CN111057786B - 与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的snp标记及应用 - Google Patents

与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的snp标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记及应用。所述SNP标记位于黄瓜基因组第4号染色体第20505510碱基位点，存在T/C多态性，利用一对引物即可对该位点及其上下游序列进行PCR扩增，通过基因分型可获得黄瓜种子采前发芽特性。本发明的SNP标记可应用于黄瓜种子采前发芽性状的鉴定，筛选黄瓜种子采前发芽抗性育种资源，构建分子标记辅助选择育种体系，定向转育抗性基因，创新、创制黄瓜抗种子采前发芽种质资源，加速黄瓜育种进程。

Description

与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记及应用
技术领域
本发明涉及黄瓜分子遗传领域，具体涉及一种与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记及其应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是重要的蔬菜作物之一，我国是世界上黄瓜种植面积最大的国家，优质的黄瓜种子是我国黄瓜生产栽培的重要保证。植物种子在发育完成后，不经过或经过极为短暂的休眠期即在母体植株上萌动发芽的现象被称为采前发芽(Pre-harvest Sprouting)，在大田作物中一般被称为穗发芽。黄瓜也存在采前发芽的现象。一般情况下，黄瓜种子采收是在果实充分成熟时进行，对于易发生采前发芽的黄瓜种子可能已经在瓜腔内萌动发芽。发生采前发芽的黄瓜种子，籽粒中储存的营养物质被水解消耗，种子千粒重下降。采收后种子发芽率严重降低、出苗不齐、根尖生长点坏死、幼苗畸形，种用价值严重降低。许多优质黄瓜新品种，因为采前发芽的问题，致使繁种质量不合格，严重限制黄瓜新品种的推广与应用。
黄瓜种子采前发芽会同时受到外界环境条件和内部因素的影响，但起决定作用的是内因，即遗传基因。该性状存在突出的基因型差异，适宜条件下，黄瓜种子在授粉后第25天左右发育完全，但尚不具备发芽能力；在授粉后40天左右种子成熟。易发芽黄瓜材料，在授粉后第34天左右，种子开始在瓜腔内萌动发芽；而不易采前发芽的黄瓜种子即使在适宜的环境中也不会发生采前发芽。国内外关于大田作物种子采前发芽有着较深入的研究报道，然而黄瓜种子采前发芽性状的深入研究仍未见报道。
分子标记辅助选择育种技术(Marker-assisted selection,MAS)的发展，为动植物育种带来了一场新的革命。利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记，在幼苗期即可对目的基因进行间接选择，不受环境、调查部位、发育时期、接种方法和显隐性的限制，克服了传统选种的局限性，提高了选择的准确性和效率，加速育种进程。单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphisms,SNP)具有数量多，分布广，适于快速、规模化筛查，等位基因频率容易估计，易于基因分型等优点，在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括转换(transition)、颠换(transversion)、缺失(deletion)和插入(insertion)。利用全基因组的SNP关联分析方法和候选基因的SNP方差分析的方法，可以找到与表型相关的SNP变异。
开发黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的分子标记，可应用于黄瓜抗采前发芽育种新材料筛选及抗性基因的定向转育，选育抗采前发芽新品种，提高黄瓜繁种质量，促进我国黄瓜产业发展。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记及其应用，该标记可为后续黄瓜种子采前发芽性状抗性基因的克隆与功能研究奠定基础，也可用于黄瓜抗采前发芽育种新材料的筛选及抗性基因的定向转育，加快遗传育种效率，提高种子质量。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记，位点为黄瓜参考基因组“Chinese Long”v2版第4号染色体第20505510碱基位点，命名为RPHS-1。RPHS-1位点所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中SEQ ID NO.1序列中第88碱基存在T/C多态性，TT基因型为黄瓜抗种子采前发芽，TC及CC基因型易发生采前发芽。
本发明的另一目的是提供了一种用于扩增与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP位点及其上、下游序列的引物对，所述引物对用于扩增如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明还提供了一种所述与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记的筛选方法，包括以下步骤：
a.以黄瓜种子采前发芽极端自交系Q12为母本，P60为父本，其中Q12极端抗采前发芽，P60极易发生采前发芽。父母本杂交获得F1，F1自交获得F2。
其中，Q12是通过“津研4号”与“四平刺瓜”杂交，后代经系谱法选育而成；P60为从河北省引进的黄瓜杂交种“早丰5号”经7代自交选育而成。
b.对F1及F2代群体在2016年和2017年分别进行采前发芽性状的表型鉴定。
c.基于F2分离群体，利用BSA法，选取F2群体中极端抗采前发芽和极端易采前发芽单株分别构建混池，将混池及父母本经重测序分析，找到与黄瓜种子采前发芽性状相关联的SNP和InDel标记。
d.利用多重PCR结合高通量测序技术，对步骤c获得的SNP和InDel位点进行基因分型，采用JoinMap 4.0软件对分型结果分别进行连锁分析，获得不同年份间黄瓜种子采前发芽性状的遗传连锁图。
e.利用MapQTL 6.0软件，结合F2群体表型数据，对黄瓜种子采前发芽性状进行QTL分析。从步骤c获得的SNP和InDel标记中检测到控制黄瓜种子采前发芽性状的关键SNP位点RPHS-1，该位点LOD值最大，2016年LOD值为15.27，可解释19.8％的表型变异；2017年LOD值为16.41，可解释21.2％的表型变异。
本发明再一目的是提供了一种检测与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记的方法，以黄瓜基因组DNA为模板，用所述SNP分子标记的引物对进行PCR扩增，包括以下步骤：
(1)提取待测黄瓜材料的基因组DNA。
(2)以待测黄瓜材料的基因组DNA为模板，将所述上游引物SEQ ID NO.2和下游引物SEQ ID NO.3，加入PCR反应体系，对待测黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增，扩增出含有RPHS-1的DNA片段。
作为优选，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的反应体系为25μL，具体如下：2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，33ng·μL-1上游引物2μL，33ng·μL-1下游引物2μL，50ng·μL-1模板DNA 2μL，ddH2O 6.5μL补齐。
进一步地，作为优选，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)通过扩增产物的测序，根据SNP标记基因型判断待鉴定品种的黄瓜种子采前发芽抗性。
本发明所述的与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记应用于黄瓜抗种子采前发芽性状的鉴定、分子标记辅助选择黄瓜抗种子采前发芽育种和选育黄瓜抗种子采前发芽种质资源。
相比于现有技术，本发明所述的具有以下有益效果：
(1)本发明使用的黄瓜自交系材料，经过表型鉴定，采前发芽性状表现稳定，其衍生的分离群体也经过2个年度的表型调查，可保证黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记的准确性和可重复性。
(2)本发明确定了与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP，该SNP对黄瓜种子采前发芽性状贡献率较高，鉴定黄瓜种子采前发芽性状的准确性可达到90％。
(3)本发明应用的SNP标记对黄瓜种子采前发芽性状进行筛选，SNP标记在分子标记辅助选育中操作更加准确、辅助性更好、效率更高，可在苗期对黄瓜植株进行鉴定，预测黄瓜材料采前发芽特性，提早采种时间，避免采前发芽造成巨大损失。使用该方法可以构建黄瓜种子采前发芽分子标记辅助选择育种体系，筛选、鉴定采前发芽抗性育种资源，定向转育抗性基因，加速育种进程。
(4)本发明所述的与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记易于在采前发芽性状的鉴定、辅助选择黄瓜抗种子采前发芽育种和选育黄瓜抗种子采前发芽育种资源中推广和应用。
附图说明
图1为黄瓜抗种子采前发芽表型与易采前发芽表型，为田间观察结果。
图2为黄瓜种子采前发芽性状分子标记RPHS-1在4号染色体上的遗传定位。其中，左侧为利用2016年种植的F2群体构建的遗传图，右侧为利用2017年F2群体构建的遗传图。
图3为4个黄瓜品种基因组DNA的电泳检测图。其中M为marker；1为“津冬科润99”；2为“津优335”；3为“津优336”；4为“津优409”。
图4为4个黄瓜品种PCR扩增产物电泳图。其中M为marker；CK为对照；1为“津冬科润99”；2为“津优335”；3为“津优336”；4为“津优409”。
图5为实施例2中4个黄瓜品种PCR扩增序列对比及SNP标记。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下结合实施例及附图对本发明做进一步描述，但不作为本发明的限定，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的分子标记的获得
1、黄瓜抗采前发芽自交系Q12，采前极易发芽自交系P60，及其衍生获得的F1和F2群体。为了获得年度间准确的采前发芽表型鉴定，获得准确的分析结果，群体在2016年和2017年分别种植。
群体种子分别于当年4月15日播种于天津科润黄瓜研究所武清试验场塑料拱棚中，田间常规管理，5月30日开始授粉，授粉前摘除已开花雌花，每株结瓜2条，F2群体单株编号并分别取新鲜嫩叶保存。种瓜挂牌标记授粉时间，授粉后45日及时采种，同时统计单瓜内种子采前发芽率。单株采前发芽率取同一植株上2条种瓜采前发芽率的平均值。
采前发芽率＝采前发芽种子数/种子总数×100％
2、黄瓜抗采前发芽基因的初步定位
利用BSA方法，选取F2群体中极端抗采前发芽30个单株，极端采前发芽30个单株，提取各单株基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测各DNA样品的纯度和完整性，通过Nanodrop检测DNA的纯度(OD260/280比值)，利用Qubit对DNA浓度进行精确定量，等量混合极端抗采前发芽单株DNA形成抗性混池R，等量混合极端采前发芽单株DNA易采前发芽混池S。
对双亲、混池R和混池S进行重测序分析，首选通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段，利用TruSeq Library Construction Kit进行建库。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illumina HiSeqTM PE150进行测序，测序得到的原始图像利用CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，最终得到原始数据36.832G。过滤含有带接头及低质量的reads，得到Cleandata 36.547G。
测序数据通过BWA软件比对到黄瓜参考基因组“Chinese Long”v2，采用GATK3.8软件的Unified Genotyper模块进行多个样本的SNP和InDel检测，使用Variant Filtration分别进行过滤。基于SNP和InDel分型的结果，筛选两个亲本间纯合差异的标记，共筛选出62504个多态性SNP及18646个InDel。以亲本为参考，分别计算子代在亲本间标记位点的SNP-index和InDel-index。采用滑窗分析，以1Mb为窗口，1kb为步长，计算各窗口中SNP-index的平均值反应子代SNP-index分布情况。将子代SNP-index作差，获得Δ(SNP-index)，Δ(SNP-index)绝对值越大，表示与性状连锁的可能性越大。进行1000次置换检验，选取95％置信水平作为筛选的阈值，以大于阈值的窗口作为候选区间，确定候选区域为4号染色体13.78-21.08Mb及5号染色体6.69-6.84Mb的区域。其中，4号染色体上覆盖7.3Mb片段内存在49个可能导致性状显著差异的SNP位点及11个InDel位点，5号染色体覆盖0.15Mb片段内存在可能2个导致性状显著差异的InDel位点。
3、黄瓜采前发芽抗性基因的精细定位
基于2016年和2017年2个年度的F2分离群体表型数据，利用多重PCR结合高通量测序技术，对候选区域内的60个SNP及13个InDel位点，在F2群体单株上进行验证。
参照黄瓜参考基因组“Chinese Long”v2序列，对候选区域内的60个SNP及13个InDel位点，设计多重PCR特异引物，以抓取SNP或InDel位点及其上、下游序列。分别以母本、父本、F1及各F2单株基因组DNA为模板，进行多重PCR扩增。多重PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切取目标片段条带，胶回收后经illumina HiSeq PE150进行测序。
测序数据通过SAMtools软件对SNP和InDel进行基因分型检测，最终候选区域内26个SNP位点和5个InDel位点获得准确分型。将各位点与母本基因型一致的记为A，与父本基因型一致的记为B，与F1基因型一致的记为H，利用Joinmap 4.0软件进行遗传连锁分析。2016年F2分离群体318株，2017年F2分离群体298株，分别构建遗传连锁图，如图2所示。
结合2016年、2017年F2群体表型数据，利用MapQTL 6.0软件对黄瓜种子采前发芽性状进行QTL分析。2016年种植的F2群体，使用IM作图分析，各位点LOD值均高于5.52，LOD值最高的SNP为第4号染色体第20505510碱基位点，命名为RPHS-1。使用自动选择辅因子的程序，选择RPHS-1作为辅因子进行MQM作图，检测到控制黄瓜种子采前发芽性状位点距离最大LOD值最近的SNP为RPHS-1，LOD值为15.27，可解释19.8％的表型变异。利用2017年种植的F2群体进行IM作图，所有标记LOD值均高于5.36，其中LOD值最大的为RPHS-1。使用自动选择辅因子的程序，选择RPHS-1作为辅因子进行MQM作图，检测到控制黄瓜种子采前发芽性状的位点为RPHS-1，其次为Chr4-19973782，中间存在2个空位。RPHS-1的LOD值为16.41，可解释21.2％表型变异。2个年度的数据分析结果表明，控制黄瓜种子采前发芽性状的关键SNP位点为RPHS-1，该位点存在T或C碱基多态性，TT基因型为黄瓜抗种子采前发芽，TC及CC基因型易发生采前发芽。
实施例2黄瓜种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记RPHS-1检测方法
为进一步验证上述方法的有效性，对黄瓜新品种“津冬科润99”、“津优335”、“津优336”和“津优409”分别采用上述方法进行检测。提取黄瓜幼嫩叶片基因组DNA，通过PCR扩增和测序分析，鉴定黄瓜品种RPHS-1标记的基因型，具体步骤如下：
1、DNA提取：
按照生工生物工程(上海)股份有限公司生产的“植物基因组DNA快速抽提试剂盒”的方法提取。
(1)取-80℃保存的叶片约0.1g放入1.5mL离心管中，同时加入2粒直径2mm的钢珠及400μL的65℃预热Buffer PCL，机械震荡1min，使叶片组织充分粉碎。
(2)加入8μL的β-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴45min至样品中完全裂解，期间每隔10min颠倒混匀以加速样品裂解。
(3)加入200μL的Buffer PP，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
(4)室温下以10000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5mL离心管中。
(5)加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。
(6)加入1mL的75％乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rpm离心2min，弃上清。再重复此步骤一次。
(7)开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。
(8)得到的DNA用100μL的TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2、DNA纯度和浓度检测
吸取上述提取的黄瓜基因组DNA溶液3μL，加入2μL的Loading Buffer，混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳，使用Bio凝胶成像系统观察检测结果，并拍照存档，结果如图3所示。
3、PCR扩增
取上述制得的黄瓜样品DNA溶液，进行PCR扩增，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PCR扩增反应体系为25μL，具体如下：
2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 6.5μL，33ng·μL-1上游引物2μL，33ng·μL-1下游引物2μL，50ng·μL-1模板DNA 2μL。
PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
4、PCR产物测序及分析
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。
扩增产物通过Sanger法测序，测序结果经比对如图5所示，在序列的第88碱基存在差异，其中，黄瓜新品种“津冬科润99”存在2种序列，如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所述，表明“津冬科润99”在该位点为杂合基因型，说明‘津冬科润99’的亲本之一为CC基因型，另一个亲本为TT基因型。
“津优335”扩增的序列如SEQ ID NO.6所示，“津优336”扩增的序列如SEQ ID NO.7所示，表明“津优335”和“津优336”在该位点均为CC基因型。
“津优409”的序列如SEQ ID NO.8所示，表明“津优409”在该位点为TT基因型。
实例3黄瓜抗种子采前发芽性状标记RPHS-1在F2群体中的验证
为了验证RPHS-1标记在F2群体中的符合率，选取2016年和2017年采前发芽率较高的单株(采前发芽率≥40％)及抗采前发芽单株(采前发芽率＝0)，比对单株表型及基因型，如表1所示，以验证标记的符合率。
黄瓜抗种子采前发芽性状标记验证的具体步骤及实验条件与实施例1相同。
表1数据显示，2016年共筛选出119个F2单株，其中纯合抗采前发芽基因型TT的单株43个，纯合易采前发芽基因型CC单株68个，杂合基因型单株8个，共存在12个基因型与表型不符的单株，99个基因型与表型相符，符合率为89.92％。
2017年筛选出126个单株，其中TT基因型单株31个，CC基因型83个，TC基因型12个，共存在8个基因型与表型不符的单株，118个基因型与表型相符，符合率为93.65％。上述结果表明，该标记在F2群体中的符合较高。
表1 RPHS-1标记在F2群体中的验证
Figure BDA0002377587040000111
Figure BDA0002377587040000121
Figure BDA0002377587040000131
Figure BDA0002377587040000141
以上结果说明此方法具有可靠性和广泛的适用性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津科润农业科技股份有限公司
<120> 黄瓜抗种子采前发芽性状连锁的SNP标记与InDel标记及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
aatgtgtttc tctcttgaca acagaataat aaagccactc aagatgctac gatctgttat 60
tttgacagga ttgttgtacc ttttttgtgt aaaagttaag atagacatct ttaatgttga 120
tccactccat aaaatagtca ggaagtttca tcttcgacac gctacattga tgtgggacct 180
gagtttttat atcccagttg ccactggtag aagtaaagag agaa 224
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ttctctcttt acttctacca gtgg 24
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<211> 224
<212> DNA
<213> Cucumis sativus
<400> 4
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tttgacagga ttgttgtacc ttttttgcgt aaaagttaag atagacatct ttaatgttga 120
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gagtttttat atcccagttg ccactggtag aagtaaagag agaa 224
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<211> 224
<212> DNA
<213> Cucumis sativus
<400> 5
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<210> 6
<211> 224
<212> DNA
<213> Cucumis sativus
<400> 6
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<211> 224
<212> DNA
<213> Cucumis sativus
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Claims (1)

1.一种检测与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记的方法，其特征在于：该标记位于黄瓜基因组第4号染色体第20505510碱基位点，命名为RPHS-1；RPHS-1位点所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中SEQ ID NO.1序列中第88碱基存在T/C多态性，TT基因型为黄瓜抗种子采前发芽，TC及CC基因型易发生采前发芽，
所述检测与黄瓜抗种子采前发芽性状紧密连锁的SNP标记的方法包括以下步骤，
（1）提取待测黄瓜材料的基因组DNA；
（2）以待测黄瓜材料的基因组DNA为模板，将所述上游引物SEQ ID NO.2和下游引物SEQID NO.3，加入PCR反应体系，对待测黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增，扩增出含有RPHS-1的DNA片段；
（3）对扩增产物进行测序获得基因分型结果，判断待测黄瓜材料的种子采前发芽抗性。
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Inheritance and QTL mapping of cucumber mosaic virus resistance in cucumber (Cucumis Sativus. L);Lixue Shi et al.;《PLOS ONE》;20180618;第e0200571篇 *
黄瓜种子采前发芽性状的数量遗传分析;曹明明等;《中国蔬菜》(第01期);第40-44页 *
黄瓜种子采前发芽的研究进展;曹明明等;《天津农业科学》(第02期);第127-130页 *

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