014-08-27 吉林省农业科学院 叶绿体dna的snp标记鉴定大豆雄性不育细胞质方法
CN109593875A (zh) * 2019-01-11 2019-04-09 华中农业大学 棉花恢复系恢复基因的分子标记及其应用
CN111394502A (zh) * 2020-04-29 2020-07-10 吉林省农业科学院 鉴定大豆RN型CMS恢复基因的InDel标记及方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Application of Single Nucleotide Polymorphism Markers for;Shahina Akter;《Plant Breed. Biotech》;20161130;第4卷(第4期);第379-386页 *
RN型大豆细胞质雄性不育恢复基因的精细定位_王鹏年;王鹏年;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (农业科技辑)》;20171215;第1-50页 *
同核异质大豆叶绿体DNA 的SNP 分析*;林春晶;《吉林农业大学学报》;20170415;第39卷(第2期);第134-138页 *
基于基因重测序信息的大豆基因靶向CAPS 标记开发;束永俊;《作物学报》;20091130;第35卷(第11期);第2015-2021页 *
大豆RN 型细胞质雄性不育系及保持系cDNA-AFLP 分析;丁孝羊;《分子植物育种》;20170815;第15卷(第8期);第3160-3165页 *

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