CN114438242B - 一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物分子育种领域，尤其涉及一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用。所述SNP位点为如下任意一种或多种：i)位于水稻11号染色体第11674982bp处，多态性为A/T；ii)位于水稻11号染色体第11775428bp处，多态性为C/T；iii)位于水稻11号染色体第11856768bp处，多态性为A/G。本发明提供的SNP位点及相应的KASP引物具有操作简单、成本低廉、周期短等优点，应用于分子辅助选择中，可加快Bph43基因在抗飞虱育种中的应用，显著缩短抗褐飞虱水稻品种的选育周期，降低选育成本。

Description

一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子育种领域，尤其涉及一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用。
背景技术
水稻是目前最重要的粮食作物之一。褐飞虱是水稻单食性害虫，通过口针吸食水稻韧皮部中的汁液，对于水稻有着广泛的危害，其轻度危害导致水稻植株生长活力降低、分蘖减少、产量下降和空瘪粒增加；而重度危害可致使水稻全株死亡，甚至颗粒无收。遏制褐飞虱的发展和危害是保障现有水稻生产安全的重大需求。
传统的褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。而且化学杀虫剂的长时间施用，也会导致褐飞虱抗药性成倍增加，降低药剂的防治效果。此外，化学杀虫剂的施用也消灭了稻田中的褐飞虱天敌，极易诱发褐飞虱的“再猖獗”，给防治带来更大的困难。农药的施用也会增加生产成本，带来环境和粮食污染等生态问题。
传统的水稻抗虫育种是通过抗虫性状鉴定对植株进行表型选择。由于水稻材料抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段进行抗虫基因的转育效率低下。分子标记辅助选择是一种利用与抗性基因紧密连锁或基因内部功能标记，在后代中进行基因型分析，可快速、准确分辨出育种材料是否带有抗褐飞虱基因，大大提高抗褐飞虱育种的效率和准确性，节约了成本，缩短了育种周期。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用。
第一方面，本发明提供一种SNP标记，所述SNP标记为如下任意一种或多种：
i)位于水稻11号染色体第11674982bp处的位点，多态性为A/T(K_11674982)；
ii)位于水稻11号染色体第11775428bp处的位点，多态性为C/T(K_11775428)；
iii)位于水稻11号染色体第11856768bp处的位点，多态性为A/G(K_11856768)。
本发明将抗褐飞虱基因Bph43精细定位在水稻染色体一个特定区域基础上。通过抗褐飞虱基因Bph43亲本材料的基因组测序，将与Bph43紧密连锁或共分离的区域序列，与水稻测序公共数据库资源对比分析，筛选并验证Bph43紧密连锁区间稀有或特有的SNP标记。针对Bph43紧密连锁区间开发高效的SNP标记鉴定体系，可准确进行Bph43基因的导入和聚合，高效选育含Bph43基因的抗褐飞虱水稻品种，从而为少打农药、减少粮食损失，发展环境友好型和资源节约型农业做出重要贡献。
第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP标记的引物组合，包括如下任意一种或多种：
i)如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物和如SEQ ID NO.3所示的通用引物；
ii)如SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物和如SEQ ID NO.6所示的通用引物；
iii)如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物和如SEQ ID NO.9所示的通用引物。
进一步地，i)中如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物分别携带不同的荧光标记；和/或，ii)中如SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物分别携带不同的荧光标记；和/或，iii)中如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物分别携带不同的荧光标记。
本发明进一步提供包括所述引物组合的试剂盒。
本发明进一步提供所述SNP标记，和所述引物组合，和所述试剂盒在检测水稻抗褐飞虱基因Bph43中的应用。
本发明进一步提供所述SNP标记，和所述引物组合，和所述试剂盒在抗褐飞虱水稻材料的选育或水稻分子标记辅助育种中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测水稻抗褐飞虱基因Bph43的方法，包括：
针对待测水稻，检测其基因组中所述SNP标记的多态性，根据检测结果判断所述待测水稻是否含有水稻抗褐飞虱基因Bph43。
进一步地，当出现如下任意一种或多种情况时，判断所述待测水稻含有抗褐飞虱基因Bph43：
i)位于水稻11号染色体第11674982bp处的SNP标记多态性为T；
ii)位于水稻11号染色体第11775428bp处的SNP标记多态性为T；
iii)位于水稻11号染色体第11856768bp处的SNP标记多态性为G。
进一步地，包括：
提取所述待测水稻的基因组DNA，采用所述引物组合针对所述基因组DNA进行PCR扩增以检测所述SNP标记的多态性；根据检测结果判断所述待测水稻是否含有水稻抗褐飞虱基因Bph43。
进一步地，若K_11674982PCR产物检测到Fam荧光信号，则所述SNP标记为A碱基且待测水稻样品中不含抗褐飞虱基因Bph43；若检测到Hex荧光信号，则所述SNP标记为T碱基且待测水稻样品中含抗褐飞虱基因Bph43，若同时检测到Fam和Hex荧光，则所述SNP标记为杂合型A/T，且待测水稻样品中Bph43为杂合型。
若K_11775428PCR产物检测到Fam荧光信号，则所述SNP标记为C碱基且待测水稻样品中不含抗褐飞虱基因Bph43；若检测到Hex荧光信号，则所述SNP标记为T碱基且待测水稻样品中含抗褐飞虱基因Bph43，若同时检测到Fam和Hex荧光，则所述SNP标记为杂合型C/T，且待测水稻样品中Bph43为杂合型。
若K_11856768PCR产物检测到Fam荧光信号，则所述SNP标记为A碱基且待测水稻样品中不含抗褐飞虱基因Bph43；若检测到Hex荧光信号，则所述SNP标记为G碱基且待测水稻样品中含抗褐飞虱基因Bph43，若同时检测到Fam和Hex荧光，则所述SNP标记为杂合型A/G，且待测水稻样品中Bph43为杂合型。
进一步地，所述PCR扩增的程序为：
94℃预变性3分钟；
94℃变性20秒；65℃-57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；
94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
进一步地，所述PCR扩增的体系以总体积2μL计，包括：1μL模板DNA，100μM的两条特异性引物各0.007μL，100μM的通用引物0.015μL，余量为2×KASP Master Mix。
本发明具备如下有益效果：
1、本发明提供的SNP标记为Bph43基因紧密连锁区间特有的SNP位点，能特异性区分Bph43基因供体亲本及其他水稻品种/资源。因而可用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断待测水稻品种或品系是否具有褐飞虱抗性。
2、本发明提供的SNP标记及其检测方法可用于抗褐飞虱分子标记辅助育种，其选择目标明确。在水稻苗期即可进行基因型鉴定，进而快速筛选出杂交或者回交材料中是否含有抗褐飞虱基因Bph43。避免了传统的抗褐飞虱表型鉴定，节约了大量人力、物力成本。
3、本发明提供的检测方法准确可靠，操作简便，适用于高通量基因型检测设备，可高效运用于水稻商业化育种中抗褐飞虱品种的选育。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的利用连锁交换规律初步定位Bph43的示意图。
图2为本发明实施例3提供的65种水稻材料的K_11674982基因型鉴定结果。
图3为本发明实施例3提供的65种水稻材料的K_11775428基因型鉴定结果。
图4为本发明实施例3提供的65种水稻材料的K_11856768基因型鉴定结果。
图5为本发明实施例4提供的KASP标记K_11674982对于部分样品的基因分型结果。
图6为本发明实施例4提供的KASP标记K_11775428对于部分样品的基因分型结果。
图7为本发明实施例4提供的KASP标记K_11856768对于部分样品的基因分型结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 Bph43基因的精细定位
国际水稻研究所曾通过抗虫性筛选发现编号为IRGC8678的孟加拉国水稻品种对褐飞虱生物型3群体具有抗性。通过从国际水稻研究所引进水稻品种IRGC8678，应用Huang等介绍的苗期集团法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价(Huang et al.2001Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes inrice.Theor Appl Genet 102,929–934)，所用的褐飞虱虫源为我国褐飞虱群体。进行结果显示IRGC8678高抗我国褐飞虱群体，抗性级别为1.15级。
但到目前为止，尚不清楚IRGC8678含有抗性基因在水稻染色体上的位置信息。本发明以高感褐飞虱的籼稻品种9311(中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心)为母本及轮回亲本，抗褐飞虱品种IRGC8678为父本，配制杂种，F1代自交获得F2群体，每个F2单株通过自交收种获得相应的F2:3家系作为抗褐飞虱基因定位群体。采用CTAB法(Murray MG&Thompson，1980Rapid isolation of high-molecular-weight plantDNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325)提取亲本及F2群体各单株的基因组DNA。
为了鉴定F2定位群体中每个单株的抗褐飞虱表型，本发明采用了苗期集团法考察F2:3家系各个单株的抗性表现，以F2:3家系抗性级别代表F2单株的抗褐飞虱表型。为确保亲本和F2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)各20粒种子播种于一个长58cm、宽38cm、高9cm，且盛有7cm厚营养土的面包盒中。每盒每个材料播种3个重复，其中随机播种抗褐飞虱亲本和TN1(感性对照)各3个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到两叶一心期时，按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网。
当感虫品种TN1(台中本地1号)全部死亡时，对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别。根据抗虫鉴定结果，对含156份家系的定位群体进行了抗虫级别的划分。苗期集团法鉴定结果显示156份F2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为1.1，最大为9.0。根据对褐飞虱的抗虫级别将F2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表型，而相应的F2单株的基因型则分别记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F2群体对褐飞虱的抗感分离符合1:2:1的比例(χ2c＝1.81<χ2 0.05,2＝5.99)(表1)。
表1 9311/IRGC8678 F2分离群体156个单株对褐飞虱抗感分离比
aRR，纯合抗虫；Rr杂合抗虫；rr，纯合感虫；b1RR:2Rr:1rr适合性检测值χ2 c＝1.81，χ2 0.05，2＝5.99；c抗虫级别值：RS，Resistance Score(抗虫级别)
本发明根据F2:3家系的抗虫级别，利用BSA的方法，从F2群体中选择11个极端抗虫(纯合抗虫)的单株的DNA混合构建抗性池R，从F2群体中分别选出18个极端感虫(纯合感虫)的单株的DNA混合构建感性池S。应用水稻绿色基因芯片GSR40K分别对亲本IRGC8678、9311，以及抗性池R和感性池S进行分析。结果表明亲本IRGC8678与9311之间具多态性的SNP标记非常丰富。由11份极端抗虫单株组成的抗性池R芯片结果表明，其在绝大多数染色体区域均为来自两个亲本的杂合基因型，在第11号染色体9-18Mb区域来自抗性亲本IRGC8678的遗传背景，表明抗性亲本IRGC8678中的抗褐飞虱基因定位于该区域。由18份极端感虫单株组成的感性池S芯片结果表明，感性池S在绝大多数染色体区域均为来自两个亲本的杂合基因型。而在第11号染色体10-18Mb区域来自感性亲本9311的遗传背景，抗性池R和感性池S的芯片结果相互吻合，因此本发明将抗性亲本IRGC8678中的抗褐飞虱基因初步定位于水稻第11号染色体10-18Mb区间，将该基因命名为Bph43。
本发明进一步分别将亲本IRGC8678及9311进行30X二代基因组测序，将测序结果进行对比，筛选出Bph43定位区间在两个亲本间有多态性的InDel标记78-10、78-11、78-12、78-13、78-14、78-15、78-16、78-17和78-18。应用这些InDel标记分析F2群体的156份单株，获得基因型数据。根据156份单株的基因型资料和相应的褐飞虱抗性表型数据，利用连锁交换规律将Bph43初步定位在InDel标记78-16和78-17间(图1中的A)。应用InDel标记78-16和78-17筛选600份BC1F2单株，得到21个在标记78-16和78-17间发生重组的单株。利用78-16和78-17区间新开发的InDel标记16-12、16-18、16-22、16-26和16-30对21个重组单株进行基因型分析，结合重组单株的抗褐飞虱表型，将Bph43精细定位在紧密连锁InDel标记16-22和16-30区间，与标记16-26紧密连锁(表2、图1中的B)，物理位置对应日本晴参考基因组(版本号IRGSP1.0)11号染色体16642878bp至16918771bp区间。
表2 分子标记筛选的BC2F2部分重组单株的基因型及表现型
单株编号 78-16 16-12 16-18 16-22 16-26b 16-30 78-17 表型 抗虫级别
9311a B B B B B B B B 9
21 A B B B B B B B 8.9
185 B B H H H H H H 4.3
43 H H H H B B B B 9
52 B B B B B H H B 9
97 A A A A A A B A 2.1
62 H H H H H H B H 4.5
5 B B B B B B H B 9
IRGC8678 A A A A A A A A 1.2
a9311和IRGC8678是两个亲本材料，其余为部分代表性重组单株；b从表中，可以看到分子标记InD14与抗虫表型是共分离的。A代表抗性亲本IRGC8678的基因型及表型，B代表感虫亲本9311的基因型及表型，H代表杂合基因型及表型。
实施例2 Bph43基因SNP标记位点筛选及KASP引物开发
将亲本IRGC8678二代基因组测序结果，与对应日本晴参考基因组(版本号IRGSP1.0)11号染色体16642878bp至16918771bp区间序列进行对比，获取Bph43紧密连锁区间内SNP变异位点。进一步利用3000份水稻测序公共数据库资源分析SNP位点的分布频率，筛选Bph43基因紧密连锁区间特有的SNP位点。以获得的SNP位点为靶点分别获取其在日本晴参考基因组上下游各200bp的序列进行KASP引物设计，对设计的KASP引物进行PCR扩增测试引物的分型效果，最终将位于参考基因组(IRGSP1.0)日本晴第11号染色体11674982bp处、11775428bp处、11856768bp处的SNP位点为靶点，设计相应的KASP标记K_11674982(Bph43抗褐飞虱基因在该SNP位点为T等位，其余水稻资源在该位点为A等位)、K_11775428(Bph43抗褐飞虱基因在该SNP位点为T等位，其余水稻资源在该位点为C等位)和K_11856768(Bph43抗褐飞虱基因在该SNP位点为G等位，其余水稻资源在该位点为A等位)。
引物K_11674982序列如下(SEQ ID NO:1-3)：
K_11674982_FAM：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACGCTCGACTCAAGAAGGA-3’；
K_11674982_HEX：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACGCTCGACTCAAGAAGGT-3’；
K_11674982_COM：5’-AGCTGTGGTCGACTTCCTTG-3’。
若K_11674982PCR产物检测到Fam荧光信号，则所述SNP标记为A碱基且待测水稻样品中不含抗褐飞虱基因Bph43；若检测到Hex荧光信号，则所述SNP标记为T碱基且待测水稻样品中含抗褐飞虱基因Bph43，若同时检测到Fam和Hex荧光，则所述SNP标记为杂合型A/T，且待测水稻样品中Bph43为杂合型。
引物K_11775428序列如下(SEQ ID NO:4-6)：
K_11775428_FAM：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGGACATGGTGGTGAGTTC-3’；
K_11775428_HEX：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACATGGTGGTGAGTTT-3’；
K_11775428_COM：5’-ATACAGGCTCAGAGAAGCGC-3’。
若K_11775428PCR产物检测到Fam荧光信号，则所述SNP标记为C碱基且待测水稻样品中不含抗褐飞虱基因Bph43；若检测到Hex荧光信号，则所述SNP标记为T碱基且待测水稻样品中含抗褐飞虱基因Bph43，若同时检测到Fam和Hex荧光，则所述SNP标记为杂合型C/T，且待测水稻样品中Bph43为杂合型。
引物K_11856768序列如下(SEQ ID NO:7-9)：
K_11856768_FAM：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAAAATCAATTCGAGAATTTTCAGAAA-3’；
K_11856768_HEX：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAAAATCAATTCGAGAATTTTCAGAAG-3’；
K_11856768_COM：5’-GCTAATGTGCCTCGGTCAGA-3’。
若K_11856768PCR产物检测到Fam荧光信号，则所述SNP标记为A碱基且待测水稻样品中不含抗褐飞虱基因Bph43；若检测到Hex荧光信号，则所述SNP标记为G碱基且待测水稻样品中含抗褐飞虱基因Bph43，若同时检测到Fam和Hex荧光，则所述SNP标记为杂合型A/G，且待测水稻样品中Bph43为杂合型。
实施例3 Bph43基因SNP标记在水稻自然群体基因型鉴定中的应用
1、生物材料
本实施例中使用的水稻样品包括Bph43基因供体亲本IRGC8678(此供体材料由国际水稻研究所提供)以及其它64份不含Bph43的水稻品种，包括D297B、蓉18B、禾丰B、川引B、荣丰B、资100B、宜香B、协B、43B、岳4B、恒丰B、川29B、博IIb、羊源B、万37B、II32b、7003B、全丰B、福伊B、天丰B、华37B、乐恢188、珞扬9号、R299、巴引5015、XK01、华航36号、禾香占、沪恢602、成恢727、鹰香丝苗、空香131、成恢178、R302、IRAT129、湘晚粒13号、楚粳29、鄂丰丝苗、赣923、莉晶、RH、75-1-127-PI9、印度香稻、IR52025B、奥标1号、特3矮、粤优丝苗、华航33号、广源占12号、CB131、粤综占、籼莉占、恢402、五山丰占、桂育黑糯、广源占14号、P248-EF3、成恢177、扬辐糯4号、台农新占、R608、6723-13195、6370-142和3207-997。
2、基因型检测
提取待测水稻基因组DNA作为模板，利用本发明的KASP标记K_11674982(SEQ IDNO:1-3)、K_11775428(SEQ ID NO:4-6)和K_11856768(SEQ ID NO:7-9)进行KASP反应检测。
PCR扩增反应体系以2μL计为：1μL模板DNA，100μM的Fam和Hex引物各0.007μL，100μM的Com引物0.015μL，以2×KASP Master Mix补足至总体积2μL。
PCR扩增反应条件为：反应在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为94℃预变性15分钟；
第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；
第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
反应完成后利用LGC IntelliQube基因分型平台对PCR反应产物进行荧光扫描并进行基因分型。
3、结果分析
K_11674982基因型鉴定结果如图2所示，IRGC8678样品检测到Hex荧光信号，基因型为T型，含有抗褐飞虱基因Bph43，其余64份水稻样品均检测到Fam荧光信号，基因型为A型，不含抗褐飞虱基因Bph43。
K_11775428基因型鉴定结果如图3所示，IRGC8678样品检测到Hex荧光信号，基因型为T型，含有抗褐飞虱基因Bph43，其余64份水稻样品均检测到Fam荧光信号，基因型为C型，不含抗褐飞虱基因Bph43。
K_11856768基因型鉴定结果如图4所示，IRGC8678样品检测到Hex荧光信号，基因型为G型，含有抗褐飞虱基因Bph43，其余64份水稻样品均检测到Fam荧光信号，基因型为A型，不含抗褐飞虱基因Bph43。
这些结果证明了本发明提供的分子标记及其引物组检测结果准确，且能有效区分不同等位基因型。
实施例4 Bph43基因SNP标记在分离群体基因型鉴定中的应用
1、生物材料
从9311/IRGC8678//9311的BC1F2群体中挑选200个单株进行Bph43基因型鉴定。
2、基因型检测
检测方法同实施例3。
3、结果分析
利用本发明的KASP标记K_11674982对9311/IRGC8678//9311的BC1F2群体中的200个单株进行基因型检测，结果表明，3种不同基因型T:T(Bph43纯合)、A:T(Bph43杂合)以及A:A(不含Bph43)的比为45:106:49，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2＝0.88<χ2 0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离。部分样品基因分型结果如图5所示。
利用本发明的KASP标记K_11775428对9311/IRGC8678//9311的BC1F2群体中的200个单株进行基因型检测，结果表明，3种不同基因型T:T(Bph43纯合)、C:T(Bph43杂合)以及C:C(不含Bph43)的比为45:106:49，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2＝0.88<χ2 0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离。部分样品基因分型结果如图6所示。
利用本发明的KASP标记K_11856768对9311/IRGC8678//9311的BC1F2群体中的200个单株进行基因型检测，结果表明，3种不同基因型G:G(Bph43纯合)、A:G(Bph43杂合)以及A:A(不含Bph43)的比为45:106:49，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2＝0.88<χ2 0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离。部分样品基因分型结果如图7所示。
以上结果表明本发明的KASP标记K_11674982、K_11775428和K_11856768对9311/IRGC8678//9311的BC1F2群体中的200个单株的Bph43基因型检测结果均一致(一一对应)，证明了本发明提供的3个KASP标记及其引物组均能有效且一致的检测Bph43基因型。
为了进一步明确经本发明KASP标记(K_11674982、K_11775428和K_11856768)检测的BC1F2材料基因型与其抗褐飞虱表型是否一致，各随机选择经本发明KASP标记(K_11674982、K_11775428和K_11856768)确定的20份Bph43纯合基因型、20份Bph43杂合基因型、以及20份不含Bph43的BC1F2材料。将这些BC1F2材料进行自交，得到对应的BC1F23材料，采用苗期集团法考察了这60份BC1F23材料的抗性表现(以这些BC1F23家系抗性级别代表BC1F2单株的抗褐飞虱表型)。结果表明这些BC1F2材料的基因型(由本发明KASP标记K_11674982、K_11775428和K_11856768检测结果体现)与其抗褐飞虱表型完全吻合，一致度为100％：
20份Bph43纯合基因型BC1F2材料平均抗性值在2.5左右，抗褐飞虱；20份Bph43杂合基因型BC1F2材料平均抗性值在4.1-4.5之间，对褐飞虱表现为杂合抗性；20份不含Bph43的BC1F2材料均对褐飞虱表现为感性，抗性值为9左右。
该结果进一步证明本发明开发的Bph43基因紧密连锁特有KASP标记与抗褐飞虱表型共分离，这些连锁的分子标记可应用于Bph43的分子标记辅助选择育种实践，培育含Bph43的抗褐飞虱水稻品种。同时也说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含抗褐飞虱基因Bph43的水稻材料，从而在较大程度上提高育种效率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 武汉大学深圳研究院 武汉大学 袁隆平农业高科技股份有限公司
<120> 一种用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph43的SNP标记及其应用
<130> KHP211126111.6
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc taacgctcga ctcaagaagg a 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat taacgctcga ctcaagaagg t 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctgtggtc gacttccttg 20
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tgcggacatg gtggtgagtt c 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgcggacatg gtggtgagtt t 41
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atacaggctc agagaagcgc 20
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tgcaaaatca attcgagaat tttcagaaa 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tgcaaaatca attcgagaat tttcagaag 49
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctaatgtgc ctcggtcaga 20

Claims (9)

1.一种引物组合，其特征在于，包括如下任意一种或多种：
i）如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物和如SEQ ID NO.3所示的通用引物；
ii）如SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物和如SEQ ID NO.6所示的通用引物；
iii）如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物和如SEQ ID NO.9所示的通用引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，i）中如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物分别携带不同的荧光标记；和/或，ii）中如SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物分别携带不同的荧光标记；和/或，iii）中如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物分别携带不同的荧光标记。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合。
4.权利要求1或2所述的引物组合，或权利要求3所述试剂盒在检测水稻抗褐飞虱基因Bph43中的应用。
5.权利要求1或2所述的引物组合，或权利要求3所述试剂盒在抗褐飞虱水稻材料的选育或水稻分子标记辅助育种中的应用。
6.一种检测水稻抗褐飞虱基因Bph43的方法，其特征在于，包括：
针对待测水稻，检测其基因组中SNP标记的多态性，根据检测结果判断所述待测水稻是否含有水稻抗褐飞虱基因Bph43；
所述SNP标记为如下任意一种或多种：
i）位于水稻11号染色体第11674982 bp处的位点，多态性为A/T；
ii）位于水稻11号染色体第11775428 bp处的位点，多态性为C/T；
iii）位于水稻11号染色体第11856768 bp处的位点，多态性为A/G。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当出现如下任意一种或多种情况时，判断所述待测水稻含有抗褐飞虱基因Bph43：
i）位于水稻11号染色体第11674982 bp处的SNP标记多态性为T；
ii）位于水稻11号染色体第11775428 bp处的SNP标记多态性为T；
iii）位于水稻11号染色体第11856768 bp处的SNP标记多态性为G。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括：
提取所述待测水稻的基因组DNA，采用权利要求1或2所述引物组合针对所述基因组DNA进行PCR扩增以检测所述SNP标记的多态性；根据检测结果判断所述待测水稻是否含有水稻抗褐飞虱基因Bph43。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：
94℃预变性3分钟；
94℃变性20秒；65℃-57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；
94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
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